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组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 被引量:14
1
作者 廖建民 张瑾 沈子龙 《药物生物技术》 CAS CSCD 2002年第2期95-98,共4页
通过PCR的方法从人t PA基因上扩增到r PA基因的编码序列 ,并克隆到 pMD18 T载体中 ,DNA测序与文献报道完全一致。该基因被克隆到多用途表达载体pET2 8a中 ,重组表达载体r PA/ pET 2 8a转化E coliBL2 1(DE3) ,培养表达 ,SDS PAGE分析可见... 通过PCR的方法从人t PA基因上扩增到r PA基因的编码序列 ,并克隆到 pMD18 T载体中 ,DNA测序与文献报道完全一致。该基因被克隆到多用途表达载体pET2 8a中 ,重组表达载体r PA/ pET 2 8a转化E coliBL2 1(DE3) ,培养表达 ,SDS PAGE分析可见Mr 约 390 0 0的蛋白条带 ,约占细胞内总蛋白的 30 %以上。体外溶圈法测定活性表明该重组蛋白具有较好的纤溶活性。 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 reteplase(r-PA)基因 克隆 大肠杆菌 聚合酶链式反应
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGl在CHO细胞中的高效表达 被引量:5
2
作者 赵庆国 黄培堂 刘士辉 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第1期98-101,共4页
为了得到tPA组合突变体FrGGI在CHO细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子(enhancer)去除,构建了FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。酶切线性化后,采用大剂量DNA电击介导法,转染... 为了得到tPA组合突变体FrGGI在CHO细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子(enhancer)去除,构建了FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。酶切线性化后,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHOdhfr-)。氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在1×10-7mol/LMTX压力下,获得表达水平达1500~2500IU/106细胞·24h的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间约为36h,且有进一步提高表达水平的潜能。 展开更多
关键词 药物 组织 酶原激活剂 突变体 基因表达
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重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因的克隆、表达与生物活性鉴定 被引量:4
3
作者 任启生 陈嫚 +1 位作者 宋新荣 冯长根 《生物技术》 CAS CSCD 2004年第5期6-8,共3页
目的 :研究重组人组织型纤溶酶原激剂突变体 (reteplase,r -PA)基因的克隆和表达 ,并对表达产物进行活性鉴定。方法 :通过PCR的方法从t-PA基因上扩增得到r-PA基因的编码序列 ,并克隆到pUC19载体中 ,经DNA测序正确后 ,将该基因克隆到含... 目的 :研究重组人组织型纤溶酶原激剂突变体 (reteplase,r -PA)基因的克隆和表达 ,并对表达产物进行活性鉴定。方法 :通过PCR的方法从t-PA基因上扩增得到r-PA基因的编码序列 ,并克隆到pUC19载体中 ,经DNA测序正确后 ,将该基因克隆到含有T7启动子的高效表达质粒pJZ - 10 0中 ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,得到含有r-PA基因的工程菌。工程菌经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE检测表达情况。提取包涵体 ,经过体外稀释法复性 ,亲和色谱层析纯化 ,测定产物的活性。结果 :表达的重组蛋白约占可溶性总蛋白的 2 0 % ,复性并纯化后测定活性为 5 80 0 0IU mg。结论 :成功构建了重组r-PA的表达质粒 ,表达产物具有良好的生物活性。 展开更多
关键词 重组人组织酶原激活剂突变体 克隆 表达 生物活性
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组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)及其突变体的表达研究进展 被引量:3
4
作者 冮洁 路福平 杜连祥 《药物生物技术》 CAS CSCD 2003年第4期251-255,共5页
对组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)及其突变体在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、丝状真菌、昆虫细胞和转基因动物乳腺等表达系统中进行表达的研究工作情况进行了综述 ,并对各个表达系统的优缺点进行了比较。
关键词 组织酶原激活剂 突变体 表达系统 基因工程药物 T-PA
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重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)及其突变体的纯化 被引量:3
5
