CXCR4趋化因子拮抗剂AMD3100对人羊水干细胞抑制作用的体外实验研究

目的通过体外实验研究CXCR4趋化因子拮抗剂AMD3100对人羊水干细胞(h AFSC)的影响。方法羊水干细胞分为对照组(PBS处理)和实验组(AMD3100处理10μg/L)。采用Transwell小室分析细胞迁移力,MTT法检测AMD3100对hAFSC存活的影响,明胶贴壁法测定AMD3100对hAFSC细胞粘附能力影响。结果对照组和实验组hAFSC迁移细胞数分别为80. 35±3. 70和36. 50±3. 66,粘附细胞数分别为31. 48±3. 21和11. 41±1. 89,存活细胞OD值分别为0. 91±0. 04和0. 36±0. 02,实验组均显著低于对照组,差异均有显著性(P <0. 05)。结论 AMD3100在体外实验中抑制羊水干细胞的迁移、粘附和存活,其作用机制可能涉及SDF-1/CXCR4。

人羊水来源间质干细胞的鉴定及其免疫调节功能和相关机制研究

目的:从人羊水组织中体外培养获得间质干细胞,并探讨其免疫调节能力和相关的调节机制。方法:收集人羊水组织,采用贴壁培养的方法扩增和传代。检测羊水来源的间质干细胞的体外分化能力,并检测其免疫调节能力,同时检测颗粒酶B在人羊水来源间质干细胞中的表达情况,并通过特异性抑制剂阻断方法验证颗粒酶B在其免疫调节中的作用。结果:人羊水来源间质干细胞具有多向分化能力和免疫调节活性,并通过表达颗粒酶B的方式参与其免疫调节功能。结论:体外培养获得了具有免疫调节功能的人羊水来源的间质干细胞,颗粒酶B途径可能是一种新发现的间质干细胞免疫调节方法。

人羊水干细胞的分离培养及鉴定

目的:分离培养人羊水干细胞(hAFSC)并鉴定。方法:使用贴壁法分离培养羊水干细胞,细胞免疫荧光法和Western blot鉴定hAFSC。结果:分离的羊水干细胞均表达特异性标记物Oct-4、c-kit、SSEA-4、CD105。结论:成功分离及培养hAFSC,可作为种子细胞用于干细胞移植治疗肝纤维化。

人羊水中肺表面活性物质相关蛋白A的提纯及生物活性分析

目的 从人羊水中提取和纯化肺表面活性物质相关蛋白Ａ（ＳＰ－Ａ）。方法 收集１１例产妇的羊水共４０００ｍｌ，采用 萃取和透析的方法提纯人羊水中ＳＰ－Ａ并测定其生物学活性。结果 获得 ＳＰ－Ａ １２ ｍｇ（共 ２０ ｍｌ）；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，提纯 后的ＳＰ－Ａ的相对分子质量为 ３１ ０００，只显示１条条带；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ也显示１条特异性反应条带；将其加入人工合 成的磷脂中表现为表面活性明显增加，γｍｉｎ由７．７±０．３降至１．５±０．２２。结论 用萃取和透析方法能较好地提纯ＳＰ－Ａ．且纯 度较高，并能较好地保持其生物活性。

利用人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化模型建立体外神经毒性测试的实验研究(英文)

目的许多药物具有神经毒性,尤其是对于儿童的影响更大。目前常用的药物体内毒性实验既耗时又昂贵。人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化有望建立一种理想的用于评价药物神经毒性的体外评估系统。此项研究旨在利用红藻氨酸的神经毒性验证此系统的可行性。方法单层贴壁状态下,人胚胎干细胞和人羊水干细胞在化学成分明确的诱导条件下向神经细胞诱导。这些细胞经神经细胞特异性的抗体染色证实其特性。诱导得到的神经细胞在不同浓度红藻氨酸的培养液中进行培养和扩增,每代细胞进行计数,绘制细胞的生长曲线。结果人胚胎干细胞和人羊水干细胞均可被高效地诱导为神经细胞;人胚胎干细胞的神经诱导效率高于人羊水干细胞;红藻氨酸对诱导得到的神经细胞具有毒性,其浓度与毒性呈正相关。结论人胚胎干细胞和人羊水干细胞的体外神经分化可作为用于评价药物神经毒性的体外评估系统。

