干扰素-γ对人结膜下Tenon’s囊成纤维细胞表型转化的干预

目的探讨干扰素-γ(IFN-γ)对人结膜Tenon s囊成纤维细胞(HTCF)表型转化的干预作用。方法4例白内障手术中,取结膜下组织块培养成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。检测未经诱导及经转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导(有或无IFN-γ预处理)后的HTCF表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的情况。结果与未经诱导的HTCF相比较,10ng/mL的IFN-γ能显著抑制HTCF转化为肌成纤维细胞(MF)(P<0.01)。对于经过IFN-γ预处理后再用TGF-β1诱导的HTCF,IFN-γ仅能部分抑制其表达α-SMA。结论IFN-γ能抑制HTCF转化为MF;仅能部分干预TGF-β1诱导HTCF转化为MF的作用。

bFGF不能调节人结膜下Tenon’s囊成纤维细胞表型改变

探讨了碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)能否对人结膜下Tenon’s囊成纤维细胞(humansubconjunctivalTenon’scapsulefibroblast,HTCF)表型改变起诱导作用。在5例白内障手术中取人结膜下Tenon’s囊组织块培养成纤维细胞。用不同浓度bFGF(0、5、10、20ng/ml)诱导HTCF48h。免疫细胞化学技术、蛋白质印记免疫技术检测其平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)表达与正常HTCF有否差异。实验结果表明用不同浓度(0￣20ng/ml)bFGF诱导HTCF48h,虽能明显促进HTCF细胞的生长,但均不能上调细胞内α-SMA的表达。在0￣20ng/ml范围内,体外用bFGF诱导HTCF48h,不能诱导其改变为肌成纤维细胞。

TGF-β_1对Tenon’s囊成纤维细胞增殖和结缔组织生长因子表达的影响

目的研究转化生长因子β1(TGFβ1)对Tenon’s囊成纤维细胞增殖和诱导表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响。方法用MTT法检测不同质量浓度TGFβ1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon’s囊成纤维细胞增殖的影响;免疫细胞化学染色法检测不同质量浓度TGFβ1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon’s囊成纤维细胞诱导表达CTGF的影响。结果GFβ1能够剂量依赖性地促进Tenon’s囊成纤维细胞增殖(P<0.05);TGFβ1能够促进CTGF的表达,有随质量浓度的增加而增强的趋势(P<0.05),但1ng/mL和10ng/mLTGFβ1组之间无统计学差异(P>0.05)。结论GFβ1能够促进Tenon’s囊成纤维细胞增殖,并促进其下游介质CTGF的表达,可能是青光眼滤过术后滤过泡瘢痕形成的重要机制。

重组γ-干扰素作用人Tenons囊成纤维细胞体外研究

目的 体外研究人重组γ－干扰素对人Ｔｅｎｏｎｓ囊成纤维细胞作用。方法 以人Ｔｅｎｏｎｓ囊成纤维细胞作为实验对象，分别加入０．１～１０＾６ Ｕ／ｍｌ人重组γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）、０．００１～１０ｍｇ／Ｌ丝裂霉素（ＭＭＣ）、０．１～１０３ｍｇ／Ｌ５－氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）孵育４８ｈ，然后以ＭＴＴ法进行检测。结果 高浓度和低浓度ＩＦＮ－γ实验组ＯＤ值较对照组升高（Ｐ〈０．０５）。

HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究

目的观察HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的旁观者效应并研究其作用机制。方法将转HSV-tk基因HTFs(HTFs-tk)与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合,加入5μg/m l更昔洛韦作用5 d,MTT法检测对HTFs的杀伤作用;染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯(G JIC)的能力;免疫细胞化学检测Cx43分布;RT-PCR及W estern b lot检测Cx43表达。结果旁观者效应随HTFs-tk/HTFs比例增加而增强,高细胞接种密度组明显强于低密度组;染料通过G JIC传输6级以上;Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达。结论旁观者效应需要细胞间密切接触,Cx43介导G JIC可能是HSV-TK/GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制,HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用。

人Tenon's囊成纤维细胞的离体培养及生长特性观察

目的离体培养人Tenon′s囊成纤维细胞,观察其生长特性。方法将人Tenon′s囊成纤维细胞进行离体培养及生长抑制实验,采用含10%胎牛血清的DMEM培养基,细胞计数法及MTT法描述细胞生长曲线。并通过免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果人Tenon′s囊成纤维细胞离体培养48 h至7 d处于对数生长期。细胞角蛋白染色阴性,波蛋白染色阳性。结论人Tenon′s囊成纤维细胞在体外易于生长,是细胞离体实验研究的良好材料。

