罗哌卡因减轻LPS诱导的人结肠上皮细胞系NCM-460凋亡

目的探究罗哌卡因对脂多糖(LPS)诱导的人结肠上皮细胞系NCM-460凋亡和对核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体活性的影响。方法体外培养人结肠上皮细胞系NCM-460,将细胞分组:对照组(control,不干预)、模型组(model,10μg/mL的LPS处理)、低/中/高浓度组(0.5、1、1.5 mmol/L罗哌卡因干预模型组)。然后将细胞分为对照组、模型组、罗哌卡因组(1.5 mmol/L罗哌卡因干预模型组)、罗哌卡因+抑制剂组(1μmol/L NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082干预罗哌卡因组)、抑制剂组(1μmol/L NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082干预罗哌卡因组)和罗哌卡因+激活剂组(1μmol/L NF-κB通路激活剂Prostratin干预罗哌卡因组),干预24 h。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;EdU掺入法检测增殖率、Hoechst 33258染色法检测凋亡率;Western blot检测周期蛋白D1(cyclinD1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、NLRP3和NF-κB通路相关蛋白水平。结果与对照组相比,模型组细胞活力降低,高浓度罗哌卡因组活力升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组细胞炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α浓度、凋亡率和caspase-3、NLRP3、磷酸化(p)-NF-κB蛋白水平上升(P<0.05),增殖率和cycilnD1蛋白水平下降(P<0.05);与模型组相比,罗哌卡因组和抑制剂组IL-6、IL-8、TNF-α浓度、凋亡率和caspase-3、NLRP3、p-NF-κB蛋白水平下降(P<0.05),增殖能力和cycilnD1蛋白水平上升(P<0.05);与罗哌卡因组相比,罗哌卡因+抑制剂组上述指标趋势变化更加显著(P<0.05),罗哌卡因+激动剂组则显著扭转了这些指标趋势(P<0.05)。结论罗哌卡因抑制LPS诱导的NCM-460细胞凋亡,促进增殖,NF-κB通路可能参与起作用。

大鼠结肠上皮细胞分离及培养方法的建立

目的:建立大鼠结肠上皮细胞的原代培养方法,为结肠上皮形态及功能研究提供理想的细胞模型.方法:采用6-15日龄乳鼠,取结肠剪碎、反复清洗后,弃上清,加10 mL、0.1%Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合配制的消化液,37℃消化25 min,分离上皮细胞团;吹打消化液,取上清,加入培养基重悬反复离心3次后,细胞沉淀接种于含100 mL/L胎牛血清的完全培养基中,37℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养.采用差速贴壁法及相差消化法去除成纤维细胞,细胞贴壁长满瓶80%-90%后用2.5 g/L的胰酶消化液消化并传代.结果:成功分离结肠上皮细胞团且活力较高.24 h后可见部分细胞团贴壁,贴壁细胞为多角形,4-8 d逐渐融合成片,呈现明显的"铺路石"样.细胞经传代处理后成纤维细胞明显减少.免疫荧光染色及透射电镜观察鉴定为上皮细胞.冻存处理复苏后细胞状态较佳.结论:通过该法可建立较稳定的大鼠结肠上皮细胞原代培养体系,为结肠上皮生理、病理及药物作用机制提供了体外研究平台.

过表达miR-31对结肠炎模型小鼠TLR4/NF-κB信号通路及凋亡蛋白的调控

目的:探讨miR-31对DSS诱发结肠炎小鼠TLR4/NF-κB信号通路和凋亡相关蛋白的影响。方法:①小鼠结肠炎实验:用1%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发小鼠溃疡性结肠炎(UC)。14只FVB非转基因小鼠随机分为control组(n=6),DSS组(n=8),16只FVB miR-31转基因小鼠随机分为miR-31过表达组(n=8),miR-31过表达+DSS组(n=8),DSS溶于水后通过饮水给予小鼠。DSS组和miR-31+DSS组第一周饮用1%DSS水,第二周饮用正常无菌水,第三周饮用1%DSS水,如此5周后造模完成,之后留取小鼠的结肠组织,通过Western blot和IHC检测小鼠结肠组织NF-κB p65、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白的表达;TUNEL检测小鼠结肠组织细胞凋亡。②细胞培养实验:在人结肠上皮细胞系HCT 116细胞中通过脂质体转染的方法转染miR-31 mimic和inhibitor,使miR-31过表达或敲低,每组均进行三次重复,48 h后收取细胞,通过Western blot检测NF-κB p65、TLR4蛋白的表达。结果:①动物实验中,与control组相比,小鼠结肠组织中DSS组和miR-31过表达组NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平和凋亡细胞指数均显著升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.05或P<0.01);且与DSS组相比,miR-31+DSS组NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平和凋亡细胞指数也显著升高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.01)。②细胞实验中,与control组相比,HCT 116细胞过表达miR-31组的NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),敲低miR-31组的NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:miR-31通过促进TLR4/NF-κB信号通路和介导肠上皮细胞凋亡促进结肠炎的发展。