作者 朱恒奇 徐秀英 黄培堂 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期82-86,共5页
稳定高效表达重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rht PA)的CHO细胞株和表达组合突变体的细胞株进行了 3L转瓶培养 .将培养上清分别进行了Lys Sepharose 4B亲和层析和Zn2 + Sepharose 4B层析两步纯化 ,rht PA纯度提高了 5 34倍 ,比活达 2 5&... 稳定高效表达重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rht PA)的CHO细胞株和表达组合突变体的细胞株进行了 3L转瓶培养 .将培养上清分别进行了Lys Sepharose 4B亲和层析和Zn2 + Sepharose 4B层析两步纯化 ,rht PA纯度提高了 5 34倍 ,比活达 2 5× 10 5IU mg ,产率为 73% ;突变体纯度提高了1119倍 ,比活达 5 9× 10 5IU mg ,产率为 6 9% .纯化产物SDS PAGE分析显示 ,rht PA和突变体基本都呈单一条带 ,扫描分析均达到 98%以上纯度 .rht PA和突变体在纯化系统中的行为作对照分析发现 ,突变体的构建思想在Lys Sepharose 4B亲和层析过程中有充分体现 .这两步层析组合是很好的纯化t PA及其突变体的方法 ,尤其是Lys Sepharose 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 纯化
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重组人组织型纤溶酶原激活剂及其突变体的溶血栓研究 被引量:1
6
作者 朱恒奇 徐秀英 +1 位作者 陈琳 黄培堂 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2003年第6期271-273,共3页
目的 比较重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)及其突变体FsGGI和FrGGI的溶血栓作用,验证突变体的构建思想。方法 采用兔颈静脉溶栓模型和体外溶栓试验对纯化的rht-PA及其突变体FsGGI和FrGGI进行家兔体内外溶栓研究。结果 rht-PA、FsGGI... 目的 比较重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)及其突变体FsGGI和FrGGI的溶血栓作用,验证突变体的构建思想。方法 采用兔颈静脉溶栓模型和体外溶栓试验对纯化的rht-PA及其突变体FsGGI和FrGGI进行家兔体内外溶栓研究。结果 rht-PA、FsGGI及FrGGI三者均有体内外溶栓作用,体外溶栓能力基本相似;体内溶栓活力突变体FsGGI与FrGGI类似,均显著高于rht-PA,溶栓度分别为20.1%、49.1%和46.6%。在体内溶栓作用的同时均未引起血浆纤维蛋白原滴度下降。结论 溶栓作用是血栓特异性的,两种突变体是优于野生型t-PA的溶栓剂,上游的构建思想是正确的。 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 栓度 血浆 血栓作用
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体FrGGI的构建、表达及特性分析 被引量:2
7
作者 刘士辉 黄培堂 +4 位作者 赵庆国 朱恒奇 徐秀英 陈琳 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1995年第1期6-10,共5页
为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAI—1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术成功地构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44~Ser50置换为纤粘蛋白Ⅰ型F区间连接序列GluSerLysPr... 为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAI—1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术成功地构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44~Ser50置换为纤粘蛋白Ⅰ型F区间连接序列GluSerLysProGluAlaGluGlu的t-PA的组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,FrGGI在大鼠血浆中的半衰期延长了15倍,特异活性提高了40%,并获得了PAI-1抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 半衰期 PAI-Ⅰ
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体FrGGI的构建、表达及特性分析 被引量:2
8
作者 刘士辉 黄培堂 +2 位作者 徐秀英 朱恒奇 黄翠芬 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期625-630,共6页
为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAL-1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44~Ser50置换为纤粘... 为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAL-1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44~Ser50置换为纤粘蛋白Ⅰ型F区间连接序列GluSerLysProGluAlaGluGlu的t-PA组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,FrGGI在大鼠血浆中的半衰期延长了15倍,并获得了PAI-1抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。 展开更多
