组织激肽释放酶家族在病原微生物感染中的作用

组织激肽释放酶(tissue kallikrein-related peptidase, KLK)家族是丝氨酸蛋白酶家族中一种具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶性质的蛋白水解酶亚群,有15个家族蛋白,分别为KLK1~KLK15。近年来,越来越多的研究表明,KLK家族可通过切割病毒和细菌关键蛋白、激活多种宿主受体、调控激肽系统等方式参与机体的多种生理活动,影响着病毒、细菌和真菌中多种病原微生物感染的进程,作用机制复杂且广泛。本文通过对近年来KLK家族蛋白在微生物感染中的作用和机制进行综述,以更好地探究KLK在微生物感染中的重要作用,特别是为其在结核分枝杆菌感染中的研究提供思路,也为KLK家族蛋白作为抗结核治疗靶点提供理论基础。

人组织激肽释放酶基因对2型糖尿病大鼠血压的影响及机制

目的:探讨人组织激肽释放酶(HK)基因对2型糖尿病大鼠血压的影响及其机制。方法:高脂高糖饮食加小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病动物模型。以重组腺相关病毒为载体介导HK基因(HK组)或对照基因LacZ(LacZ组)在糖尿病大鼠体内表达,观察实验动物血压变化及离体主动脉对乙酰胆碱(Ach)依赖性血管舒张反应和一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、内皮素受体A(ETA-R)表达。结果:(1)HK组第2周开始出现血压下降,并一直持续到实验结束(12周时),而LacZ组血压无明显下降。(2)LacZ组离体主动脉对乙酰胆碱(Ach)依赖性血管舒张反应明显低于HK组。(3)HK组大鼠主动脉NO2-/NO3-浓度明显高于LacZ组,而ET-1和ETA-RmRNA明显低于LacZ组。结论:重组腺相关病毒介导HK基因表达明显降低2型糖尿病大鼠血压,改善内皮依赖性血管舒张功能,原因可能与增加动脉NO释放,减少ET-1和ETA-R的表达有关。

导入人组织激肽释放酶基因治疗肾血管性高血压实验研究

目的构建重组人组织激肽释放酶基因真核表达载体并研究其骨骼肌注射对高血压大鼠的降压效应。方法以pBluescripeⅡKSKLK(+)为模板用PCR扩增人组织激肽释放酶基因,将其定向克隆至pcDNA3载体上,形成重组质粒pcDNA3/KLK,并经酶切和测序鉴定。给“两肾一夹”肾性高血压大鼠的股四头肌注入1000μgpcDNA3/KLK,,随后给予100V、1Hz、40ms电刺激6次,并用RT PCR、Western杂交检测人KLKcDNA在体内的表达。尾套法测血压每周2次。结果一次肌肉注射人组织激肽释放酶cDNA可明显延缓“两肾一夹”肾性高血压大鼠的血压升高;能降低血压达8～21mmHg。局部肌肉组织的信使核糖核酸(mRNA)和KLK表达阳性。结论成功构建了pcD NA3/KLK真核表达载体,肌肉注射人组织激肽释放酶基因可引起“两肾一夹”肾性高血压大鼠血压的持续性下降,显示了人KLK基因对高血压患者降压治疗的可能性。

人组织激肽释放酶基因的克隆及测序分析

目的克隆中国人组织激肽释放酶基因 ,为开展基因治疗高血压研究奠定基础。方法提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后进行PCR扩增。将PCR产物回收、插入质粒KS ,酶切鉴定后双向测序分析。结果本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,有一个碱基不同 ,同源性为 99.8%。结论克隆的中国人组织激肽释放酶基因可用于基因治疗等深入研究工作。