人羊水干细胞移植治疗肝硬化大鼠的实验研究

目的了解人羊水干细胞(hAFSC)移植对四氯化碳诱导肝硬化大鼠的治疗作用。方法使用贴壁法分离培养羊水干细胞,Western blot鉴定。Wistar大鼠24只随机分为对照组8只和肝硬化组16只,肝硬化组皮下注射四氯化碳植物油,7周后再随机分为肝硬化模型对照组(注射等体积PBS,n=8)、hAFSC移植组(n=8)。直接经肝内注射hAFSC,3周后处死所有大鼠,收取血样进行生化检查,肝组织石蜡切片进行病理学分析。结果分离的羊水干细胞均表达特异性标记物Oct-4、SSEA-4。与大鼠肝硬化模型组比较,hAFSC移植组血清Alb明显升高,ALT、AST显著降低。肝硬化程度明显减轻,假小叶附近脂肪化细胞减少,肝组织中胶原纤维的量明显减少。结论 hAFSC肝内移植可减轻大鼠肝硬化病变程度,改善肝功能。

人羊水干细胞移植改善肝硬化大鼠的肝纤维化

目的研究人羊水干细胞(hAFSC)移植对CCl4诱导性肝硬化大鼠的改善。方法使用贴壁法分离培养羊水干细胞,Western blot法鉴定。Wistar大鼠24只随机分为对照组(n=8)和肝硬化组(n=16),肝硬化组采用60%的CCl4植物油皮下注射7周,制造肝硬化模型,再随机分成肝硬化模型对照组(注射等体积PBS,n=8)、hAFSC移植组(n=8)。直接经肝内注射hAFSC,3周后处死所有大鼠,肝组织石蜡切片进行病理学分析。结果分离的羊水干细胞均表达特异性标记物Oct-4、SSEA-4。与大鼠肝硬化模型组比较。肝硬化程度明显减轻,假小叶附近脂肪化细胞和肝组织中胶原纤维的量明显减少。结论 hAFSC肝内移植可减轻大鼠肝硬化病变程度。

超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察超低温冻存对人羊水间充质干细胞(AF-MSC)生物学特性的影响。方法通过羊膜腔穿刺取得人孕16～23周羊水,分离培养出人AF-MSC。将第4代人AF-MSC经短期超低温冻存、复苏后,通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能测定、细胞周期分析及细胞表面抗原检测,观察超低温冻存对人AF-MSC生物学特性的影响。结果第4代人AF-MSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞表面抗原的表达等方面均无显著性差异(P>0.05)。结论短期的超低温冻存对人AF-MSC的生物活性无明显影响。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞

背景:以间充质干细胞为载体的基因治疗新方法具有广阔的应用价值。目的:利用慢病毒感染方法将肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体导入人羊水来源的间充质干细胞,以期获得稳定表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的人羊水间充质干细胞。方法:首先利用多位点Gateway技术构建慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,将该表达载体与慢病毒包装质粒同时转染293FT细胞,从而获得携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒颗粒。利用重组慢病毒颗粒感染人羊水间充质干细胞,并通过抗生素筛选的方法获得稳定表达目的基因-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的羊水间充质干细胞,并对其稳定性进行鉴定。结果与结论:酶联免疫吸附法和Westernblot检测结果表明,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在感染的人羊水间充质干细胞内呈高表达,其表达量可达到72μg/L。说明实验成功制备了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体修饰的人羊水间充质干细胞。

人羊水肺表面活性物质治疗新生儿肺透明膜病

作者用人羊水肺表面活性物质(PS)治疗一例肺透明膜病取得成功。PS剂量为150mg磷脂/kg,从气管插管一次滴入。临床症状,经皮测氧(TcPO_2)和吸入氧浓度(FiO_2)24h后明显好转,气道吸出物中的卵磷脂/鞘磷脂(L/S)比值、磷脂酰甘油(PG)和最低表面张力(γmin)逐渐恢复。肺部X线片原示毛玻璃样改变,PS治疗后3d明显改善,第6天病情基本恢复,最后痊愈出院。

