检验人精浆特异蛋白P_(30)免疫胶体金试剂条的研制

目的制备用于检验人精浆特异蛋白P30—主要是来自法医学案件的免疫胶体金层析试剂条。方法选取针对不同抗原决定簇的抗P30单克隆抗体细胞株,并制备其小鼠腹水,分离纯化单克隆抗体。制备胶体金并以纯化抗体包被,制成免疫胶体金,以免疫胶体金浸泡玻璃纤维。选取适宜的硝酸纤维素膜并于其上不同位置以未金标的另一株P30单克隆抗体和羊抗鼠IgG包被。搭建试剂条并检测其灵敏度和特异性。结果所制成的试剂条灵敏度至少可达4ng/ml;对6人份混合的人精液物质在稀释20万倍后仍出阳性结果,且无非特异性反应。结论检验人精浆特异蛋白P30的免疫胶体金试剂条可对嫌疑人精物质做出排查,有利于法医物证检验。

人精浆免疫抑制机制的实验研究

本文从人精浆(Human Seminal plasma,HSP)对小鼠脾T淋巴细胞IL-2产生,活化小鼠脾T淋巴细胞IL-2受体(IL-2R)表达和IL-2R与重组IL-2(rIL-2)结合等几个方面研究了HSP抑制小鼠脾T淋巴细胞增殖的机制。根据实验结果表明,HSP抑制小鼠脾T淋巴细胞增殖的机制是抑制了脾T淋巴细胞IL-2 R表达。

抗人精浆蛋白单抗重链Fd段基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白 m Ab重链 Fd段基因 ,并将其转染到 He L a细胞进行表达 .方法 从分泌抗人精浆蛋白 m Ab的杂交瘤细胞系 E4 B7中提取总 RNA,用 RT- PCR法获取重链 Fd段 c DNA.将其克隆入真核表达载体 pc D-NA3,用脂质体转染法转染 He L a细胞 ,并用免疫荧光染色方法检测重链 Fd段的表达 .结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠m Ab杂交瘤细胞系 E4 B7中克隆出了重链 Fd段基因 ,序列测定表明 ,VH 与鼠免疫球蛋白 MUSIGHAEI同源性最高 .将含重链 Fd段基因的真核表达载体 pc DNA3- E4 B7Fd中转染He L a细胞后 ,在 He L a细胞中检测到了重链 Fd段的表达 .结论 获得了序列正确的重链 Fd段基因 ,它在 He L a细胞中可以成功地表达 ,为进一步构建和表达 Fab奠定基础 .

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（ｍＡｂ）κ链基因，并将其转染到ＨｅＬａ细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白ｍＡｂ的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ法获取κ链ｃＤＮＡ。将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，用脂质体转染法转染ＨｅＬａ细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠ｍＡｂ杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中克隆了κ链基因。序列测定表明，Ｖκ属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－Ｅ４Ｂ７κ转染ＨｅＬａ细胞后，在ＨｅＬａ细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在ＨｅＬａ细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Ｆａｂ段打下了良好基础。

人精浆免疫抑制作用对小鼠巨噬细胞的影响

SF_1是正常人精浆经Sephadex G100分离所得的第一组分。采用体内及体外途径,将SF_1作用于Balb/c小鼠巨噬细胞,实验证明SF_1对小鼠两种来源的巨噬细胞—腹腔巨噬细胞(PEC—Mφ)及骨髓细胞经体外培养衍生的巨噬细胞(BM—Mφ)均有明显的抑制作用,表现为Mφ吞噬抗体致敏羊红细胞(EA)的吞噬率及吞噬指数(PI)均明显低于对照组(P<0.01),並且抑制程度随SF_1浓度升高而逐渐明显;SF_1作用后的Mφ表面Fc受体及C_3b受体也明显受抑,表现为EA—花环及Yc—花环形成率降低(P<0.01)。此外,SF_1作用后的Mφ还表现表面皱褶减少及胞内空泡增加等超微结构的形态学改变。

人精浆酸性磷酸酶对小鼠T淋巴细胞产生IL-2的影响

本文研究了从正常人精浆中分离纯化的酸性磷酸酶（ACP）对BALB／c小鼠脾脏细胞来源的T淋巴细胞产生IL-2的影响。本文采用MTT生物学测定法测IL-2活性。实验证明：人糖浆ACP对小鼠T淋巴细胞产生IL-2有明显的抑制作用（P＜0．05），并且抑制作用随ACP剂量的增加而增强。这说明了精浆中大量ACP是构成精浆免疫抑制功能的重要组成成份之一。