人组织激肽释放酶基因重组腺病毒转染对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCSHR)增殖和迁移的影响。方法:自行构建双顺反子重组腺病毒载体,携带强绿色荧光蛋白(EGFP)标志基因和目的基因hKLK1;用细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期;蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1的表达。采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移。结果:(1)hKLK1基因转移呈感染复数依赖性(20-100MOI)抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR生长,100MOI时抑制率为39.3%;呈时间依赖性抑制VSMCSHR生长,第5d时达高峰,抑制率为35.2%。(2)hKLK1基因转移可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,峰值抑制率为30.2%(P<0.01);细胞周期阻滞于G0/G1期的VSMCSHR明显增多,最大阻滞率为36.4%(P<0.01),而缓激肽B2受体特异性阻断剂Hoe140逆转了hKLK的抑制作用。(3)hKLK1基因转移明显上调PDGF-BB诱导VSMCSHR的p27Kip1、p21Cip1表达,Hoe140明显降低p27Kip1、p21Cip1表达。(4)hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140不影响该抑制作用。结论:hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,主要由缓激肽B2受体介导的,通过上调细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1表达的途径。而hKLK1基因转移抑制VSMCSHR迁移效应可能不通过B2受体。

人组织激肽释放酶基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的探讨重组腺病毒介导的人激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)的血管平滑肌细胞(VSMCSHR)迁移的影响。方法自行构建携带目的基因hKLK1和强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双顺反子重组腺病毒载体。采用组织贴块法培养SHR胸主动脉血管平滑肌细胞,接种第3～6代VSMCSHR于6孔板,分别加入含hKLK1重组腺病毒和对照病毒干预,3d后加入PDGF-BB诱导24h,采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移,并加入缓激肽受体B2特异性阻断剂Hoe140。RT-PCR法测定缓激肽B1受体、B2受体的mRNA表达。结果hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140干预不产生影响。PDGF-BB诱导的VSMCSHR缓激肽B2受体mRNA表达明显增加(P<0.001),而Hoe140可明显降低其表达(P<0.01)。结论重组腺病毒介导的hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR迁移,这一效应可能不通过B2受体途径介导。

重组人组织激肽释放酶基因转染人脐静脉内皮细胞

目的 探讨重组人组织型激肽释放酶 (HK)基因腺相关病毒载体 (rAVV/HK)对体外培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)作用。方法 将HK基因定向克隆入腺相关病毒质粒 pAAV MCS中 ,形成重组腺相关病毒 (rAAV HK)质粒 ,经聚合酶链反应 (PCR)检测和DNA测序后 ,将rAAV HK、pAAV Helper和 pAAV RC 3种质粒通过脂质体共转染 2 93细胞 ,包装成带有HK目的基因的重组rAVV/HK ,采用 β半乳糖苷酶原位染色法测定报告基因rAVV/LacZ在HT10 80中的表达 ,间接计算病毒滴度 ,并观察转染基因在传代细胞中的表达。在相同的条件下体外分别培养HUVECs(对照组 )和rAVV/HK转染的HUVEC(HK转染组 ) 4 8h ,采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测两组HUVECsHKmRAN的表达 ,并利用硝酸还原酶法和分光光度法分别检测两组HUVECs一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶 (NOS)活性。结果 rAVV/HK病毒滴度为 6 .2× 10 7个 /mL ,LacZ基因能够在第一传代和第六代HT10 80细胞内稳定持续表达。与对照组比 ,HK转染组HUVECsHKmRNA表达增加 (P <0 0 0 1) ;而且HK转染组HUVECs细胞培养液中NO的含量和NOS活性明显增高 ,P值分别 <0 0 1和 <0 0 5。结论 HK基因通过重组腺相关病毒载体可成功转染体外培养的HU VECs ,使其HKmRNA表达增加 。

人组织型激肽释放酶基因降低果糖诱导高血压大鼠的血压并改善高胰岛素血症

目的:研究人组织型激肽释放酶(HK)基因导入对果糖诱导高血压和胰岛素对抗的作用。方法:雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠饮用10％的果糖水诱导制成高血压动物模型,2周后静脉注入含人组织型激肽释放酶cDNA的重组质粒。然后监测血压,并取血,测定血糖、血胆固醇、血甘油三脂及血胰岛素水平。结果:一次静脉注射含人组织型激肽释放酶基因的重组质粒第3天即可明显降低果糖诱导高血压大鼠的血压,最大降压效应在导入基因后第14天,其降压效应持续3周以上。实验组动物在血压下降的同时,血糖、血胰岛素浓度亦明显降低,并在动物主要脏器中检测到HK蛋白质的表达显著增加。结论:人组织型激肽释放酶基因的导入可能有助于降低血压,并纠正了高血压伴随的高胰岛素血症,结果提示人组织型激肽释放酶基因治疗高血压病尤其是合并糖尿病或胰岛素对抗者的可行性。