人羊水来源干细胞的体外培养及其生物学性状分析

目的:体外分离培养人羊水来源干细胞(hAFSC),观察分析其基本的生物学性状。方法:取孕中期产前诊断所抽取的羊水,离心收集细胞,然后贴壁培养获得hAFSC。在细胞培养的基础上,观察hAFSC的形态;研究其增殖能力;用流式细胞术测定细胞周期及不同代次细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)表达率的变化;利用RT-PCR方法检测细胞干性基因的表达;利用诱导培养基诱导,检测其向肝样细胞与成骨细胞分化的潜能。结果:在体外培养条件下,hAFSC表现为成纤维细胞形态;具有良好的增殖能力,群体倍增时间约为36 h;细胞周期检测G0/G1期细胞约占86.7%,S+G2/M期细胞约占13.3%;流式细胞术检测结果表明,hAFSC表达SSEA-4,且SSEA-4阳性率随传代次数呈现先上升后下降的趋势;hAFSC在mRNA水平上表达Nanog、Oct4和Rex1等胚胎干细胞标志性基因;经诱导培养基诱导后,hAFSC可以向肝样细胞与成骨细胞分化。结论:hAFSC是一群呈成纤维细胞样,有良好增殖能力,且具有多向分化潜能的细胞,加之其来源方便,伦理学限制较少,因此在细胞治疗及组织工程等方面有着广泛的应用前景。

人羊水、脐带、胎盘来源间充质干细胞体外增殖、分化、运输和免疫学特性的比较

背景:随着再生医学推进,干细胞在疾病治疗中的使用频率逐步增高。目前在临床使用中,细胞数量、分化能力、异体接种时产生免疫排斥的可能性等因素都需要考虑,因此筛选出更适合临床使用的细胞种类显得十分有意义。目的:比较人羊水、脐带、胎盘来源间充质干细胞的体外增殖能力、分化能力、运输液中细胞活性、免疫学特性,为临床应用提供选择依据。方法:分别对3种细胞进行分离培养和免疫荧光鉴定,在体外诱导3种细胞成骨、成脂、成神经分化;q PCR检测成神经分化后的Nestin、NT-3、MANF表达量;流式细胞术定量分析HLA-ABC、HLA-DR的表达量;将3种细胞放于细胞运输液内常温放置24,48,72 h,计算活细胞数量。结果与结论:(1)脐带间充质干细胞成脂能力最强,胎盘间充质干细胞成骨能力最好,3种细胞均可以表达神经细胞标志Nestin和GFAP;(2)成神经诱导后的胎盘间充质干细胞高表达NT-3,脐带间充质干细胞高表达MANF,分别可以用于不同类型的神经损伤修复;(3)羊水干细胞低表达HLA-ABC,不表达HLA-DR,更适合异体接种,产生免疫排斥的可能最低;(4)细胞运输液内储存72 h后羊水干细胞的存活率最高;(5)由于羊水、胎盘、脐带间充质干细胞在生物学特性上稍有差异,因此可根据其特点用于不同临床疾病治疗。

卵泡液微环境对人羊水干细胞体外分化为雌性生殖细胞的影响

目的观察不同直径猪卵泡内卵泡液诱导人羊水干细胞(human amniotic fluid stem cells,hAFSCs)-070607株向雌性生殖细胞分化的效果。探讨卵泡内微环境对体外雌性生殖细胞形成的影响。方法选取不同直径猪卵泡内的卵泡液(S组:直径<3 mm、M组:直径3~6 mm、L组:直径>6 mm),检测卵泡液内雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)的含量及骨形态发生蛋白15(BMP15)的表达。将不同分组卵泡液添加到雌性生殖细胞分化体系中,经过5 d的体外诱导培养,观察生殖细胞基因OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和甲基化基因DNMT3B的表达变化。继续用M组卵泡液诱导hAFSCs-070607,观察基因及蛋白表达的变化。结果通过基因、蛋白和三胚层分化的检测,确定hAFSCs-070607具有良好的多能性及分化潜能。3组不同直径的卵泡液内都含有FSH,但不含E2;BMP15的未成熟蛋白在M组中的含量略高于S、L组。M组添加到诱导分化培养基后,E2的产量较高,生殖相关标记基因检测结果发现,OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和DNMT3B基因的表达依次按照大、中、小卵泡组上升。继续用M组卵泡液诱导hAFSCs-070607,诱导10d后,有卵母细胞样细胞(oocyte-like cells,OLCs)和卵泡样结构的出现,经EGFP-BMP15转染后,这些结构显示EGFP表达阳性,表明有OLCs的产生。荧光定量PCR结果证实,生殖细胞形成相关基因OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和表观学基因DNMT3B的表达逐渐呈上升的趋势。经细胞免疫荧光技术检测发现,生殖相关蛋白OCT4、FRAGILIS和SCP3呈阳性表达。结论hAFSCs-070607株人羊水干细胞具有良好的多能性和体外分化潜能,经猪卵泡液体外诱导分化后,可分化为雌性生殖细胞,且M组卵泡液诱导后细胞分泌的E2高于S组和L组。长时间诱导后,生殖细胞相关基因和蛋白上调,并能形成卵泡样结构。

