人纤溶酶原K1-3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原kringle 1- 3 (K1- 3)基因插入融合表达载体pET - 17b ,获得重组质粒pET -K13 ,转化E coliBL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下 ,人纤溶酶原K1- 3基因在E coliBL2 1(DE3,pET -K13)中获得高效融合表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 4% ,表达产物以包涵体存在 ,Westernblot证明重组蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性 .

人纤溶酶原K1-3基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析

纤溶酶原K1 3功能区是近年发现的血管生成抑制因子 ,具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K1 3功能区的基因 ,DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9K上获得重组质粒pPIC9K13,转化毕节酵母GS115 ,用PCR和G418法筛选高拷贝转化子 ,进行摇瓶发酵。SDS PAGE和Westernblot分析结果证实K1 3基因已在GS115分泌表达 ,并具有免疫活性。选用 30L和 80L罐进行高密度发酵 ,甲醇诱导 48h细胞密度达到OD2 5 0～ 30 0 ,比摇瓶提高 5～ 6倍 ,表达量 15 0 2 0 0mg L。发酵上清液经StreamlineSP离子交换及Phe nyl Sephorose疏水层析纯化 ,在SDS PAGE上显示一条带 ,纯度 96 % 。

人纤溶酶原K1-3基因的表达及抗肿瘤作用研究

目的:研究人纤溶酶原K1-3基因的原核表达及其产物K1-3蛋白的抗肿瘤活性。方法:构建含K1-3基因的表达载体pBV-K13;转化E.coliDH5α;热诱导表达菌株E.coliDH5α(pBV-K13)的K1-3基因表达;表达产物经溶解、复性和纯化后进行鸡胚绒毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane,CAM)活性分析和小鼠B16黑色素瘤抑制实验。结果:SDS-PAGE和Western blot分析结果证实K1-3基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物对人纤溶酶原抗血清具有特异免疫活性,并抑制CAM毛细血管生成及小鼠B16黑色素瘤生长。结论:原核表达的K1-3蛋白具有抑制血管生成和抗肿瘤作用。

脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因诱导人肝癌细胞凋亡

目的观察脂质体介导人纤溶酶原k13基因诱导体外培养人肝癌细胞凋亡的效应。方法构建人纤溶酶原k13基因真核表达载体pcDNAk13并以阳离子脂质体介导pcDNAk13转染体外培养人肝癌细胞,经Heochst33258染色后,在荧光显微镜下观察细胞核的形态。结果转染pcDNAk13组可见致密浓染的凋亡细胞核。结论脂质体介导人纤溶酶原k13基因能诱导体外培养人肝癌细胞凋亡。

重组人纤溶酶原k1-3基因转染对血管内皮细胞的作用研究

目的观察脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因转染人脐静脉内皮细胞导致细胞凋亡和移动抑制的效应,初步探讨k1-3基因的抗血管生成机制。方法以阳离子脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因真核表达载体pcDNA-k13转染体外培养人脐静脉内皮细胞,经细胞凋亡检测和移动抑制试验,比较对照组和实验组的凋亡率和抑制率。结果转染pcDNA-k13组有明显的细胞凋亡效应和移动抑制。结论人纤溶酶原k1-3基因在人血管内皮细胞表达,并可能通过诱导细胞凋亡及抑制细胞迁移而抑制肿瘤新生血管的生成。