人组氨酰-tRNA合成酶基因的克隆与表达

用RT_PCR方法从人胎盘总RNA中获得编码人组氨酰_tRNA合成酶(Jo_1)基因的全序列,选用IMPACT_CN系统中的pTYB11,构建克隆与表达载体,转化大肠杆菌ER2566.经筛选与鉴定,得到3个阳性重组子,对其进行诱导表达获得Jo_1融合蛋白,western_blotting检验结果显示,该融合蛋白具有Jo_1免疫原性和免疫特异性.

异亮氨酰-tRNA合成酶基因变异的研究进展

异亮氨酰-t RNA合成酶(IARS)催化异亮氨酸和特异t RNA结合并调控蛋白质合成,还可以调节细胞内的信号传导通路并参与细胞内的代谢过程。在动物和人体中IARS基因变异均十分少见,其变异后导致的IARS缺乏是一种罕见的常染色体隐性遗传病,会出现严重的发育迟缓,智力发育受损,肌张力低下和肝功能异常等多系统病变,且IARS基因变异后的特定氨基酸治疗也成为当下的研究热点。本文对该领域的研究进展进行综述,以期总结归纳IARS基因变异后的相关表型,阐明基因型与表型的关联及可能的发病机制,对其病因学研究提供参考。

大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶与tRNA^(Leu)的相互作用 头孢菌素酰化酶的表达、翻译后加工和亚基重组(英文)

第一部分:为得到大量的大肠杆菌tRNALeu1 和tRNALeu2 ,研究tRNA与亮氨酰 tRNA合成酶(LeuRS)的相互作用,用基因克隆的方法高表达并纯化了它们;测定了接受活力和被LeuRS催化的动力学常数;改进了RNA体外转录必需的T7RNA聚合酶的纯化方法,优化了转录条件,转录序列比文献值高 1 0倍.用体外转录方法得到了各种在接受茎突变的tRNALeu变种,研究了一个在CP1结构域插入 40个氨基酸残基的变种LeuRS A对tRNALeu2种等受体的识别,证明了tRNA Leu1 和tRNA Leu2 接受茎上的第一对硷基对是否摆动是LeuRS A识别的关键. 第二部分:在大肠杆菌中高表达头孢菌素酰化酶基因 1 0倍以上.研究了它的α 亚基的N 端变化(LAEP →MGIP )对酶学动力学常数的影响.构建了带有不同抗菌素抗性和启动子的高表达质粒,研究了它们表达的特点,分析了这些质粒的不同用途.用含有编码该酶两个亚基的基因的相容质粒共转化的方法.研究了它们在体内的重组和前体的加工.研究结果表明,该酶可能属于一类新的N

抗组氨酰-tRNA合成酶单克隆抗体的制备及初步鉴定

【目的】制备均一性和特异性高的抗组氨酰-tRNA合成酶抗体,为研究皮肌炎和多肌炎的检测提供方法,为制备检测试剂盒提供原料。【方法】采用常规融合和间接ELISA检测法,获取杂交瘤细胞株;Protein G Sepharose 4FF和Sephadex G50结合对含有单克隆抗体的腹水进行纯化;SDS-PAGA电泳技术进行单克隆抗体的鉴定。【结果】筛选获得了2株稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为W001和W002;杂交瘤细胞克隆后,100%的检测孔保持了分泌抗组氨酰-tRNA合成酶抗体的能力;腹水纯化达到了较理想的效果;该2株单克隆抗体能特异性针对组氨酰-tRNA合成酶,并能跟天然的蛋白结合。【结论】所制备的均一性和特异性高的抗组氨酰-tRNA合成酶抗体,可直接用于在ELISA、免疫印迹、免疫组化学等研究方面,达到了试验的目的。

稀土离子对大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶动力学性质的影响

采用含pTrc 99B/leuS2转化子的高表达菌株 ,简便快速地提取、纯化大肠杆菌亮氨酰 tRNA合成酶。对部分稀土离子参与下的氨酰化反应表观稳态动力学性质进行了研究。氨酰化反应所需的Mg2 + 有可能被稀土离子取代 ,脱镁tRNALeu1 与未脱镁tRNALeu1 对ATP和亮氨酸的表观Km 值明显不同。高浓度ATP对脱镁tRNA显示抑制作用 ,说明金属离子是氨酰化反应的底物之一。

