氟西汀对人结膜上皮细胞TLR2/NF-κB信号通路和炎性因子的影响

目的:观察氟西汀对人结膜上皮细胞Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路和炎性因子的影响,探讨五羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)引起干眼症的潜在机制。方法:将结膜上皮细胞分为空白对照组和药物组,药物组采用氟西汀进行干预。采用CCK-8法明确氟西汀对人结膜上皮细胞半数抑制率作为后续实验浓度。采用RT-PCR法检测TLR2、NF-κB、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的mRNA水平;免疫荧光法和Western blot法检测TLR2和NF-κB的蛋白表达水平;ELISA法检测IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的蛋白表达水平。结果:10^-9~10^-5mol/L范围内氟西汀对结膜上皮细胞具有增殖抑制作用,且具有浓度依赖性。RT-PCR法检测结果显示,氟西汀组TLR2、NF-κB、IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-αmRNA水平均高于空白对照组(P<0.05)。药物组TLR2和NF-κB的累积光密度(IOD)值明显高于空白对照组(P<0.05),提示药物组TLR2和NF-κB蛋白表达量高于空白对照组。Western blot法检测结果显示药物组TLR2和NF-κB的蛋白表达水平均高于空白对照组(P<0.05)。ELISA检测结果显示药物组IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α蛋白表达水平均高于空白对照组(P<0.05)。结论:本研究发现氟西汀可能通过激活结膜上皮细胞TLR2/NF-κB信号通路,促进炎症因子水平,这可能是氟西汀所致干眼症潜在的生物学机制。

MEK/ERK信号通路对人结膜上皮细胞增殖的影响及其机制研究

目的:探讨MEK/ERK信号通路对人结膜上皮细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:采用不同浓度(0、12.5、25、50、100μmol/L)的MEK抑制剂PD98059处理人结膜上皮细胞(HConEpiC),通过CCK-8法检测不同浓度PD98059作用不同时间(0、12、24、48 h)对人结膜上皮细胞增殖的影响,Western blot检测不同浓度PD98059对人结膜上皮细胞ERK1/2、P-ERK1/2表达的影响。结果:相比对照组(0μmol/L),不同浓度(12.5、25、50、100μmol/L)PD98059处理后的人结膜上皮细胞增殖率明显下降,呈剂量-效应关系,且随处理时间增加(12、24、48 h)其抑制作用也显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度PD98059处理人结膜上皮细胞24 h后,其ERK及p-ERK1/2表达随处理浓度增加而降低,与对照组(0μmol/L)相比差异有统计学意义(P<0.05),且二者表达量与细胞增值抑制率均呈显著负相关(r=-0.995、r=-0.968,P<0.05)。结论:PD98059可抑制人结膜上皮细胞增殖,这可能与其下调ERK表达和减少其活化有关。

粉尘螨诱导结膜上皮细胞损伤促进中性粒细胞迁移与中性粒细胞胞外陷阱形成

目的探讨粉尘螨粗提浸液刺激人结膜上皮细胞损伤及诱导中性粒细胞迁移和中性粒细胞胞外陷阱(neutro⁃phil extracellular traps,NETs)形成,从而引起过敏性结膜炎的发病机制。方法采用500、1000、2000、4000 ng/mL粉尘螨粗提浸液刺激人结膜上皮细胞,采用实时荧光定量PCR(quantitative real⁃time PCR,qPCR)和酶联免疫吸附试验(en⁃zyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA)检测人结膜上皮细胞中白细胞介素6(interleukin⁃6,IL⁃6)、肿瘤坏死因子α(tu⁃mor necrosis factor⁃α,TNF⁃α)、γ干扰素(interferon⁃γ,IFN⁃γ)和IL⁃8表达水平。收集人结膜上皮细胞培养上清液,与中性粒细胞共培养,采用Transwell细胞迁移实验检测中性粒细胞迁移数量,采用免疫荧光染色检测NETs标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3,CitH3)表达。采用佛波酯(phorbol 12⁃myristate 13⁃acetate,PMA)刺激中性粒细胞并收集NETs,应用NETs处理人结膜上皮细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用ELISA法检测细胞培养上清中IL⁃6、TNF⁃α、IFN⁃γ和IL⁃8水平。结果2000、4000 ng/mL粉尘螨粗提浸液处理上调人结膜上皮细胞中IL⁃6、TNF⁃α、IFN⁃γ和IL⁃8表达水平;经2000、4000 ng/mL粉尘螨粗提浸液处理后,人结膜上皮细胞培养上清可促进中性粒细胞迁移,诱导MPO和CitH3染色丝状物增加;增加的NETs进一步诱导人结膜上皮细胞凋亡和IL⁃6、TNF⁃α、IFN⁃γ和IL⁃8释放。结论粉尘螨粗提浸液诱导人结膜上皮细胞损伤,从而促进中性粒细胞迁移与NETs形成,而NETs释放进一步加剧人结膜上皮细胞损伤。