曲古霉素A通过调控Ku70乙酰化水平对结肠癌HCT116细胞上皮间充质转化和侵袭转移的影响

目的探讨曲古霉素A(TSA)通过调控Ku70乙酰化水平对结肠癌HCT116细胞上皮间充质转化(EMT)和侵袭转移的影响。方法体外培养HCT116细胞,采用MTT法筛选并确定TSA的最佳给药浓度;采用Western印迹(WB)检测对照组(DMSO处理组)和TSA处理组细胞中Ku70及其乙酰化水平以及EMT相关蛋白E-钙黏蛋白(cadherin)、N-钙黏蛋白、Snail和Slug的表达情况;采用Transwell-迁移和侵袭实验观察TSA介导Ku70乙酰化对HCT116细胞侵袭和转移能力的影响。结果 MTT检测结果表明TSA可明显降低HCT116细胞的活性(P<0.05);WB结果显示,TSA可明显上调HCT116细胞中acetyl-Ku70的蛋白水平并抑制其EMT,表现为上调上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白的表达,并下调EMT标志蛋白N-钙黏蛋白及EMT相关转录因子Snail和Slug的表达(P<0.05);此外,Transwell-迁移和侵袭实验结果表明,TSA可明显抑制HCT116细胞的迁移和侵袭(P<0.05)。结论 TSA可能通过上调HCT116细胞中Ku70乙酰化水平,降低Ku70与DNA的亲和力,从而抑制肿瘤细胞DNA的损伤修复能力,发挥抑制结肠癌细胞EMT和迁移侵袭的作用,为临床抗结肠癌转移治疗提供新的思路和作用靶点。

鱼藤素对结肠腺癌HCT116细胞ACL表达、上皮间质化及生物学行为的影响

目的 探讨鱼藤素对结肠腺癌HCT116细胞ACL表达、上皮间质化及增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法 选未加药NCM460细胞作为空白组,通过药物毒性实验检测鱼藤素对人正常结肠NCM460细胞无毒性作用的最大浓度(TC_(0)),将TC_(0)稀释为3个梯度浓度作用于结肠腺癌HCT116细胞为鱼藤素组,设置正常培养HCT116细胞为对照组,另培养HCT116细胞予以白杨素8μmol/L培养设为阳性对照组。通过噻唑蓝(MTT)法、平板细胞克隆形成实验、划痕实验及Transwell小室检测各组细胞增殖能力、克隆能力、迁移能力及侵袭能力;Western blot检测各组细胞中ACL、N钙黏蛋白(N-cadherin)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及Snail蛋白表达。结果 鱼藤素对人正常结肠NCM460细胞TC为40μmol/L,以鱼藤素40μmol/L为最高浓度,梯度递减为10、20、40μmol/L作用于HCT116细胞。与对照组比较,鱼藤素组(10、20、40μmol/L)及阳性对照组细胞增殖抑制率升高,菌落形成率、划痕闭合率、侵袭细胞数均降低(P<0.05);E-cadherin表达升高,ACL、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达降低,且呈剂量依赖型(P<0.05)。结论鱼藤素对结肠腺癌HCT116细胞生物学行为具有明显抑制作用,且降低肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力,其机制可能与降低ACL表达,影响脂质合成,抑制EMT有关。

重组人白介素-11对脂多糖致新生大鼠空肠上皮细胞系-6损伤的影响

目的 探讨重组人白介素-11（rhIL-11）对新生大鼠空肠上皮细胞系-6（IEC-6）增殖和凋亡的影响。方法 通过脂多糖（LPS）作用于正常IEC-6细胞，建立NEC体外模型，为LPS处理组；IL-11治疗组在LPS作用后给予100 ng/mL rhIL-11处理；空白对照组在实验过程中加入等剂量的生理盐水替代。采用MTT比色法选择LPS作用的最佳浓度（5~200 μg/mL）及最佳时间（1~24 h）；MTT 比色法检测rhIL-11 加入后3、6、9和12 h各组细胞的增殖活力；流式细胞术检测各组的细胞凋亡率和坏死率。结果 LPS可降低IEC-6细胞的增殖活力，且根据不同浓度LPS作用于IEC-6细胞不同时间结果，LPS的最佳作用浓度为100 μg/mL，最佳作用时间为3 h。100 ng/mL rhIL-11作用于LPS 处理过的细胞9 h后，IL-11治疗组细胞增殖活力较LPS组显著提高（P〈0．05），与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；且IL-11治疗组的总凋亡和坏死率较LPS处理组降低（P〈0．01），但仍高于空白对照组（P〈0．05）。结论rhlL-11可促进由LPS致IEC-6细胞损伤后的细胞增殖，有助于IEC-6细胞增殖活力的恢复，降低凋亡和坏死率，提示rhIL-11对LPS致IEC-6细胞损伤具有保护作用。