表达肝细胞生长因子的人羊水干细胞培养上清对大鼠神经元突起生长的影响

目的:研究过表达肝细胞生长因子(HGF)的人羊水干细胞(hAFSCs)上清对大鼠背根节(DRG)神经突起生长的影响。方法:从人羊水中收集贴壁细胞,通过形态学、核型分析、细胞表面标记分子等手段鉴定hAFSCs。将hAFSCs通过慢病毒感染得到过表达HGF的HGF-hAFSCs,收集hAFSCs、HGF-hAFSCs培养上清液离心过滤后,用于DRG组织块的体外培养,比较hAFSCs上清液组(hAFSCs)、HGF-hAFSCs上清液组(HGF-hAFSCs)和单纯培养液对照组(Control)对DRG神经突起生长的影响。结果:从人羊水中获得的细胞为hAFSCs,其核型正常,表达CD29、CD73、CD90和CD105,不表达CD34和CD45。慢病毒感染72 h后,感染效率约为80%;经嘌呤霉素筛选,获得过表达HGF的hAFSCs。实时荧光定量PCR结果显示,HGF-hAFSCs组与hAFSCs组的细胞相比,HGF mRNA表达有显著性增加(P<0.001);ELISA结果显示,HGF-hAFSCs上清液中HGF的浓度为3.44 ng/ml,而hAFSCs组上清液未检测到,两组有显著性差异(P<0.001)。DRG组织内神经突起长度测量显示,hAFSCs组突起为(251.60±7.94)μm,对照组突起为(52.74±6.77)μm,而HGF-hAFSCs组突起较前两组都显著增加(P<0.001),为(306.57±10.65)μm。结论:利用hAFSCs过表达HGF有助于DRG神经的突起生长,为神经损伤提供了一种新的治疗方案。

人羊水间充质干细胞及其分泌的细胞因子对急性肝损伤小鼠的治疗潜能

【据《GUT》2012年6月报道】题：人羊水来源的一类特殊的间充质干细胞及其分泌的细胞因子对急性肝损伤小鼠的治疗潜能（作者Zagoura DS等）人脐带间充质干细胞的治疗潜能吸引了越来越多人的目光,尤其是在通常由药物或病毒感染引起的急性肝损伤（AHF）中。在早期的研究中,研究者基于表型、多向分化潜能等特性,从中期妊娠的羊水中分离出一种特殊的梭状间充质干细胞，称为second trimester amniotic fluid（AF-MSCs）。