氨酰-tRNA合成酶对tRNA的识别

氨酰 tRNA合成酶 (aaRS)与tRNA的相互作用保证了蛋白质生物合成的忠实性 .氨酰 tRNA合成酶对tRNA识别的专一性依赖于aaRS特定的催化结构域和tRNA分子特异的三级结构构象 .反密码子和接受茎 (包括 73位 )在大多数aaRS对tRNA分子的识别过程中起着关键作用 ,其他部位如可变口袋、可变 (茎 )环等 。

家蚕氨酰-tRNA合成酶基因分析

为了探讨家蚕氨酰-tRNA合成酶(BmaaRS)基因的数目、种类、结构及起源,利用家蚕基因组数据和EST数据进行了BmaaRS基因的电子克隆,结果表明,家蚕核基因组中含有2套不同的aaRS核基因,分别编码线粒体和细胞质BmaaRS,但编码线粒体BmSerRS的基因有2个,可能缺少编码细胞质的BmHisRS基因和编码线粒体的BmGlnRS、BmLysRS、BmGlyRS和BmThrRS基因,这些基因的功能可能由具有相似功能的其他蛋白完成,或通过某个BmaaRS基因的可变剪接分别形成不同功能的BmaaRS。EST证据表明,BmaaRS基因存在不同形式的可变剪接;BmaaRS氨基酸序列的相似性及二、三级结构分析表明部分BmaaRS存在结构域的扩增,有些不同的BmaaRS具有相同结构域,相同功能的BmaaRS具有相似的三级结构;进化分析表明,BmaaRS为2套不同来源的BmaaRS基因编码,细胞质和线粒体BmaaRS的起源不同。

氨酰-tRNA合成酶的结构、功能及其在药物研发中的应用

氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)在各种生物蛋白质的合成过程发挥了重要的作用,其专一性结合氨基酸的能力保证了生物体基因组的正确表达。与此同时,越来越多的研究表明其在胞外同样发挥着重要的生物学功能。因此,以aaRS为靶点的新药研究引起了越来越多的关注。本文从aaRS的结构出发,对其在细胞内外的生物功能以及在近几年药物研究中的应用进行概述。

诱导条件对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶表达的影响

目的优化人线粒体色氨酰-tRNA合成酶(hmtTrpRS)的表达条件。方法构建表达载体pET-24a(+)-hmtTrpRS,转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中。分析异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导时间和诱导温度对hmtTrpRS表达的影响。结果确定IPTG浓度为0.1 mmol/L,30℃诱导4 h,为诱导蛋白表达较合适条件。同时利用特异性的Ni亲和柱色谱纯化了目的蛋白。结论获得较合适的表达条件,并纯化得到较高纯度的hmtTr-pRS,为以后该酶结构、功能的研究奠定了基础。

人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:在原核系统中表达并纯化人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白,制备多克隆抗体。方法:设计引物扩增其开放阅读框,重组入原核表达载体PQE30,并在大肠杆菌M15中诱导表达;应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔。结果:①成功构建人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达载体;②经NI亲和层析获得纯度较高的重组蛋白;③制备了高滴度的兔抗人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白的多克隆抗体。结论:原核表达载体的构建、重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备为今后研究该蛋白的功能提供了良好的基础。

嗜热脂肪芽胞杆菌色氨酰-tRNA合成酶BsTrpRS的表达、纯化及其与创新霉素复合物的单晶制备和X-射线衍射分析

目的获得来源于嗜热脂肪芽胞杆菌色氨酰-tRNA合成酶(BsTrpRS)与创新霉素复合物的晶体结构,为创新霉素的理性设计提供结构基础。方法利用大肠杆菌表达系统异源表达获得BsTrpRS可溶性表达,采用亲和层析色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱纯化目的蛋白,以期获得纯度在90%以上的BsTrpRS,通过等温滴定量热法检测BsTrpRS与创新霉素的亲和力。选用悬滴-水蒸汽扩散法筛选蛋白质结晶条件,通过优化结晶条件获得高质量晶体,利用上海光源蛋白质晶体学光束线站收集X-ray衍射数据。结果运用分子生物学方法成功构建含bstrprs基因的重组质粒,转化BL21(DE3)得到重组表达菌株。运用亲和层析、离子交换色谱和分子排阻色谱等蛋白纯化技术,获得高纯度BsTrpRS蛋白。利用ITC技术确证创新霉素与BsTrpRS之间亲和力为3.2μmol/L。通过晶体筛选优化,最佳结晶条件为1.8 mol/L K_(2)HPO_(4),pH 7.6,37℃,0.75%(v/v)1,3-丙二醇,最终获得X-ray衍射分辨率为2.06A的BsTrpRS/创新霉素二元复合物晶体,其晶胞参数为a=91.675A,b=91.675A,c=152.37A,α=90.000°,β=90.000°,γ=120.000°,晶体的马修斯系数为2.48A^(3)/Da,最小非对称单位内含有2个蛋白分子,溶剂百分比为50.46%。结论创新霉素与BsTrpRS复合物晶体结构的获得,有望对创新霉素小分子结构优化及设计提供指导方向及重要依据。

