小檗碱抗人结直肠腺癌的作用及其机制

目的探讨黄连的主要药用成分小檗碱的抗结直肠腺癌的机制。方法不同浓度的小檗碱作用于人结直肠腺癌(HCT-15)细胞后,用显微镜观察人结直肠腺癌细胞的形态学改变;细胞染色方法观察细胞凋亡和自噬;细胞计数分析(CCK-8)检测小檗碱对细胞增殖的影响;免疫印迹法检测小檗碱对人结直肠癌细胞自噬和凋亡相关指标的影响;裸鼠移植瘤模型观察小檗碱的体内抑制肿瘤生长活性。结果显微镜观察结果显示小檗碱作用HCT-15细胞后细胞数量减少、间距增大、皱缩。小檗碱能够抑制HCT-15细胞增殖,对HCT-15细胞增殖的半数抑制浓度(IC_(50))为50μmol/L。免疫荧光和印迹法显示0、50、100μmol/L的小檗碱处理细胞不同时间后,细胞凋亡和自噬对应的标志物明显上升。免疫印迹结果显示小檗碱诱导HCT-15细胞自噬和凋亡从而抑制细胞的增殖。小檗碱诱导细胞自噬和凋亡主要通过激活p38途径。裸鼠实验结果表明小檗碱能够有效缩小体内肿瘤体积,0、10、20 mg/kg的小檗碱的抑瘤率分别为0、32%、74%。结论小檗碱在体外对HCT-15细胞增殖具有明显抑制作用,其机制主要是通过激活p38信号通路促进肿瘤细胞自噬和凋亡,并能有效抑制体内肿瘤的生长。

CRISPR/Cas9介导下构建FN1敲除的DLD1细胞系及初步功能学研究

[目的]利用CRISPR/Cas9技术构建FN1基因敲除的人结直肠腺癌DLD1细胞系,并初步探讨FN1基因敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[方法]根据CRISPR/Cas9技术原理,设计针对FN1基因的crRNA,体外混合crRNA、tracrRNA、Cas9酶,形成核糖核蛋白(即RNP复合物)后转染至DLD1细胞,实现基因编辑。采用二维梯度稀释法挑取单克隆细胞系,使用测序及蛋白质印迹技术(Western Blotting)检测FN1基因敲除情况,通过CCK8、Transwell及划痕实验检测FN1敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[结果]测序结果表明,8号单克隆细胞系在靶点附近缺失1 366个碱基,造成FN1编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞的增殖及迁移能力明显降低。[结论]成功构建DLD1FN1-KO细胞系。初步证实,与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞在第5d增殖水平减慢约40%(P <0.001)、迁移水平减慢约27%(P <0.001)。