人糖皮质激素受体GR_α基因表达载体的构建和GR_α蛋白的表达

目前检测糖皮质激素受体采用的是放射配体法[1,2],存在着放射污染、实验结果不稳定、需血量大(6～7 ml)等问题,因此建立一种简便、无放射污染、需血量少、易于推广的检测方法显得很重要.而ELISA检测法基本符合以上条件.要建立ELISA检测法,首先须表达糖皮质激素受体蛋白.人糖皮质激素受体(hGR)有hGRα和hGRβ两种不同的蛋白,hGRα可与糖皮质激素结合而发挥生理作用,而hGRβ不能与糖皮质激素结合,因此无生理活性[3,4].目前hGRα蛋白的表达多采用真核细胞表达,此种表达方式虽能保持蛋白的天然空间结构而具有生理活性,但要大量制备并纯化却存在困难.本研究拟构建可诱导的hGRα基因表达载体,并大量表达hGRα蛋白,为hGRα ELISA检测法的建立奠定基础.

人糖皮质激素β受体基因正、反义重组逆病毒载体构建

为研究人糖皮质激素受体hGRβ亚型的功能及其作用机制,用L PCR方法从人胚脑表达文库内扩增hGRβ基因全长约2.4kb的cDNA片段,克隆至pGEM Teasy载体;经限制性核酸内切酶谱证实后,进一步将其亚克隆至逆病毒载体pLXSN中,并经测序证实,为进一步的基因转移和基因治疗研究准备材料.

改进方案构建人糖皮质激素受体α基因正、反义重组逆病毒载体

目的 构建人糖皮质激素α(hGRα)cDNA的表达重组体 ,为较大DNA片段的克隆提供借鉴 ,并为利用反义核酸技术探讨hGRα功能及其作用机制提供实验材料。方法 L -PCR扩增hGRαcDNA ,克隆至T载体 ;随后通过改进的连接方案进行亚克隆。结果 限制性酶增和序列分析表明克隆及亚克隆成功。结论 成功构建于hGRαcDNA的逆转录病毒载体pLXSN正义及反义重组子。