关键词 组织 酶原激活剂 突变体 T-PA 栓药
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体在CHO细胞中表达产物的纯化研究 被引量:1
9
作者 赵庆国 张郁 +2 位作者 黄培堂 刘士辉 焦保权 《解放军药学学报》 CAS 2000年第3期117-119,共3页
目的 :为了从细胞株培养液中纯化长半衰期的t PA组合突变体FrGGI。方法 :采用高表达克隆细胞株 ,进行大量培养 ,收集 2 4h细胞培养液为初始材料 ,利用t PAK2区含有Lysine结合位点的特性和Zn2 +与蛋白质中咪唑、巯基等基团螯合作用 ,经Ly... 目的 :为了从细胞株培养液中纯化长半衰期的t PA组合突变体FrGGI。方法 :采用高表达克隆细胞株 ,进行大量培养 ,收集 2 4h细胞培养液为初始材料 ,利用t PAK2区含有Lysine结合位点的特性和Zn2 +与蛋白质中咪唑、巯基等基团螯合作用 ,经Lysine Sepharose 4B亲和层析和Zn2 + Sepharose 4B金属螯合层析二步组合纯化。结果 :获得高比活的FrGGI,为研究该突变体生物学特性及推广应用奠定基础。结论 :利用赖氨酸和锌离子柱二步组合纯化方法 ,可有效地分离纯化t 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 纯化 CHO细胞
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体在CHO细胞中的高效表达 被引量:1
10
作者 赵庆国 黄培堂 刘士辉 《生物技术通讯》 CAS 1995年第4期151-153,161,共4页
构建了二氢叶酸还原酶(dhfr)选择基因启动子上游无增强子(cnhancer)的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr... 构建了二氢叶酸还原酶(dhfr)选择基因启动子上游无增强子(cnhancer)的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr^-)。用氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10^(-7)mol/L MTX压力下,得到了表达水平达1500~2500IU/10~6细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 基因表达 增强
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新型组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体的克隆及表达 被引量:1
11
作者 周红 王国力 +1 位作者 黄培堂 黄翠芬 《四川生理科学杂志》 1998年第3期37-37,共1页
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是以丝氨酸为活性中心的蛋白酶。它激活纤溶酶原成为纤溶酶,这依赖于纤维蛋白,它不能单独激活循环血流中的纤溶酶原。由于其对纤维蛋白有很高的亲和力,故血栓形成时,它能特异地和血栓中的纤维蛋白结合,纤溶... 组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是以丝氨酸为活性中心的蛋白酶。它激活纤溶酶原成为纤溶酶,这依赖于纤维蛋白,它不能单独激活循环血流中的纤溶酶原。由于其对纤维蛋白有很高的亲和力,故血栓形成时,它能特异地和血栓中的纤维蛋白结合,纤溶酶也通过其赖氨酸残基与纤维蛋白结合,形成三元复合物。这样的机理决定了t-PA可选择性地溶解血栓中的纤维蛋白,而对血流中的纤维蛋白原、凝固因子等没有破坏作用。但由于t-PA在体内的半衰期甚短(约5分钟),且在血浆中已被纤溶酶原激活抑制剂抑制,故临床上溶栓时需大剂量连续用药,不仅费用昂贵而且有引起系统性纤溶系统出血的危险。因此设计半衰期延长,且亲和力不变甚至提高的t- 展开更多
关键词 酶原激活剂 突变体 组织 维蛋白原 系统 酶原 蛋白结合 医学科学院 工程研究 活性中心
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组织型纤溶酶原激活物——缺失性突变体Reteplase的特点 被引量:3
12
作者 孙红 黄阳滨 苏义平 《国外医学(心血管疾病分册)》 2003年第1期20-22,共3页
组织型纤溶酶原激活物缺失性突变体(Reteplase,r-PA)是第三代溶栓药,因其具有体内半衰期长(13~19min)、溶栓效果好、纤维蛋白特异性强、免疫原性低,临床使用方便、无过敏反应及颅内出血的危险性低等特点,被认为是未来首选的溶栓药。
关键词 组织酶原激活 缺失性突变体 reteplase 栓药 药代动力学
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毕赤酵母工程菌表达组织型纤溶酶原激活剂突变体发酵条件的优化 被引量:3
13
作者 邓长江 鲍晓明 《齐鲁药事》 2004年第1期48-49,共2页
通过正交试验 ,设计出适合毕赤酵母 (Pichiapastris)工程菌摇瓶培养诱导表达组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase (rPA)的发酵条件 :甲醇诱导浓度 1 0 % ,发酵pH6 0 ,接种菌密度 1 0为最适培养条件 ,最高表达活性为 10 5
关键词 毕赤酵母 工程菌 组织酶原激活剂突变体 发酵条件 正交试验
