人类α-actin启动子真核表达载体的构建及应用

利用PCR技术克隆了人类α-actin基因的启动子（约450bp），尝试用去掉启动子的pEGFP—N1作为框架结构，成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-α-actin—P。应用Lipofectamine 2000将所构建的pEGFP-N1-α-actin-P转染入小鼠ES细胞。通过比较，发现在本实验室条件下，质粒DNA浓度以3．0～5．0μg／mL，转染时间约在2～3h最佳。200μg／mL的G418较适宜于靶细胞的转染与筛选。得到表达心肌a—actin和GFP的小鼠ES细胞，基本维持小鼠ES细胞的形态。PCNA染色结果表明，转染后的小鼠ES细胞具有增殖能力。α—actin抗体免疫组化染色结果表明，转染后细胞表达α-actin和GFP，揭示构建的真核表达载体pEGFP-N1-α-actin-P转染小鼠ES细胞，可能促进其向心肌细胞分化并对其筛选。

血痕Chelex 100抽提DNA用于人类TNF-α基因启动子区SNP分型

建立快速、简便的血样本采集及DNA抽提方法,可用于大规模的分子流行病学调查及群体遗传学研究。采用无菌纱布为载体取血,Chelex100快速抽提DNA,用TaqManMGB探针对人类TNF-α基因启动子区-857(C/T)位点进行SNP分型。344份血样均得到明确的分型结果,获得的荧光信号强,本底低。深圳地区汉族群体-857位点基因型频率分别为:cc为0.78,ct为0.21,tt为0.01。血痕Chelex100抽提DNA为大规模血样本的采集,DNA的抽提提供了有效的手段。

人类α-actin启动子真核表达载体的构建

目的利用PCR技术克隆了人类-αactin基因的启动子(约450 bp)。方法将PCR产物连接到pMD-18T载体上,酶切鉴定后测序,并进行软件分析。结果与结论序列分析表明,扩增片段虽然与GenBank里登陆的序列同源性仅为72%,但包含有完整的启动子元件和转录专一调节因子相应的识别序列。用去掉启动子的pEGFP-N1作为框架结构,尝试构建真核表达载体,并获得了含人类心肌-αactin启动子的真核表达载体pEGFP-N1--αactin-P。

人类白细胞抗原-DRB1基因启动子区序列多态性与肺结核的相关性分析

目的探讨中国北方地区人群人类白细胞抗原（HLA）-DRB1基因启动子区序列多态性与肺结核的相关性。方法北方汉族肺结核患者97例为肺结核组，北方汉族健康人62例为对照组，采用PCR-SSP法对2组的HLA-DRB1基因启动子区进行PCR扩增，启动子区扩增产物直接测序。结果肺结核组和对照组的HLA-DRB1基因启动子区序列完全一致；对照组启动子区序列与数据库检索的序列比较有3个突变点：-26位的T被C替代，-49位的C被G替代，-78位的C被G替代。结论中国北方地区人群HLA-DRB1基因启动子区序列具有多态性，但此多态性与肺结核的发病没有相关性。

IL-10、IL-4及其受体启动子在人类单纯疱疹病毒1型激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒复制过程中的启动活性分析

目的:分离和鉴定人类IL-10、IL-10受体(IL-10Rα)、IL-4及其受体IL-4Rα启动子序列,并分析IL-10、IL-4以及其受体的启动子在人类单纯疱疹病毒1型(HSV-1)激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)过程中的启动活性。方法:以人类基因组DNA为模板,PCR扩增IL-10、IL-10Rα、IL-4Rα启动子区序列,并分别克隆载入pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的上游。进一步将上述构建的重组质粒与本室保存的含IL-4启动子重组质粒分别转染HSV-1感染的BCBL-1细胞,并作Luciferase活性检测。结果:分离了IL-10、IL-10Rα和IL-4Rα的启动子区域序列,并成功克隆了含启动子序列重组报告质粒;HSV-1感染的BCBL-1细胞在进一步转染了IL-10、IL-10Rα、IL-4和IL-4Rα启动子重组报告质粒后,其Luciferase值与相应的对照比较显著升高(P<0.05)。结论:在BCBL-1细胞中,HSV-1可通过直接激活IL-10、IL-4以及相应受体的启动子来上调它们的表达;在HSV-1感染的BCBL-1细胞中,IL-10和IL-4可能对KSHV的裂解复制起到促进作用。