氨基酰-tRNA合成酶与神经退行性疾病

氨基酰-tRNA合成酶催化tRNA的氨基酰化反应为生物体内的蛋白质合成提供原料.这类古老且保守的蛋白质分子在高等生物复杂的细胞分子网络中分化出的新功能是目前人们关注的焦点.近期在对一些患有神经退行性疾病的病人和小鼠模型的研究中发现,位于酪氨酰-tRNA合成酶、甘氨酰-tRNA合成酶和丙氨酰-tRNA合成酶上的突变,可分别导致DI腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Toothdisease,CMT)C型,腓骨肌萎缩症2D型及小脑浦肯雅(Purkinje)细胞丢失.初步的致病机理研究表明,致病突变对这3种酶的影响各不相同:酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酰化催化能力受到影响,甘氨酰-tRNA合成酶受影响的可能是一种未知的新功能,而丙氨酰-tRNA合成酶受影响的则是它的编校功能.这些研究结果揭示了氨基酰-tRNA合成酶涉及神经退行性疾病的广泛性和其机制的复杂性,并将促进对神经退行性疾病这一类常见疾病的病理和治疗方法的研究.

色氨酰-tRNA合成酶基因WRS1调控水稻种子发育

【目的】氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRSs)与遗传信息传递密切相关,已发现植物中aaRSs家族蛋白在维持翻译功能之余,还参与配子发生与胚发育、质体的早期发育以及免疫信号的感知与病害防御等生物学过程。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体,分析水稻色氨酰-tRNA合成酶(WRS1)在胚乳发育中的作用,证明WRS1基因编码一个影响水稻胚乳发育的关键因子。【方法】本研究通过甲烷磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变籼稻(Oryza sativa subsp.indica)品种N22,筛选到一个稳定遗传的水稻粉质胚乳突变体(wrs1),图位克隆获得目标基因。对wrs1成熟种子进行形态学观察以及淀粉相关理化性质测定,利用细胞学切片分析wrs1发育中胚乳的结构,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和GUS活性染色分析基因表达模式,通过qRT-PCR比较野生型与突变体花后12 d胚乳中淀粉合成相关基因表达情况,免疫印迹检测野生型与突变体成熟种子中淀粉合成酶蛋白积累情况,使用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。【结果】wrs1突变体幼苗表现出明显的发育滞后且逐渐蔫萎死亡,从杂合突变体(WRS1wrs1)中分离到的粉质籽粒呈现明显的腹部皱缩,粒厚、千粒重下降,同时总淀粉含量下降,糊化淀粉的峰值黏度和崩解值均低于野生型。wrs1突变体发育胚乳中复合淀粉颗粒变小,排列疏松。WRS1定位于第12染色体长臂约183 kb的区间内,测序发现编码色氨酰-tRNA合成酶(tryptophanyl-tRNA synthetase,WRS)基因的第6外显子上发生单碱基替换,导致一个保守位置上的甲硫氨酸被替换。wrs1突变体中大部分淀粉合成相关基因表达量下调,且野生型与突变体间基因表达的变化与相应蛋白积累的差异存在不一致的趋势。wrs1突变体籽粒中蛋白质积累降低,而游离氨基酸含量显著升高。【结论】WRS1编码色氨酰-tRNA合成酶,该基因突变后通过影响氨基酸稳态和蛋白质合成,造成淀粉合成相关基因异常表达从而影响淀粉的合成与积累,导致种子发育缺陷。