人精原干细胞分离、培养与鉴定

目的 :分离、鉴定和培养人精原干细胞(SSC),以获得纯化、富集的人SSC并为其研究与应用奠定基础。方法:通过免疫荧光方法检测睾丸组织中CD90表达情况;应用两步酶消化和差速贴壁法分离人睾丸生精细胞,以CD90为人SSC标志,用免疫磁珠分选技术(MACS)对人睾丸生精细胞进行分选,并利用RT-PCR和免疫细胞化学对分选所得CD90+细胞进行鉴定;同时用SG培养液将CD90+细胞与支持细胞进行体外共培养。结果:MACS分选所得CD90+细胞大小、形态特征较为均一,RT-PCR检测其表达人SSC标记性基因,免疫荧光检测其高表达人SSC特异标记GFRA-1、GPR125和UCHL-1,阳性率达90.5%,其在SG培养液中与支持细胞共培养14 d后仍可保持良好活性。结论:CD90可作为人SSC特异性标志之一,结合差速贴壁和MACS可高效分选人SSC,分选所得SSC可在SG培养液中进行体外培养。

人精浆免疫抑制因子SF_1对血清补体的影响

SF_1是正常人精浆经Sephadex G 100分离后得到的第一组分。将正常人血清和杂种小鼠混合血清作为补体来源,每份血清均以SF_1处理为实验组,并设不加SF_1的自身对照组,从下列实验中分别观察SF_1对补体系统的影响:1.CH_(50)试验证明,SF_1能抑制人血清中总补体活性(P<0.01);2.SF_1能抑制人血清中补体的溶血作用,并随血清中加入SF_1剂量的增加而抑制作用增强;3.利用YC 花环试验证实SF_1可抑制补体替代途径的激活;4.SF_1不影响用单向琼脂扩散试验测定中C_3、C_4的量,证明SF_1没有影响C_3、C_4的抗原性。上述实验结果提示:SF_1在体外实验中能抑制补体的活性,表现于对补体经典途径和替代途径激活的抑制。

抗人精浆蛋白抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建编码抗人精浆蛋白抗体Fab基因的表达载体 ,并在大肠杆菌中进行表达。方法 :从克隆载体pUC19 К和pBluescriptKS(M13 ) Fd中 ,酶切获得抗人精浆蛋白单克隆抗体 (mAb)Fd基因和К链基因。然后将Fd和К链基因重组到Fab表达载体pComb3中 ,构建抗人精浆蛋白Fab基因的重组表达载体pComb3 Fab ,并在XL1 Blue菌中表达。结果 :经重组表达载体转化的XL1 Blue菌株可表达Fab基因。Westernblot和免疫细胞化学分析表明 ,表达产物Fab具有特异性结合精浆蛋白的活性。结论 :抗人精浆蛋白Fab基因成功地获得 ,为进一步将其与抗肿瘤药物偶联用于前列腺癌的导向治疗创造了条件。表达为构建其它基因工程抗体提供了基础。

人精浆免疫抑制因子对B淋巴细胞产生抗体的影响

本文采用体内实验的方法,观察正常人精浆经sephadex G-100分离而得的第一组份(SF_1)对Balb/c小鼠B淋巴细胞的影响。实验采用SF_1腹腔注射为实验组,以生理盐水作对照组,四天后给予同量抗原绵羊红细胞(SRBC)刺激,在SRBC免疫后第三天、第四天,第五天、第六天分别测定这二组小鼠的溶血空斑数和血清中的抗SRBC抗体的凝集效价。实验结果发现:实验组小鼠的溶血空斑数均明显低于对照组(P<0.01),实验组小鼠血清中的特异抗SRBC抗体的凝集效价也均低于对照组(P<0.05)。结果表明:正常人精浆提取物SF_1在异种小鼠体内有明显抑制B淋巴细胞对于抗原刺激转化为浆细胞的功能,同时也抑制了特异性抗体的产生。

人精浆SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳谱型研究

本文采用SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(SDS-PAGGE)研究了102例中国正常男子精浆蛋白的电泳谱型,得到了具有精液特征性的,可与人阴道液、唾液、初乳及血清进行鉴别的人精浆蛋白电泳谱型,并可作为精斑的确证。另发现一种-83kd 变异型。频率为8. 82±2. 81%。提高了精斑的个人识别机率,在实际应用中取得了初步成效。

猪卵透明带单克隆抗体体外对人精卵结合的影响

在于观察猪卵透明带单克隆抗体对人精卵结合的影响。采用体外人精卵结合试验方法。结果提示当１７Ｄ＿３单抗按１：２、１：１０、１：２０、１：３０稀释时，抑制率分别为９９．３％、９４％、７５．７％和４６．７％，其抑制人精卵结合的生物效应呈剂量相关。结论为猪卵透明带单克隆抗体对人精卵结合有抑制作用。