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重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht—PA)及其突变体的纯化
14
《药物生物技术》 CAS CSCD 2005年第1期31-31,共1页
稳定高效表达人组织型纤溶酶原激活体(rht—PA)的CHO细胞株和表达组合突变体的细胞株进行了3L转瓶培养,将培养上清分别进行了Ls—Speharose 4B亲和层析和Zn^3+S—Speharose 4B层析两步纯化,rht—PA纯度提高了534倍,比活达2.5×1... 稳定高效表达人组织型纤溶酶原激活体(rht—PA)的CHO细胞株和表达组合突变体的细胞株进行了3L转瓶培养,将培养上清分别进行了Ls—Speharose 4B亲和层析和Zn^3+S—Speharose 4B层析两步纯化,rht—PA纯度提高了534倍,比活达2.5×10^5IU/mg,产率为73%;突变体纯度提高了1119倍,比活达5.9×10^5IU/mg,产率为69%。 展开更多
关键词 t—PA 纯化 培养上清 人组织酶原激活剂 细胞株 活体 亲和层析 突变体 高效表达 转瓶
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抗PAI抑制作用的组织纤溶酶原激活剂在大肠杆菌中的表达 被引量:5
15
作者 朱美财 占志 +3 位作者 王雅静 刘成刚 石缨 蔡庆 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期565-569,共5页
目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1~3和176~527位的截短式t-PA DNA序... 目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1~3和176~527位的截短式t-PA DNA序列; 并将该t-PA分子中的PAI-1结合位点,即第373~384位核苷酸(AAG CAC AGG AGG)突变为(GCG GCC GCG GCG),相应的氨基酸KHRR则变为AAAA.结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,将其克隆于大肠杆菌表达载体中,并在大肠杆菌中得到高效表达.表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在.经蛋白质变性、复性,得到有活性的t-PA突变体.t-PA突变体与PAI-1反应后t-PA的活性未受到抑制.结论:t-PA突变体可能是一种用于治疗心肌梗死和脑血栓等血栓性疾病的强效且剂量要求低的新型生物工程药物. 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 基因克隆 表达 纯化
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组织型纤溶酶原激活剂突变体的构建、表达及特性分析 被引量:8
16
作者 刘士辉 黄培堂 黄翠芬 《中国科学(B辑)》 CSCD 北大核心 1995年第4期399-405,共7页
利用寡核苷酸诱导的定位突变技术及DNA重组技术构建了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的PAI-1结合位点Lys296~Gly302缺失的突变体de1(296~302),K1,K2区去糖基化突变体N117Q/N184Q,以及两者的组合突变体GGI,并在COS-7细胞中获得了暂时性表... 利用寡核苷酸诱导的定位突变技术及DNA重组技术构建了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的PAI-1结合位点Lys296~Gly302缺失的突变体de1(296~302),K1,K2区去糖基化突变体N117Q/N184Q,以及两者的组合突变体GGI,并在COS-7细胞中获得了暂时性表达,并进一步在CHO细胞中稳定表达了组合突变体GGI.在此基础上对表达产物的生物学特性进行了分析,结果显示de1(296~302)和组合突变体GGI获得了PAI-1抗性,组合突变体GGI在与纤维蛋白亲和力未受损害的同时,特异活性约提高46%,半衰期延长约1倍.此组合突变体很可能成为优于野生t-PA的新型溶栓剂候选株. 展开更多
关键词 组织 酶原激活剂 突变体 PAI-1 T-PA
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重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体在中国健康人体的耐受性及药代动力学研究 被引量:10
17
作者 许莉 黄一玲 +4 位作者 华潞 田蕾 李飞鸥 况扶华 李一石 《中国临床药理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期734-737,共4页
目的研究注射用重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(rhTNK-tPA)在中国健康人体的耐受性和药代动力学特征。方法 26例健康男性受试者分为5个剂量组:0.1 mg·kg-12例,0.2 mg·kg-18例,0.4mg·kg-18例,0.6 mg·kg-12例,... 目的研究注射用重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(rhTNK-tPA)在中国健康人体的耐受性和药代动力学特征。方法 26例健康男性受试者分为5个剂量组:0.1 mg·kg-12例,0.2 mg·kg-18例,0.4mg·kg-18例,0.6 mg·kg-12例,每次20 mg 6例,分别单次静脉注射相应剂量的rhTNK-tPA。0.2,0.4,0.6 mg·kg-1,每次20 mg组,受试者在进行耐受性试验的同时完成药代动力学试验。用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定血浆rhTNK-tPA浓度。