人组织激肽释放酶6双抗夹心ELISA方法的建立及临床初步应用

目的通过制备的人组织型激肽释放酶6(hK6)单克隆抗体(mAb),建立双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法,并用于胃癌诊断。方法采用该实验室保存的hK6重组蛋白,免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb,经鉴定纯化、酶标记后,建立双抗夹心ELISA方法,检测胃癌患者血清中hK6水平,并联合检测血清中的癌胚抗原(CEA)水平,探讨hK6作为胃癌生物标记的可行性。结果成功建立了检测血清中hK6的双抗夹心ELISA方法,并确定该方法包被抗体的最适浓度为5μg/mL,酶标记抗体的最佳稀释比例为1∶2 000。该方法检测各组血清中的hK6水平,与胃溃疡组hK6水平[(3.59±1.02)ng/mL]和健康体检组hK6水平[(3.35±0.67)ng/mL]比较,胃癌组hK6水平[(5.78±1.66)ng/mL]明显高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05);而胃溃疡组与健康体检组hK6水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。胃癌患者hK6和CEA检测的阳性率分别为69.70%和45.46%,两者联合检测的阳性率为78.79%。结论成功建立了hK6双抗夹心ELISA检测方法;hK6是较好的胃癌血清肿瘤标记物,同时检测hK6与CEA可提高胃癌的检出率,减少漏诊的发生,有助于胃癌的诊断。

人组织激肽释放酶6的原核表达载体的构建及表达

目的:构建人组织激肽释放酶6原核表达系统。方法:采用RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出KLK6基因片段,克隆至原核表达载体pET28b中,经酶切和序列测定后,转化至E.coli BL21,IPTG进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,Ni-NTA亲和层析柱纯化,其纯化产物进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果:pET28b-KLK6原核表达载体构建成功,经IPTG诱导高效表达hK6蛋白,纯化后获得大量高纯度蛋白。结论:成功构建了KLK6的原核表达系统并在E.coli BL21中高效表达,获得高纯度的hK6融合蛋白。

hK6单克隆抗体制备及在胃和乳房肿瘤组织中的初步应用

目的:原核表达人组织激肽释放酶6(human kallikrein 6,hK6),采用杂交瘤技术制备其单克隆抗体,建立免疫组织化学方法,检测hK6在胃癌、乳腺癌组织中的表达情况。方法:通过原核表达hK6融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备特异性单克隆抗体,并用间接ELISA、SDS-PAGE及Western-blot鉴定抗体,protein A agarose亲和层析柱纯化抗体,并以此抗体建立免疫组织化学方法检测人胃癌、乳腺癌组织中hK6表达情况。结果:成功筛选出4株高分泌型特异性杂交瘤细胞株,其制备抗体可与hK6融合蛋白发生特异性结合;免疫组织学显示,hK6主要分布在胃癌细胞胞浆中,成阳性表达,而在癌旁胃黏膜中成阴性表达;在乳腺癌组织中定位于胞浆,成弱阳性表达,癌旁组织成阴性表达。结论:成功制备了高纯度、特异性的抗hK6单克隆抗体;该抗体为深入研究hK6功能和建立高特异性、高敏感性检测组织和体液中hK6的方法奠定基础。

KLK6、KLK10在结直肠癌的表达及与临床病理的关系

目的探讨人组织激肽释放酶家族成员KLK6及KLK10蛋白在结直肠癌发生发展中的作用及与临床、病理的关系。方法采用SP免疫组织化学染色法检测57例结直肠腺癌、21例结直肠腺瘤及11例正常结直肠黏膜组织KLK6及KLK10的表达情况,并分析二者的表达与结直肠癌临床病理指标的关系。结果 KLK6及KLK10在结直肠腺癌的阳性率分别为52.6%(30/57)和66.7%(38/57),在结直肠腺瘤的阳性率分别为33.3%(7/21)和38.1%(8/21),在正常结直肠黏膜组织中的阳性率为9.1%(1/11)和27.3%(3/11)。KLK6及KLK10在结直肠腺癌、结直肠腺瘤及正常结直肠黏膜组织中的表达均具有显著差异(P均<0.05)。KLK6及KLK10的表达均与患者的TNM分期、淋巴结转移及肝转移情况相关(P均<0.05)。KLK6还与肿瘤的分化程度相关(P=0.015)。KLK6及KLK10在结直肠癌的表达呈正相关(r=0.745,P=0.000)。KLK10在KLK6阳性组中的表达明显高于在KLK6阴性组中的表达。结论 KLK6及KLK10参与结直肠癌的发生发展并与结直肠癌的转移相关,可作为较为理想的肿瘤标志物辅助判断患者预后并指导临床治疗。