卵巢上皮性癌组织中人组织激肽释放酶基因14的表达

目的:检测卵巢上皮性癌组织中人组织激肽释放酶基因14(KLK14)mRNA和蛋白的表达。方法:应用RT-PCR和免疫组化SP法检测正常卵巢、良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤和卵巢上皮性癌组织中KLK14mRNA和蛋白的表达,分析其表达与卵巢上皮性癌患者临床病理特征的关系。结果:卵巢上皮性癌组织中KLK14mRNA的相对表达量(1.36±0.24)高于正常卵巢组织(0.63±0.19)(t=8.432,P<0.001);卵巢上皮性癌组织中KLK14蛋白的阳性表达率为61.4%,与正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤和交界性卵巢肿瘤相比,差异有统计学意义(χ2=21.648,P<0.001)。KLK14蛋白的表达与卵巢上皮性癌的FIGO分期(χ2=5.759,P=0.016)、组织学分级(χ2=4.671,P=0.031)和淋巴结转移(χ2=8.254,P=0.004)相关。结论:KLK14可能参与了卵巢上皮性癌的侵袭和转移。

人组织型激肽释放酶基因对大鼠糖尿病肾病的影响及其机制

目的:探讨人组织型激肽释放酶基因(human tissue kallikrein,HK)对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的影响及其机制。方法:48只雄性Wistar大鼠随机分为普通饲料组(即正常组)和高脂高糖饲料组。高脂高糖饲料组以小剂量链脲佐菌素加高脂高糖饮食诱导2型糖尿病(diabete mellitus,DM)模型,造模后随机分为两组,分别经尾静脉导入重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated viruses,rAAV)介导的HK基因(HK组)以及报告基因beta-半乳糖苷酶(beta-galac-tosidase,LacZ)(LacZ组),观察12周后处死实验动物,留取心、肝、肾等组织。Western blot检测HK在各组织的表达。PAS染色观察肾小球硬化情况,天狼猩红染色观察肾脏纤维化情况。24h尿微量白蛋白(microalbuminuria,mAlb)与尿渗透压检测评定肾功能,免疫组织化学以及Western blot检测肾脏转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达。结果:rAAV介导的HK可在2型DM大鼠的肝脏、肾脏、心脏表达,而且相较于LacZ组且表达增强;PAS染色显示:LacZ组肾脏出现中度的肾小球系膜细胞及基质增生,血管周围间质细胞浸润,血管壁增厚,以及肾小囊滴状病变和毛细血管纤维帽。另外肾小管大量的空泡变性,肾小管腔内出现较多蛋白质管型,HK组较LacZ组明显好转;天狼星红染色显示:LacZ组肾脏间质、血管壁胶原沉积,肾小球细动脉管壁增厚,而HK组病变较轻(P<0.05);24hmAlb排泄量LacZ组比正常组明显增加(P<0.05),HK组较LacZ组排泄量显著下降(P<0.05)。LacZ组与正常组比较,尿渗透压明显下降(P<0.05),HK组较LacZ组显著上升(P<0.05);TGF-β1主要表达于LacZ组的肾小管上皮细胞,HK组较LacZ组TGF-β1明显下调(P<0.05)。结论:HK基因明显改善DN,保护肾功能,原因可能与下调肾脏TGF-β1的表达有关。

汉族人群组织激肽释放酶基因调节区多态性与原发性高血压的关系研究

目的研究中国汉族人群中组织激肽释放酶基因调节区多态性与原发性高血压的关系。方法选择无糖尿病、肾功能障碍和甲状腺功能亢进等疾病的中老年人群(30～70岁),以有无原发性高血压分为高血压组和对照组,采用聚合酶链反应(PCR)技术检测等位基因,基因分型采用等位基因特异性寡核苷酸分析(ASO)。统计分析采用t检验和χ2检验。结果病例组及对照组选择符合哈迪-温伯格定律(高血压组,P=0.313;对照组,P=0.457);发现病例及对照间有9个等位基因存在明显不同(χ2=25.701,P<0.001),其基因型也存在显著差别(χ2=70.100,P<0.001)。结论中国汉族人群组织激肽释放酶基因调节区存在多态性,其基因及基因型在高血压患者和对照人群中的差别提示该位点的基因多态性与高血压的发生存在相关性。