结果健康男性受试者静脉注射rhTNK-tPA 0.2,0.4,0.6mg·kg-1和每次20 mg后,Cmax分别为(16.44±2.64),(33.38±6.55),(41.45±11.00),(28.88±6.82)ng·L-1,t1/2分别为(147.00±47.00),(197.00±40.00),(190.00±19.00)和(224.00±60.00)min,AUC0-t分别为(15.79±4.36),(36.93±9.35),(37.54±5.89),(29.35±3.63)ng·L-1·h,Vd分别为(2.97±1.04),(3.23±0.75),(4.59±1.17)和(3.71±1.18)L。与试验药物相关不良事件发生率为23%,程度均为轻度,未经处理均自行消失。结论在研究剂量范围内,rhTNK-tPA呈线性动力学特征。每次15 mg到每次20 mg作为中国人溶栓治疗Ⅱ期临床试验的剂量可能是安全有效的剂量。 展开更多
关键词 注射用重组人组织酶原激活剂TNK突变体 酶联免疫吸附实验 药代动力学 耐受性 健康受试者
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利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)
18
作者 雒丽娜 王盛 《宁夏大学学报(自然科学版)》 CAS 2012年第1期58-61,共4页
构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase)的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)中进行表达.经SDS-聚... 构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase)的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)中进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western blotting)和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测分析.结果表明,在烟草中成功地表达出了有活性的rPA.为在植物中生产Reteplase提供了一条可能的途径. 展开更多
关键词 人组织酶原激活剂突变体rpa(reteplase) 烟草花叶病毒 瞬时表达载体
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抗PAI抑制作用的纤溶酶原激活剂突变体的活性研究
19
作者 李飞 李忠培 +2 位作者 占志 王冬雪 朱美财 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第16期3029-3032,3037,共5页
目的:重组表达抗PAI抑制作用的t-PA突变体,经诱导表达、复性、纯化后进行生物学活性和酶动力学分析。方法:构建pBV220-tpa重组表达质粒,经DNA测序确认后,转化至大肠杆菌DH5a,温控诱导表达,凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化,复性后,... 目的:重组表达抗PAI抑制作用的t-PA突变体,经诱导表达、复性、纯化后进行生物学活性和酶动力学分析。方法:构建pBV220-tpa重组表达质粒,经DNA测序确认后,转化至大肠杆菌DH5a,温控诱导表达,凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化,复性后,过刺桐胰蛋白酶亲和层析柱纯化,酶动力学分析其活性。结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,表达蛋白占总菌体蛋白的30%,经纯化后纯度达90%以上,比活性为7.0×108IU/mg,t-PA突变体与PAI-1反应后,其活性未受到抑制。t-PA突变体酶的米氏常数Km为0.5298,最大水解速度Vmax为0.0595。结论:经生物学活性测定,表达蛋白能够明显抵抗PAI的抑制作用,并具有良好的生物活性,该突变体有可能成为用量更少、疗效更佳的新型溶栓药物。 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 蛋白表达 纯化 酶动力学
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半衰期延长获得PAI-1抗性的t-PA突变体的构建、表达及特性分析 被引量:10
20
作者 刘士辉 黄培堂 黄翠芬 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1995年第1期13-19,共7页
用基因重组及定位突变技术成功地构建了t-PA的K1区缺失突变体t-PAdelK1、PAI-1结合位点缺失突变体t-PA del(296—302)及两者的组合突变体t-PA del(K1,296—302),并在COS-7细胞中实现三者的暂时性表达,在CHO细胞中实现了t-PA del(K1,296... 用基因重组及定位突变技术成功地构建了t-PA的K1区缺失突变体t-PAdelK1、PAI-1结合位点缺失突变体t-PA del(296—302)及两者的组合突变体t-PA del(K1,296—302),并在COS-7细胞中实现三者的暂时性表达,在CHO细胞中实现了t-PA del(K1,296—302)的稳定性表达。对表达产物的生物学特性分析表明,t-PA del(296—302)及t-PA del(K1,296—302)获得了PAI-1抗性,因时t-PA del(K1,296—302)在大鼠体内的半衰期延长约5倍,而与纤维蛋白的亲和力只略有下降。因此,此组合突变体有可能成为优于野生t-PA的新型溶栓剂候选株。 展开更多
关键词 组织酶原激活剂 突变体 半衰期 PAI-1
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