特异性转化生长因子-β_2 shRNA对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察转化生长因子-β2(TGF-β2)特异性短发夹RNA(shRNA)对人眼Tenon囊成纤维细胞(TCFs)TGF-β2表达的影响及对人TCFs增生的抑制作用。方法根据小干扰RNA(siRNA)的设计原则,针对TGF-β2基因序列特征构建特异性shRNA载体,转染培养的人TCFs。MTT比色法检测细胞的增生情况;ELISA法检测shRNA对TGF-β2蛋白表达的抑制作用。结果 TGF-β2shRNA转染组的细胞增生及TGF-β2蛋白的表达均受到抑制。转染24、48、72h后MTT比色法检测显示,TGF-β2shRNA转染组培养的Tenon囊的成纤维细胞的增生值分别为0.5426±0.05、0.5210±0.03、0.4055±0.04,明显低于阴性对照组的0.5655±0.03、0.5378±0.03、0.5268±0.04,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义(F组=54.691,P=0.000;Ftime=66.888,P=0.000)。ELISA法检测显示,TGF-β2shRNA转染组TGF-β2蛋白的表达水平下降,24、48、72hTGF-β2蛋白的表达量分别为(543.58±25.32)、(400.26±30.74)、(202.72±23.24)ng/L,明显低于阴性对照组的(659.78±20.95)、(547.45±24.65)、(442.87±17.43)ng/L及空白组的(721.75±30.19)、(756.61±30.19)、(787.60±18.37)ng/L,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义(F组=163.082,P=0.000;F时间=31.498,P=0.000)。结论 TGF-β2特异性shRNA能显著抑制人TCFsTGF-β2的表达,载体介导的TGF-β2特异性shRNA对眼前节术后的抗瘢痕化治疗具有潜在的可能性。

TGF-β1对Tenon囊成纤维细胞增生和HSP47表达的影响

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对人Tenon囊成纤维细胞(HTF)增生和热休克蛋白47(HSP47)表达的影响。方法青光眼患者Tenon囊组织体外培养,用不同质量浓度0.01、0.1、1、5、10ng/mLTGF-β1处理细胞,继续培养24h,用MTT比色法检测吸光度值(A),用免疫细胞化学检测HSP47和Ⅰ型胶原纤维蛋白含量,用实时荧光定量PCR检测HSP47和Ⅰ型胶原mRNA表达。结果TGF-β1能促进HTF的增生(P<0.05),诱导HTF表达HSP47和Ⅰ型胶原纤维蛋白(P<0.05),促进HTF表达HSP47和Ⅰ型胶原纤维mRNA(P<0.05),其作用随TGF-β1质量浓度的增加而增强。结论TGF-β1通过促进HTF纤维增生,诱导下游介质HSP47和Ⅰ型胶原蛋白表达而促进HTF纤维化,可能是青光眼滤过手术后瘢痕形成的重要机制。

环孢素A对人Tenon’s囊成纤维细胞增殖及TGF-β_1分泌的影响

目的 观察环孢素A(CsA)对体外培养的人Tenon’s囊成纤维细胞 (HTFs)增殖及其转化生长因子 β1 (TGF β1 )分泌的影响。方法 以体外培养的人HTFs为实验对象 ,分别加入 0 0 0 1～ 10 μg/mLCsA作用 48h ,细胞计数观察CsA对细胞增殖的影响。收集 0 0 0 1～ 5 μg/mLCsA处理后细胞培养上清液 ,采用ELISA方法检测细胞TGF β1 的分泌量。光镜及透射电镜观察细胞的结构变化。结果 CsA在 0 1～ 10 μg/mL范围内以质量浓度依赖方式抑制人HTFs的增殖 ,IC50 为0 5 5 μg/mL ,并在 0 0 1～ 5 μg/mL范围内刺激细胞TGF β1 的分泌。CsA作用后细胞形态学改变的主要特征为胞浆内大量空泡形成。结论 一定质量浓度的CsA可能通过直接的细胞损伤作用在促进TGF β1 分泌的同时仍显著抑制人HTFs的增殖。