人类BMP-2基因启动子位置的预测

目的:预测人类BMP-2基因启动子位置和可能的转录因子结合位点。方法:从Genebank中获得BMP-2的全长编码基因,利用firstEF,footprinter和Consite软件对人类BMP-2基因,小鼠BMP-2基因,鸡BMP-2基因的5’侧翼序列进行生物信息学分析。结果:用firstEF软件预测BMP-2基因的启动子区可能位于(-513..57),用footprinter软件证实其位于BMP-2基因的进化保守区,用Consite软件预测可能的转录因子结合位点。结论:(-513..57)为最可能的启动子区。

基于单核苷酸统计和支持向量机集成的人类基因启动子识别

为高效地判别人类基因启动子,提出了一种基于单核苷酸统计和支持向量机集成的人类基因启动子识别算法。首先通过基因单核苷酸统计,从而将一个基因数据集分为C偏好和G偏好两个子集;然后分别对这两个子集提取DNA刚性特征、词频统计特征和Cp G岛特征;最后采用多个支持向量机(SVM)集成的方式来学习这三种特征,并讨论了三种集成方式,包括单层SVM集成、双层SVM集成和级联SVM集成。实验结果表明所提算法能够提高人类基因启动子识别的敏感性和特异性,其中双层SVM集成的敏感性达到79.51%,且级联SVM集成的特异性高达84.58%。

基于支持向量机(SVMs)的人类核心启动子的识别

本文采用基于支持向量机(SVM s)的方法预测了4类含有核心启动子元件的启动子和含有CCAAT-box的启动子。4类核心启动子元件分别是DPE,BRE,TATA-box和Inr。特征提取采用基于位点权重矩阵(PWM s)的程序Promoter C lassifier进行。本文预测结果的敏感度,确定度,以及相关系数均高于三种启动子预测方法(PromoterInspec-tor(PI),Promoter 2.0 Pred iction(PP)和Neural Network Promoter Pred iction(NNPP),使敏感度和确定度同时高于0.84,其中TATA-box预测结果可使敏感度和确定度同时高于0.95。

HHV-8 ORF50启动子区序列分离、鉴定及在293细胞中启动活性分析

目的:分离和鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF50基因上游启动子区序列,评价其在293细胞中启动活性。方法:以佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增HHV-8 ORF50启动子区序列,克隆进pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因上游多克隆位点,分别构建含正反双向ORF50启动子重组报告质粒,并分别转染293细胞,作Lu-ciferase活性检测,计算相对Luciferase活性单位(RLU)。结果:①克隆的HHV-8 ORF50启动子区序列长655碱基(bp),含多个潜在推测AP1、SP1和ERE等转录因子结合序列;②ORF50启动子与正常pGL-3基本载体相比,其RLU增加了26.3倍;③TPA刺激后ORF50启动子与刺激前相比启动活性增加了4.1倍。结论:HHV-8 ORF50启动子区序列在293细胞中具有较强的启动活性;TPA可以作为一有效的阳性对照刺激物用于进一步鉴定ORF50启动子特性。

hOPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠模型的建立

目的:建立带有人类骨保护素OPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠模型,为OPG体内转录水平的表达调控研究和药物筛选创造条件。方法:将克隆到的人类OPG基因5′端上游6.0kb非翻译序列作为启动子,大肠杆菌编码β半乳糖苷酶的LacZ基因作为报告基因,构建表达载体pCINeoOPGLacZ。经显微操作注射到受精卵原核中,经PCR以及Southern印迹杂交鉴定转基因阳性小鼠;用RTPCR分析LacZ在组织中的表达;利用邻硝基苯βD半乳吡喃糖苷(ONPG)作为底物反应后比色分析组织中的β半乳糖苷酶活性。结果:构建完成的表达载体pCINeoOPGLacZ质粒经酶切和测序鉴定序列正确,线性化后显微注射。PCR以及Southern印迹杂交鉴定获得了10只转基因小鼠(Founders),经交配繁育,建立了5个转基因小鼠系,RTPCR分析表明其中一个系小鼠组织中表达LacZ基因,与内源OPG表达模式一致,组织中可以广泛检测到相应的β半乳糖苷酶活性。结论:成功建立了人类OPG基因启动子驱动报告基因LacZ的转基因小鼠,为体内研究OPG转录水平的表达及药物筛选提供了理想的动物模型。