组织激肽释放酶基因多态性A1789G对高血压患者血浆肌酐水平的影响(英文)

目的:探讨组织激肽释放酶基因多态性对高血压患者血浆肌酐水平的影响。方法:用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法对733例高血压患者的组织激肽释放酶基因A1789G多态位点进行基因分型,用线性回归模型分析基因型与血浆肌酐水平之间的关系,用方差分析分析基因型和血压对血浆肌酐水平的交互影响。结果:携带突变型等位基因1789G(基因型AG或GG)高血压患者较携带野生型等位基因A1789(基因型AA)患者的血浆肌酐水平明显升高,且血浆肌酐水平随着血压的升高而升高。结论:组织激肽释放酶基因多态性对高血压患者的血浆肌酐水平产生明显影响,A1789G多态位点是高血压患者血浆肌酐清除率下降的一个危险因素。

人体组织激肽释放酶基因5′端调控序列点突变的检测

目的探讨一种能有效检测组织激肽释放酶基因启动子区点突变的实验技术。方法提取 1 6例外周血的人基因组DNA ,经PCR反应扩增出目标启动子区后 ,与寡核苷酸探针杂交 ,并进行测序 ,比较 2种方法的准确性。结果 1 2例为纯合子 ,无G碱基插入 ;4例杂交结果阳性 ,其中 2例为杂合子 ;2种方法结果吻合。结论与测序法相比 ,本文ASO法经济、简便、灵敏度和准确率高 。

人组织型激肽释放酶基因对2型糖尿病大鼠AMP激活的蛋白激酶活性的影响

目的研究人组织型激肽释放酶(humantissue kallikrein,HK)基因对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的2型糖尿病(diabete mellitus,DM)大鼠AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)活性的影响。方法48只雄性Wistar大鼠随机分为普通饲料组,即正常对照组(n=16),和高脂高糖饲料组(n=32),高脂高糖饲料组大鼠以小剂量STZ加高脂高糖饮食诱导2型DM,再将其随机分为两组,分别经尾静脉导入重组腺相关病毒(recom-binant adeno-associated viruses,rAAV)介导的HK基因(HK组)以及报告基因beta-半乳糖苷酶(beta-galactosidase,Lacz)(Lacz组),观察12周后处死实验动物,留取心脏、肝脏、肾脏等组织。Western blot法检测HK在各脏器的表达以及AMPK的表达及其磷酸化水平(phospho-AMPK)。结果rAAV介导的HK可在2型DM大鼠的肝脏、肾脏、心脏组织表达,且HK组各脏器中HK蛋白表达显著高于Lacz组(均P<0.05)。Western blot检测发现,在肝脏、肾脏、心脏、骨骼肌、脂肪等脏器中,HK组和Lacz组AMPK的表达与正常对照组比较,差异无显著性意义(均P>0.05),而HK组phospho-AMPK较正常对照组显著上调(P<0.05),Lacz组phospho-AMPK与正常对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论rAAV载体介导的HK基因能够激活2型DM大鼠主要器官AMPK的表达。

组织激肽释放酶基因与2型糖尿病关系的研究

目的初步探讨组织激肽释放酶基因调控序列启动子多态性与中国人2型糖尿病的相关性。方法应用PCR技术结合等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO)方法,对30例2型糖尿病患者和40例正常人的组织激肽释放酶基因用A、B、C、D、E、F、H、I、K、P 10种探针检测,比较组间的等位基因频率差异,初步分析该SNP位点与2型糖尿病的关系。结果组织激肽释放酶基因启动子A、B、H、K型在2型糖尿病组中的分布频率分别为46.67%、35.0%、15.0%、3.33%,在对照组中分别为45.0%、37.5%、17.5%、0%,两组比较有差异,但无统计学意义。结论在中国汉族人群中,该位点确实有多态性,A、B、H、K型均有分布,以A型最广。