结肠癌细胞微小核糖核酸-200c表达和上皮间质转化与吉非替尼敏感性关系

目的 探讨微小核糖核酸（miRNA）-200c及上皮间质转化（EMT）与结肠癌细胞对吉非替尼治疗敏感性的关系.方法 细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测吉非替尼对4种人结肠癌细胞系HT29、SW620、HCT116、SW480的生长抑制作用；以实时定量PCR法检测4种结肠癌细胞中miRNA-200c,上皮标志物（E-钙黏蛋白）,间质标志物[波形蛋白、具锌指E盒结构的同源异性盒1（ZEB 1）]mRNA水平表达,Western印迹检测E-钙黏蛋白、波形蛋白、ZEB 1蛋白水平表达.外源性上调或下调miRNA-200c表达,观察EMT相关基因表达变化及细胞对吉非替尼敏感性的变化.结果 HT29细胞对吉非替尼最为敏感[半数抑制浓度（IC50）=（7.70±0.31） μmol/I],其miRNA-200c与E-钙黏蛋白表达量均为最高,波形蛋白及ZEB 1表达水平极低；HCT116及SW480细胞系对吉非替尼为中度敏感[IC50=（11.88±0.97）,（16.63士0.45）μmol/L],其miRNA-200c、E-钙黏蛋白呈中等程度表达；SW620细胞系对吉非替尼最不敏感[IC50=（26.43±3.68） μmol/L],miRNA-200c与E-钙黏蛋白表达量最低,波形蛋白及ZEB 1表达量均显著高于其他3种细胞系.外源性上调miRNA-200c表达后,SW620细胞中E-钙黏蛋白表达上调,ZEB 1及波形蛋白表达下调,同时细胞对吉非替尼的敏感性亦显著提高；相反,外源性下调miRNA-200c表达后,HT29细胞中E-钙黏蛋白表达下调,ZEB 1及波形蛋白表达上调,同时细胞对吉非替尼的敏感性显著降低.结论 miRNA-200c可能通过调控EMT,上调E-钙黏蛋白表达,进而影响结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性.

6-姜烯酚对H_2O_2诱导NCM460和HCT116氧化损伤的作用研究

建立结直肠癌细胞氧化损伤模型,加入H_2O_2刺激,通过体外细胞实验研究6-姜烯酚对H_2O_2诱导人正常肠上皮细胞(NCM460)和原位结肠癌细胞(HCT116)氧化损伤的不同作用及可能的分子机制。利用倒置显微镜观察不同浓度6-姜烯酚对H_2O_2诱导NCM460和HCT116后细胞形态的改变。CCK8法筛选6-姜烯酚的浓度区间,并测定细胞存活率。Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测不同分组细胞凋亡。Western-blot检测分析相关凋亡蛋白(Caspase3、PARP1、MCC1、A2F、BCL2)的表达。结果显示,与对照组相比,6-姜烯酚可降低H_2O_2诱导的NCM460中Caspase3、PARP1、MCC1、A2F表达,促进BCL2的表达(p<0.05),具有抗氧化作用,并促进H_2O_2诱导的NCM460增殖(p<0.05),但是在HCT116中。6-姜烯酚却促进Caspase3、PARP1、MCC1、A2F表达,抑制BCL2表达(p<0.05),不同程度加强H_2O_2对HCT116的氧化损伤,抑制细胞增殖(p<0.05)。因此可以得出6-姜烯酚对H_2O_2诱导NCM460及HCT116具有明显不同的相反作用,这一发现可为进一步研究6-姜烯酚抗结直肠肿瘤具体相关机制或通路提供指导意义。

微小RNA-126影响高尔基磷酸化蛋白3在结肠癌中的表达

高尔基磷酸化蛋白3（GOLPH3）在结肠癌组织中高表达,并与肿瘤生物学行为相关[1].本研究旨在探讨微小RNA（miRNA,miR）-126与GOLPH3的关系.一、材料与方法1．材料：结肠癌组织及距离癌缘〉5cm正常结肠上皮组织共10对；结肠癌细胞HCT116。