采用DNA片段编辑技术反转CTCF结合位点改变基因组拓扑结构和增强子与启动子功能

人类的祖先很早就观察到生物性状的遗传现象，但是直到19世纪60年代孟德尔发现遗传因子的分〈br〉 离定律和自由组合定律，遗传学才真正建立并快速发展起来。尽管人类很快有了基因的概念，并认识了核酸和蛋白质，但直到1953年沃森和克里克阐明了DNA的双螺旋结构之后，人类对基因才有了本质的认识，从而开启了分子遗传学时代。随着人类基因组计划测序工作的完成以及最近大规模测序技术的突破，越来越多的研究发现很多遗传疾病相关位点不仅位于启动子和基因编码区，而且也大量地存在于调控组织发育基因表达的增强子中。更多的遗传疾病相关位点则位于功能未知的基因组区域。近年研究发现这些遗传疾病相关位点可能与三维基因组（3D genome）息息相关并通过染色体高级拓扑架构（Higher-order topological chromosome architec-ture）起作用。

E-box元件修饰端粒酶核心启动子序列及体外转录活性分析(英文)

人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实.然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子上的-34位E-box元件与该启动子的肿瘤靶向转录活性有关.为进一步探索核心hTERT启动子序列3′端富余E-box元件是否能提高启动子的肿瘤靶向转录能力,用化学合成方法在野生型hTERT(WT-hTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268bp～-10bp)的3′端接入3个E-box序列,构建成修饰型hTERT(Mod-hTERT)启动子.然后,分别用WT-hTERT和Mod-hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS、以及原代培养人成纤维细胞(PHF)中表达.结果表明,在Mod-hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及PHF细胞组中没有观测到EGFP的表达;在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ和SGC7901细胞株中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WT-hTERT启动子组(P<0.01);而在端粒酶阴性的U2OS细胞组中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性则低于WT-hTERT启动子组(P<0.01);在PHF细胞组中,Mod-hTERT启动子组与WT-hTERT启动子组的荧光素酶活性差异不显著(P>0.05).研究提示,在3′端增加E-box元件可以提高核心hTERT启动子序列的肿瘤靶向转录活性.

PRPS2基因启动子区的单核苷酸多态性(英文)

人类基因组变异主要以单核苷酸多态性 (SNPs)为主 .采用多荧光标记的PCR单链构象多态性分析法 (MF PCR SSCP)对磷酰核糖焦磷酸合成酶亚基Ⅱ (PRPS2 )基因启动子区的序列进行了SNP的筛选 ,对筛选到的阳性片段进行序列分析以确定SNP的类型及位置 .在 1 5kb的启动子区发现了 2个SNP (- 10 79t c ,- 1110a g) .研究结果为PRPS2基因SNPs的数据库提供了新的信息 .

人乙酰肝素酶核心启动子的扩增及序列分析

目的:扩增乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)基因启动子核心片段,并进行序列分析。方法:提取人类基因组DNA,PCR扩增HPSE基因启动子,T-A克隆、酶切鉴定,然后进行测序比对,分析其中转录因子结合位点。结果:从人类基因组DNA中扩增出HPSE基因启动子片段,酶切鉴定与预期结果吻合,长度为561bp,该启动子碱基序列与数据库GenBank完全一致,并含有3个Sp1、4个ERE和2个ERG1转录因子结合位点。结论:成功克隆了HPSE核心启动子,并含有维持HPSE转录活性的转录因子结合位点,为后续研究奠定了基础。

DNA修复相关基因启动子甲基化和肿瘤化疗耐药的进展

肿瘤细胞DNA修复能力与化疗药物敏感性密切相关,而DNA启动子甲基化可导致DNA修复相关基因转录失活、基因沉默、蛋白表达量改变等影响DNA的修复能力,继而导致肿瘤对化疗药物的固有性或获得性耐药。该文着重阐述DNA修复相关基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、人类mut1同源物(hMLH1)和范科尼贫血互补基团F(FANCF)启动子甲基化与肿瘤化疗耐药之间的关系。

人CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T→C突变与复发性流产

目的:探讨人类CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T→C突变与复发性流产的关系,以期为预防和治疗该病易感人群提供新思路。方法:采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,针对CYP17基因启动子5'上游-34碱基处的多态性,检测96例患有原因不明复发性流产患者(病例组)和102例有生育史的健康女性(对照组),并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进一步验证,且采用测序方法证实实验结果。结果:病例组和对照组CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T和C的分布差异有统计学意义(χ2=8.188,P<0.05),CYP17基因各基因型分布差异有统计学意义(χ2=10.096,P<0.05)。杂合突变(T/C)基因型和纯合突变(C/C)基因型患复发性流产的危险度较野生(T/T)基因型分别提高了0.424和0.271倍。结论:人CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T→C突变与中国东北地区人群复发性流产有关,C等位基因可能是复发性流产的遗传易感因素之一。

L人晶体膜内蛋白MP19基因(LIM2)启动子上一个晶体特异顺式元件的鉴定(英文)

使用重叠和变异的寡核苷酸作为探针 ,凝胶迁移分析和竞争实验分析了LIM2转录起始位点上游 - 4 7至- 32的区域 ,与其高度亲和结合的一个蛋白复合体看来仅仅结合到这个DNA双链区域的“敏感”位点。这个位点的序列由 4个G核苷 ,接着 7个其他核苷酸 (AACCTAA)及连着另外 4个G核苷组成 ,即GGGGAACCTAAGGGG ;我们称其为Hsu元件。使用含有这个元件或相应的变异元件所构建的LIM2基因启动子 CAT质粒的活性分析表明Hsu元件是位于LIM2基因启动子之内 ,它是LIM2基因表达所必须的。结合到Hsu元件的反式因子存于晶体发育期间 ,看来是晶体特异性的。由于LIM2基因启动子并不包含一个经典的TATA盒 ,这个Hsu元件可能充当RNA复制酶复合体结合的位点。

不同启动子对HA-VP2重组杆状病毒蛋白表达的影响

为比较不同启动子对传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白表达的影响,择优表达体系。本研究将添加了表位附加标记HA-TAG的IBDV-VP2基因整合至含有CMV、CBA和EF1α启动子的重组转移载体中,构建HA-VP2重组杆状病毒,并通过侵染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)分析蛋白表达水平,以确定最优启动子。用Gel-Pro analyzer 4.5软件分析Western blotting条带。结果表明,含有CMV、CBA及EF1α启动子的重组杆状病毒所表达的HA-VP2蛋白强度分别为270.61、290.26及83.45,且各启动子活性差异显著(P<0.05),其中CMV与CBA启动子的活性相近能够较高效率地表达HA-VP2蛋白,但EF1α启动子活性较以上2种启动子活性较低。本研究通过比较分析不同启动子对蛋白表达水平的影响,以此择优表达体系,为禽类基因工程疫苗的发展提供新思路。

c-Jun和c-Fos及其与人类肿瘤

Jun蛋白和Fos蛋白组成的二聚体复合物AP-1是细胞核内重要的转录因子,细胞的外界刺激信号从上游的信号通路传递至AP-1,并激活AP-1的功能,进而调节其下游一系列基因启动子区域含有AP-1结合位点靶基因的转录表达,使细胞对外界刺激作出适应性的反应。本文综述了jun和fos基因的结构及其与细胞增殖、分化、凋亡以及与肿瘤发生发展关系的研究进展。

人类疱疹病毒8型基因甲基化的研究进展

DNA甲基化是目前最明确的肿瘤表观遗传学机制,近年来研究发现基因启动子区CpG岛甲基化异常,是许多恶性肿瘤发生发展的重要原因。甲基化通常与转录抑制有关。甲基化的CpG岛可产生阳性信号导致相关基因沉默。即基因高甲基化状态则抑制基因的表达,低甲基化状态则促进基因的表达。近年研究表明,人类疱疹病毒8型(HHV-8)的ORF50基因及ORF73基因甲基化与病毒由潜伏期至裂解期的转换密切关联。另外,甲基化过程是可逆的,可受药物及组蛋白甲基化的影响,为HHV-8致病机制提供了新的研究线索。