雷帕霉素对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的作用

目的:观察雷帕霉素(rapamycin)对培养的人Tenon′s囊成纤维细胞的增殖及细胞周期的作用。方法:将培养的人Tenon′s囊成纤维细胞用含不同雷帕霉素浓度的培养液培养24 h后,用MTT法测定细胞的增殖情况,用流式细胞仪测定细胞周期的变化情况。结果:用含10、20、40、80和160 ng/ml雷帕霉素的培养液培养细胞时,细胞增殖抑制率分别为9.32%,22.55%,41.42%,42.25%,43.57%。细胞周期分析显示,雷帕霉素(40 ng/ml)作用后,G0/G1期细胞较对照组增多(41.76%vs 44.19%,P<0.05),S期细胞较对照组减少(45.42%vs 40.18%,P<0.05)。结论:雷帕霉素具有抑制人Tenon′s囊成纤维细胞增殖的效果,且随浓度增加抑制作用增强,并将细胞抑制在G1期的限制点内。

EW-7197对TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及机制

目的:探讨ALK5抑制剂EW-7197对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖和迁移的影响及其机制。方法:采用MTS法检测细胞增殖率,并摸索EW-7197最佳的作用浓度和作用时间。之后将细胞分为3个组,分别为正常对照组、TGF-β1诱导组和TGF-β1+EW-7197处理组,采用Transwell小室观察各组细胞迁移情况,采用Western blot检测各组细胞Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平。结果:MTS结果显示,不同处理条件的EW-7197以6.0μmol/L作用24h的细胞增殖率最低(均P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,TGF-β1诱导组的细胞迁移数量为228.0±17.0个/视野,明显高于正常对照组(149.0±15.0个/视野)和TGF-β1+EW-7197处理组(46.0±8.0个/视野)(均P<0.01)。Western blot检测结果显示,TGF-β1诱导组细胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3相对表达量高于正常对照组和TGF-β1+EW-7197处理组(均P<0.001)。结论:EW-7197能够通过TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖和迁移。

TGF-β_2特异性siRNA载体干扰人结膜囊成纤维细胞表达的研究

目的:探讨人转化生长因子TGF-β2特异性siRNA真核表达载体转染人结膜囊成纤维细胞后对其TGF-β2mRNA表达的影响。方法:体外分离并培养人结膜囊成纤维细胞,在培养后传代3次的细胞以TGF-β2特异性siRNA真核表达载体进行转染,并以未转染细胞作为对照。转染后分别于24,48和72h收集细胞,采用RT-PCR技术检测TGF-β2特异性siRNA真核表达载体对TGF-β2mRNA表达的影响。结果:分离的人结膜囊成纤维细胞于接种约4h左右开始贴壁,同时细胞变长成为梭形,表现出明显的成纤维细胞特性,约36h后达到融合状态;RT-PCR结果示:与对照组相比,转染24,48和72h后的细胞TGF-β2表达抑制率分别为17.40%,52.80%和79.20%,抑制效率呈现随时间延长有所加强的趋势。结论:TGF-β2特异性siRNA真核表达载体能抑制人结膜囊成纤维细胞TGF-β2mRNA的表达。

PDTC对大鼠Tenon’s囊成纤维细胞增生及凋亡的影响

目的研究四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯（PDTC）对大鼠Tenon’s囊成纤维细胞增生和凋亡的影响。方法采用组织块法培养sD大鼠Tenon’s囊成纤维细胞（TCFs）。配制PDTC，使其浓度为1×10^-8～1×10^-1mol／L。用MTT比色法和Anexin—V流式细胞检测法分别测定不同浓度PDTC作用24h、72h对大鼠TCFs增生和凋亡的影响。结果MTT结果显示PDTC≥10^-6mol／L，明显抑制TCFs的增生；Anexin—V／PI流式检测结果显示，PDTC1×10^-5～1×10^-2mol／L组药物作用72h早期凋亡率较对照组升高，PDTC各组死亡率存在浓度依赖性。结论在一定的药物浓度下．PDTC能抑制大鼠Tenon’s囊成纤维细胞增生并促进细胞凋亡。