布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶的克隆表达纯化及活性测定

目的克隆布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶基因,并进行表达纯化及活性测定。方法通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中扩增出亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)基因,依次克隆入pBS-T克隆载体及pET21a(+)表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中通过条件优化后表达。表达产物用His-Bind亲和色谱纯化,并用免疫印迹进行鉴定。采用放射性同位素方法进行酶活性测定。结果PCR扩增得到3.2 kb的DNA片段,重组质粒pET21a(+)/LeuRS经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白的20%,纯化后蛋白纯度达85%,免疫印迹进行鉴定蛋白正确,酶活性测定计算出提纯物酶活性约为72 U/mL。结论已成功克隆表达纯化出布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶,并用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。

氨酰-tRNA合成酶的进化差异

大量研究显示,细菌与真核生物中的许多氨酰-tRNA合成酶(aaRS)在一些细菌与真核生物中的基因进化机制与模式、氨酰化途径和结构与功能的进化模式等方面往往有着明显的差异。通过对这些差异的深入研究,对于理解蛋白质的结构与功能的进化将是非常有帮助的。虽然造成这些差异的机制目前仍不清楚,但是,所有的这些差异似乎提示,在细菌与真核生物的一些基本生命活动过程中的某些方面,可能还存在着目前尚未被人们所认识到的较大差异。

作用于细菌氨酰-tRNA合成酶的抗感染药物研究进展

细菌耐药问题已对全球公共卫生构成了重大的威胁,研发新的抗菌药物成了紧迫的任务。氨酰-tRNA合成酶作为催化特定氨基酸与tRNA结合的关键酶,在蛋白质合成中发挥了重要作用,由于真核细胞与原核细胞在酶的精细结构上存在差异,为设计针对细菌氨酰-tRNA合成酶的抑制剂提供结构基础。本文对细菌氨酰-tRNA合成酶的结构、作用机制及分类进行概述,并从酶抑制剂的来源出发,对针对此靶点的抗感染药物研究现状进行系统综述。

卵巢激素对甘氨酰-tRNA合成酶在小鼠子宫表达影响的研究

为了探讨卵巢激素是否影响甘氨酰-tRNA合成酶(Gars)在小鼠子宫的表达,试验将12只小鼠切除卵巢后随机分成4组,分别为E2组(注射E2100 ng)、P4组(注射P42 mg)、E2+P4组(注射E2100 ng和P42 mg)和Oil组(注射芝麻油0.1 mL),采用mRNA原位杂交、实时荧光信号颜色定量PCR、免疫组织化学和Western-blot分析等方法,从基因和蛋白质水平对Gars在小鼠子宫的表达进行定位和定量研究。结果表明:加入碱性磷酸酶显色底物NBT/BCIP后,E2组信号颜色为深棕色(偏黑),P4组及E2+P4组为浅棕色,Oil组仍为绿色;与注射芝麻油相比,E2及E2+P4可上调切除卵巢小鼠子宫Gars基因的表达(P<0.05),P4不影响切除卵巢小鼠子宫Gars基因的表达(P>0.05);加入免疫组织化学显色底物DAB后,E2组、E2+P4组信号颜色为深棕色,Oil组为浅棕色,P4组为蓝色;与注射芝麻油相比,E2及E2+P4可上调切除卵巢小鼠子宫Gars蛋白的表达P<0.05),P4则显著下调切除卵巢小鼠子宫Gars蛋白的表达(P<0.05)。说明Gars的表达受到卵巢类固醇激素的调控。

氨基酰-tRNA合成酶及其与相关tRNA的相互作用研究

氨基酰tRNA合成酶是生物体蛋白质合成过程中的一类关键酶 ,对它的研究具有重要的生物学意义和应用前景。该项目系统研究了大肠杆菌亮氨酰 和精氨酰 tRNA合成酶及其与相关tR NA的相互作用。用酶和tRNA的基因克隆和高表达 ,tRNA体外转录 ,基因定点突变 ,酶片段的体外重组等手段研究了酶与tRNA的相互作用的结构基础 ,得到一系列重要结果。

基于蛋白结构的靶向氨酰-tRNA合成酶的药物研究进展

在全球抗菌药物严重滥用的情况下,发展具有全新靶标的抗菌药物是一种重要的解决方案,目前,已有大量靶向氨酰-tRNA合成酶(aaRS)的药物被发现和改造。本文对aaRS的蛋白结构和作用机制进行了详细的介绍,并根据其蛋白结构特点总结了包括aaRS合成位点和催化位点的抗菌药物,并对这些药物的发现、改造和活性研究进行简要介绍,为进一步开发出以该靶点为作用目标的抗菌药物提供参考。