汉族人群组织激肽释放酶基因调控序列多态性分析

目的 分析组织激肽释放酶基因 5’端启动子区域多态性在四川地区汉族人群中的分布。方法 应同PCR技术结合等位基因特异寡核苷酸片段分析的方法 (ASO)对 13 2例四川地区健康汉族人的组织激肽释放酶基因用十种探针进行检测 ,分析等位基因频率的分布。结果 组织激肽释放酶基因的A、B、C、D、E、H、K、P的频率分别为 2 2 .7%、9.8%、9.8%、3 .0 %、9.1%、2 3 .1%、16.3 %、6.1%。结论 在我国四川地区的健康汉族人群中 ,该位点确实存在多态性。

组织激肽释放酶基因调控序列多态性与高血压关系的初步分析

目的 初步探讨组织激肽释放酶基因调控序列启动子多态性与中国人原发性高血压 (EH)的相关性。方法 应用PCR技术结合等位基因特异寡核苷酸片段分析 (ASO)方法 ,对 40例EH患者和正常人的组织激肽释放酶基因用A、B两种探针检测 ,比较两组间的等位基因分布频率差异 ,初步分析该SNP位点与高血压的关系。结果 组织激肽释放酶基因A、B型在对照组中频率为 65 %、10 % ,在高血压组中频率为 60 %、10 % ,两组比较有差异 ,但无统计学意义。结论 在中国汉族人群中 ,该基因位点确实有多态性 ;A、B两型均有分布 。

血清发育内皮细胞基因-1、组织激肽释放酶结合蛋白对脓毒症患者病情严重程度及预后评估研究

目的探讨血清发育内皮细胞基因-1(Del-1)、组织激肽释放酶结合蛋白(KS)对脓毒症患者病情严重程度及预后的评估价值。方法选取2017年5月至2019年5月东台市人民医院重症医学科收治的120例脓毒症患者为研究对象,根据病情严重程度分为脓毒症组(n=77)和脓毒症休克组(n=43)。另选健康体检者60例为健康组。比较各组血清Del-1、KS差异。采用Pearson相关法分析血清Del-1、KS与序贯器官衰竭评分(SOFA)、急性生理与慢性健康评分(APACHEⅡ)的相关性;应用logistic回归分析脓毒症患者28 d死亡的危险因素;采用受试者工作特征曲线(ROC)分析Del-1、KS对脓毒症患者28 d死亡的预测价值。结果脓毒症休克组及脓毒症组患者的血清Del-1水平均高于健康组,且脓毒症休克组高于脓毒症组患者;脓毒症休克组及脓毒症组患者血清KS水平均低于健康组,且脓毒症休克组低于脓毒症组患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。死亡组患者的血清Del-1水平高于存活组,KS水平低于存活组,差异有统计学意义(P<0.05)。脓毒症患者血清Del-1与SOFA评分、APACHEⅡ评分呈正相关,血清KS与SOFA评分、APACHEⅡ评分呈负相关。ROC曲线显示,血清Del-1及KS联合检测预测脓毒症患者死亡的曲线下面积、敏感度和特异度分别为0.912、0.909和0.771。结论脓毒症患者的血清Del-1、KS是评估脓毒症病情严重程度及不良预后的重要指标,两项联合检测有助于监测、评估脓毒症患者的病情变化及预后,对及时治疗脓毒症患者有指导意义。

人组织激肽释放酶基因应用于高血压治疗的研究进展

人组织激肽释放酶通过缓激肽 B_1、B_2受体引发机体合成前列腺素、NO 和血管舒张因子等增多而引起血压降低。因此组织激肽释放酶及其基因可以应用于高血压治疗。目前应用人组织激肽释放酶基因进行高血压治疗主要从两方面人手:一是应用组织激肽释放酶基因进行高血压基因治疗,存在用药安全及降压效果问题;二是利用组织激肽释放酶基因进行生物工程制药,存在如何量化生产问题。