原代人眼Tenon’s囊成纤维细胞的生物学特性及体外培养方案优化

目的优化原代人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)体外分离、培养的实验方法,并对体外培养的HTFs的生长特性进行观察。方法采用优化的组织块贴壁法培养原代HTFs;倒置显微镜观察HTFs的基本形态特征;免疫荧光染色Vimentin及Cytokeratin对所培养的原代细胞进行鉴定;采用噻唑蓝比色试验检测细胞增殖活性及生长曲线;流式细胞术检测细胞周期及增值指数。结果组织块贴壁后4~7 d可以见长梭形细胞长出,2~3周后可传代。细胞生长曲线近似“S”形,MTT法显示在第3~5 d细胞增殖能力显著。免疫荧光染色Vimentin阳性率达98%,Cytokeratin阴性,符合HTFs特性且无上皮细胞污染。第3~4代HTFs中(63.48±10.22)%处于G0/G1期,(10.80±5.07)%处于G2/M期,(24.34±8.07)%处于S期,HTFs的增殖指数为35.6%,细胞增殖良好。结论建立了一种简单、经济、有效的获取原代人Tenon’s囊成纤维细胞的方法,为研究青光眼滤过泡瘢痕化提供了可靠的靶细胞模型。

As_2O_3对结膜囊成纤维细胞中Bcl-2表达及其对Fb凋亡的影响

目的探讨三氧化二砷(As_2O_3)对结膜囊成纤维细胞中Bcl-2表达及其对成纤维细胞(fibroblast,Fb)凋亡的影响。方法取健康哈白兔,麻醉后无菌条件下取兔眼结膜下Tenon’s囊组织进行Fb的培养,实验组用5、10μmol/L的As_2O_3分别处理24、48 h,对照组加同体积的生理盐水,免疫荧光显微镜下观察Fb细胞核的凋亡,记录不同浓度及作用时间下的凋亡指数,并采用Western blot蛋白印迹法检测Bcl-2的表达。结果对照组的Fb细胞核呈现浅蓝色,染色质疏松且均匀;实验组的Fb细胞核出现凋亡小体且呈现亮蓝色,细胞核萎缩、凝聚,部分出现断裂。随着As_2O_3剂量的加大及作用时间的延长,凋亡小体的细胞数增多明显,差异有统计学意义(P<0.05),且凋亡细胞数出现剂量及时间依赖关系(r=10.235,r=8.330,P<0.05)。As_2O_3处理后的Fb细胞,其Bcl-2的蛋白表达降低明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 As_2O_3可诱导结膜囊成纤维细胞发生凋亡,且其诱导凋亡作用存在一定的剂量和时间依赖性;凋亡与下调Bcl-2的表达,激活Caspase-3有关。

大鼠结膜囊成纤维细胞TGFβ_2特异性siRNA的筛选及其载体构建的研究

目的筛选结膜囊成纤维细胞转化生长因子β2(TGFβ2)特异性siRNAs,并构建其载体。方法采用体外转录法合成4个TGFβ2siRNAs(L1、L2、L3、L4),分别转染体外培养的大鼠Tenon’s囊成纤维细胞,以未转染细胞作为对照,转染后48h采用RT-PCR技术检测所合成的siRNAs对TGFβ2mRNA表达的干扰作用;在此基础上,再构建有干扰作用siRNA的载体。结果与对照组相比,转染48h后,仅L4能够使大鼠Tenon’s囊成纤维细胞TGFβ2的mRNA表达水平明显下调,其余3条TGFβ2siRNAs未产生明显的干扰效果。经过测序检测证明成功构建了有干扰效果TGFβ2siRNA的载体。结论不同的TGFβ2siRNA对大鼠Tenon’s囊成纤维细胞TGFβ2mRNA表达具有不同的干扰效能;能够构建出有干扰效能的TGFβsiRNA特异性载体。

紫杉醇对TGF-β_1促人Tenon’s囊成纤维细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)促人Tenon’s囊成纤维细胞(human Tenon’s cap-sule fibroblasts,HTFs)的增殖作用及紫杉醇对该增殖作用的影响。方法:用TGF-β1(0～50 ng/ml)作用于体外培养的HTFs,CCK-8法检测其增殖;用紫杉醇(0～10 000 nmol/L)作用于HTFs 2～24 h,Hochest 33342染色检测其凋亡。结果:2.5～25.0 ng/ml TGF-β1作用2～24 h均可以促进HTFs增殖,10～10 000 nmol/L紫杉醇能抑制TGF-β1促HTFs的增殖作用,其抑制作用与浓度成正比;Hochest 33342染色证实10～10 000 nmol/L紫杉醇对于增殖的HTFs有促凋亡的作用并与浓度成正比。结论:TGF-β1可刺激HTFs增殖,紫杉醇可抑制TGF-β1促HTFs的增殖作用,可以促进细胞的凋亡。

