含人组织激肽释放酶1和基质金属蛋白酶组织抑制物1基因共表达载体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

背景和目的前期研究表明人组织激肽释放酶1（hTK1）基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和改善血管再狭窄的作用,但联合基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP1）对VSMC增殖是否具有协同效应,目前尚不明了。本研究构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠VSMC中的表达,以及对VSMC生长增殖影响。方法采用限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ,酶切含启动子CMV和hTIMP1基因片段的重组穿梭质粒,经PCR、连接、热激、转化等亚克隆至pDC316-hTK1质粒中,构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组穿梭质粒。将骨架质粒和穿梭质粒于293A细胞包装重组腺病毒载体。感染大鼠VSMC后,采用RealtimePCR法、Western blot法检测目的基因转录、蛋白表达。细胞计数法和四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定细胞增殖。结果经PCR、酶切和测序法证实,含双基因（hTK1和hTIMP1）的重组病毒穿梭质构建正确。在293A细胞中成功包装出重组腺病毒载体Ad-hTK1-hTIMP1。感染VSMC后,双基因（hTK1和hTIMP1）的转录水平表达呈现随感染复数（50~150 MOI）和时间（1~3d）依赖性地增加,目的蛋白（hTK1和hTIMP1）亦呈现浓度依赖性地高表达。与单基因载体（Ad-hTK1或Ad-hTIMP1）相比较,双基因载体可明显抑制血小板源性生长因子（PDGF）诱导的大鼠VSMC增殖（P〈0.01）,其峰值抑制率为45.7%。结论首次成功构建并包装重组腺病毒双基因载体Ad-hTK1-hTIMP1。感染细胞后,其目的基因和蛋白均呈现独立高表达,并具有协同抑制VSMC增殖的效应,为血管增殖性疾病的多基因干预治疗实验提供一个新工具。

人组织激肽释放酶基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的探讨重组腺病毒介导的人激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)的血管平滑肌细胞(VSMCSHR)迁移的影响。方法自行构建携带目的基因hKLK1和强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双顺反子重组腺病毒载体。采用组织贴块法培养SHR胸主动脉血管平滑肌细胞,接种第3～6代VSMCSHR于6孔板,分别加入含hKLK1重组腺病毒和对照病毒干预,3d后加入PDGF-BB诱导24h,采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移,并加入缓激肽受体B2特异性阻断剂Hoe140。RT-PCR法测定缓激肽B1受体、B2受体的mRNA表达。结果hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140干预不产生影响。PDGF-BB诱导的VSMCSHR缓激肽B2受体mRNA表达明显增加(P<0.001),而Hoe140可明显降低其表达(P<0.01)。结论重组腺病毒介导的hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR迁移,这一效应可能不通过B2受体途径介导。

组织激肽释放酶改善大鼠心肌重塑的实验研究

目的探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(h TK1)基因过表达对大鼠心肌梗死后心肌结构、心肌胶原纤维以及新生血管的影响。方法结扎雄性Sprague-Dawley大鼠的左冠状动脉前降支,建立急性心肌梗死模型。将含h TK1基因的重组腺病毒(Ad-h TK1)和对照病毒(1×1010PFU)注射到心肌梗死部位及其周边区域。4周后处死大鼠,取出心脏、称量、切片;通过荧光显微镜观察心肌组织的绿色荧光表达;Western blot测定h TK1蛋白表达;HE染色观察心肌组织结构,天然猩红染色观察胶原含量、分布,免疫组化法检测新生血管密度。结果仅在Ad-h TK1组大鼠的心肌既有绿色荧光,又有h TK1蛋白表达。假手术组大鼠的心脏质量、左室质量、心肌胶原分布显著低于心梗模型组,新生血管密度明显高于模型组。但与对照病毒组相比,Ad-h TK1组大鼠的心脏质量、左室质量、左室质量指数和心肌胶原纤维含量明显降低(P<0.05),心肌结构和新生血管密度明显改善(P<0.05)。结论重组腺病毒介导的组织激肽释放酶基因过表达可改善心肌结构,增加梗死周围心肌的新生血管形成,改善梗死后心肌重构。

人组织激肽释放酶在Pichia pastoris酵母中的表达

通过将人组织激肽释放酶(hKLK1)原编码序列克隆入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-KLK1。分别用SalⅠ及BglⅡ酶切线性化后电转化酵母菌株GS115,经MD平板及含不同抗性浓度G418的YPD平板上培养筛选,获得抗3mg/mlG418Mut+型分泌表达hKLK1的重组酵母菌4株,抗1mg/mlG418Muts型分泌表达hKLK1的酵母菌3株。酶活性测定数据表明:高拷贝转化子重组蛋白表达量高于低拷贝转化子;Mut+型转化子重组蛋白表达量高于Muts型转化子;且当甲醇诱导体积分数为2%时,重组蛋白的表达量最高。进一步的Western-blotting分析证明,表达的重组hKLK1分子质量正确,能被特异的抗体识别。