抗人精浆蛋白McAb的制备及其特性研究

本文报道用杂交瘤技术建立了２株分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的细胞株Ｄ１和Ｃ１２。Ｄ１株分泌的抗体为ＩｇＭ，Ｃ１２株为ＩｇＧ３。这两株均能与正常人精浆和无精子症患者的精浆产生特异性免疫反应。Ｄ１株单抗具有补体依赖性制动人精子的作用，间接免疫荧光试验表明，它能结合到人精子颈部和顶体后区。这充分说明２株单抗是特异性抗人精浆的，Ｄ１是精子制动抗体，其相应的精子抗原属于精子外套抗原成分之一。

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的 在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法 在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果 表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论 获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv 。

抗人精浆特异蛋白血清的制备与纯化

本文报导检验混合斑中精斑ABO 血型所用抗人精浆特异蛋白(anti-human seminal peculiarprotein,ASPP)血清的制备及用溴化氢活化琼脂糖4B 为载体的亲和层析纯化抗血清方法,并指出纯化时的最佳条件。该血清可准确地分离混合斑中精斑的ABO 血型。

抗人精浆磷脂酶A2单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的 :制备并鉴定人精浆磷脂酶A2 (PLA2 )的单克隆抗体 (McAb)。 方法 :通过PEG沉淀、SephacrylS 30 0柱层析、DEAE SephadexA 2 5柱层析及羟基磷灰石 (HA)柱层析分离纯化人精浆中的PLA2 ,并以SDS PAGE鉴定其分子量及蛋白浓度 ;免疫BALB/C小鼠制备抗PLA2McAb ,通过ELISA技术、Western Blot方法鉴定其敏感性及特异性。 结果 :从精浆中提纯的PLA2的相对分子质量 (Mr)约为 3490 0 ,纯化倍数约为 2 4 5倍。制备的McAb经鼠Ig亚类分析为IgMKappa型 ,敏感性可达 1∶5 6～ 1∶5 8,Western Blot证明其特异结合的抗原即为PLA2蛋白酶。结论 :Mr为 3490 0的PLA2可能为一种新型PLA2。

抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单克隆抗体Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,用逆转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)克隆Fd段和κ链基因 ;构建到噬粒pComb3中 ;并用ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析证明表达的Fab段特异性结合人精浆蛋白。结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞系E4B7中克隆出了重链Fd段和κ链基因 ,经序列测定表明 ,Vκ 属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族 ,VH与鼠免疫球蛋白MUSIGHAEI同源性最高。将该Fd和κ链基因克隆到表达载体pComb3中 ,在大肠杆菌中获得了表达。结论 ELISA、Westernblotting和免疫细胞化学分析表明 。

用亲和层析法纯化人精浆蛋白

【目的】用亲和层析法从增生的前列腺组织中纯化人精浆蛋白(-γseminoprotein,-γsm)。【方法】采用超声波粉碎、NP-40提取与两种免疫亲和层析相结合[抗人精浆蛋白单抗(E4B7mAb)亲和层析和蛋白A亲和层析]的新提纯方案,获得了高纯度-γsm抗原。【结果】所纯化的-γsm蛋白经ELISA双抗夹心法和免疫印迹分析检测证明,用此法从增生的前列腺组织中分离到-γsm抗原,而且纯化的-γsm具有生物活性。【结论】这种方法的建立将为分离-γsm抗原提供一种有效途径,为抗精浆蛋白基因工程抗体的研究提供良好的抗原保证。

人精浆葡萄糖浓度与精子密度和活动度的关系

为了解精浆中的葡萄糖浓度是否与精液中的精子密度或活动度间存在某种相关。采用葡萄糖氧化酶法测定精浆葡萄糖浓度,并分析该浓度与精液中的精子密度和精子活动度间可能存在的联系。结果见无精子症精液葡萄糖浓度0.883±0.759mmol/L,比正常精子密度精液高出一倍,差异具统计学显著性(P=0.0215)。精子活动度与精浆葡萄糖浓度间似乎存在弱的正相关(r=0.2731,P=0.0729)。结果提示在体内转运阶段及体外液化过程中,精子消耗葡萄糖,精子活动度对环境中的葡萄糖浓度可能有一定程度上的依赖性。

抗人精单克隆抗体A_(10)C_6特异性的研究

用作者实验室生产的单克隆抗体A_(10)C_6建立了反向间接血液试验(RPHA)方法。经检测人精液标本,发现其对人精液有100％的阳性反应,而对猪精液、牛精液、人乳汁、人阴道分泌物、人唾液等均呈阴性反应,证明了它对人精液较高的特异性。RPHA方法简便、灵敏、可靠,所用检材量少,有较高的应用价值,特别适于基层应用。