吡非尼酮通过下调TGF-β/Smad通路中TGF-β3的表达抑制兔Tenons囊成纤维细胞增殖

目的探讨吡非尼酮在抗青光眼滤过术后抑制瘢痕形成的可能机制。方法体外培养兔眼Tenons囊成纤维细胞(RYTF);设计6组不同浓度的吡非尼酮作为实验组、1组未加入吡非尼酮的作为对照组及1组调零组,采用CCK-8检测法初步确定吡非尼酮的起始作用浓度及最适作用浓度;采用免疫荧光法检测经起始、最适作用浓度吡非尼酮作用后RYTF中TGF-β3,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白与对照组相比的荧光染色表达情况;通过Western blot法检测经起始、最适作用浓度吡非尼酮作用后TGF-β3,CollagenⅠ、CollagenⅢ因子与对照组相比的蛋白表达情况;通过RT-PCR法检测经起始、最适作用浓度吡非尼酮作用后TGF-β3、CollagenⅠ、CollagenⅢ与对照组相比的mRNA表达变化。结果吡非尼酮抑制RYTF增殖的起始作用浓度和最适作用浓度分别为0.1 mg和0.27 mg;与对照组相比,经起始、最适作用浓度吡非尼酮作用24 h后,实验组RYTF中TGF-β3、CollagenⅠ、CollagenⅢ的荧光表达均少于对照组(P<0.05);与对照组相比,经起始、最适作用浓度吡非尼酮作用24 h后,实验组RYTF中TGF-β3、CollagenⅠ、CollagenⅢ的蛋白表达量均少于对照组(P<0.05);与对照组相比,经起始、最适作用浓度吡非尼酮作用24h后,实验组RYTF中TGF-β3、CollagenⅠ、CollagenⅢ的基因相对表达量均少于对照组(P<0.05)。结论吡非尼酮对体外培养RYTF增殖有明显抑制作用,且呈浓度依赖关系;吡非尼酮抑制RYTF增殖的机制可能是通过影响RYTF中TGF-β/Smad途径上TGF-β3效应因子的基因和蛋白表达。

人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究

目的探讨体外培养原代人眼Tenon’s囊成纤维细胞的方法及其生长特性,为抗纤维化研究提供靶细胞模型。方法取翼状胬肉及斜视手术患者的Tenon’s囊组织,用组织块法培养原代成纤维细胞。用免疫荧光方法鉴定细胞。对细胞进行传代、冻存和复苏的观察。对复苏后的细胞行MTT法检测其活力并绘制生长曲线。结果人眼Tenon’s囊成纤维细胞可以在体外用组织块方法培养出来,呈典型的长梭形。免疫荧光鉴定细胞波形蛋白染色阳性。细胞多次传代后依然生长迅速,3 d即可长满瓶底。复苏后细胞2~6 d处生长对数期,增殖能力良好。结论人眼Tenon’s囊成纤维细胞体外生长状态良好,可以液氮冻存,复苏后细胞活力较强,可以用于抗纤维化增生的基础研究。

大鼠Tenon’s囊成纤维细胞体外培养及生长特性的研究

目的 探讨建立体外大鼠Tenon’s囊成纤维细胞的培养方法，并对体外培养的Tenon’s囊成纤维细胞的生长特性进行观察。方法 选用健康年幼的SD大鼠40只，采用断颈法将其处死，摘除眼球，无菌条件下，分离剪下Tenon’s囊组织，采用植块法对Tenon’s囊成纤维细胞进行体外培养；通过细胞形态学观察和细胞免疫组化染色技术对其细胞性质进行鉴定；通过细胞记数和MTT法对其生长特性进行研究。结果 原代培养的大鼠Tenon’s囊组织块接种后，约48h即可见细胞由组织块中爬出，培养8～10d，细胞汇合程度大约可达70％左右；培养14～16d，细胞完全汇合；在细胞汇合程度达到70％-80％时，可以进行细胞传代，传代细胞接种后4—5h大部分细胞贴壁，10-12d左右传代细胞完全汇合。光镜下观察，可见Tenon’s囊成纤维细胞，在汇合程度低时细胞呈细长梭形外观，汇合程度高时细胞可呈多边形改变。免疫组化染色可见Tenon’s囊成纤维细胞角蛋白染色阴性，波蛋白染色阳性。细胞生长曲线显示，在2—8d细胞处于对数生长期。结论 体外成功地培养了大鼠Tenon’S囊成纤维细胞，这不仅为青光眼滤过泡瘢痕化防治的基础研究提供了一种新的细胞来源，同时为抗结膜瘢痕化药物的研究和开发提供了一种新的简便实用的细胞来源途径。