人羊水间充质干细胞对膜性肾病大鼠的治疗作用

目的研究人羊水间充质干细胞(AF-MSC)对膜性肾病大鼠的治疗作用。方法24只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(Control组)、模型组(Model组)和AF-MSC治疗组(AF-MSC组),每组8只。在模型组和AF-MSC组注射羊抗大鼠Fx1A抗体构建膜性肾病大鼠模型。造模成功后连续4周尾静脉注射AF-MSC;每周检测大鼠尿蛋白/肌酐比值(UPCR);治疗结束后,腹主动脉取血检测血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC);肾脏组织切片经马松(Masson)和过碘酸-六胺银(PASM)染色,光镜下观察病理变化;透射电镜观察足细胞和基底膜结构变化;免疫荧光测定各组肾脏组织中IgG、膜攻击复合物C5b-9表达。免疫组织化学观测足细胞nephrin、podocin表达。结果与模型组相比,AF-MSC治疗组UPCR在第4周时显著下降(P<0.01)。血清白蛋白升高和胆固醇下降(均P<0.05);病理结果显示肾小球基底膜免疫复合物沉积减少,基底膜增厚程度减少,足细胞形态相对完好;免疫荧光结果显示IgG和C5b-9沉积减弱;免疫组化结果显示AF-MSC组足细胞中nephrin及podocin蛋白表达增强(P<0.01)。结论AF-MSC可以明显改善膜性肾病大鼠的肾脏损伤。

人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。

Transwell 3-D联合共培养促使人羊水克隆样细胞来源干细胞向肝样细胞分化的研究

目的 探讨Transwell 3-D联合共培养促使人羊水克隆样细胞来源干细胞向肝样细胞分化的可能性.方法 利用克隆杯,从人孕中期羊水标本中分离获得人羊水克隆样细胞来源干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原进行鉴定.利用Transwell小室联合共培养肝细胞诱导其向肝样细胞分化,观察诱导后细胞形态的变化,利用细胞免疫荧光检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）和细胞角蛋白-18（CK-18）在诱导后细胞中的表达,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝细胞相关基因的表达.结果 利用克隆杯分离出的人羊水克隆样细胞来源干细胞CD44和CD90表达阳性,CD10、CD14、CD34、CD45和人类白细胞抗原DR基因（HLA-DR）表达阴性.诱导2～4周后,肝样细胞出现,检测证实这些细胞表达AFP、ALB、CK-18、GATA结合蛋白-4（GATA4）、肝细胞核因子（HNF）-1α和细胞色素20A（CYP20A）等肝细胞相关标志和基因.结论 Transwell 3-D联合共培养可以促使人羊水克隆样细胞来源干细胞向肝样细胞分化.

人羊水来源c-kit^+间充质干细胞的生物学特征和心肌诱导分化

目的探讨人羊水来源c-kit^+间充质干细胞(c-kit^+human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells,c-kit^+HAFMSCs)的生物学特征及心肌诱导分化能力。方法通过产前诊断或自愿引产获取50份孕中期羊水标本,经流式细胞仪分选c-kit^+HAFMSCs,MTT法观察细胞增殖情况,并通过流式细胞仪、细胞免疫化学染色观察行细胞表型鉴定。在体外经成骨及成脂诱导分化,于诱导培养后21 d采用yon Kossa染色观察钙沉积颗粒,油红O染色观察脂滴形成情况。实时荧光定量PCR检测细胞经5氮-2'脱氧胞苷心肌诱导前后,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达情况。结果经流式细胞仪分选,人孕中期羊水中c-kit^+HAFMSCs含量约为贴壁细胞的3.07%±1.03%;体外增殖迅速,表达MSCs表面标志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45;农达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-ABC,不表达HLA-DR。细胞免疫化学染色示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Oct-4染色呈阳性,CD34、CD45染色呈阴性。MTT检测示第5、10、15代c-kit^+HAFMSCs具有相似的生长曲线。成骨和成脂诱导培养后21 d,细胞内有钙盐沉积和脂滴形成。实时荧光定量PCR检测示,心肌诱导后14 d,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达均较诱导前明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过流式细胞仪分选的c-kit^+HAFMSCs在体外可以诱导分化为心肌样细胞,可能成为心肌再生性治疗的种子细胞。

人羊水间充质干细胞治疗肿瘤的临床研究进展

人羊水间充质干细胞(Human amniotic fluid derived mesenchymal stem cells,AF-MSCs)是一类具有高度增殖、自我更新和多项分化潜能的干细胞,即使经过多次传代其生物学特性也不会发生改变。有研究表明,AF-MSCs具有免疫原性低、不成瘤性和肿瘤细胞亲嗜性等特点,而且能够迁移到肿瘤病灶。因此,AF-MSCs作为转运载体介导药物靶向治疗肿瘤具有潜在的优势。同时,通过羊膜腔穿刺获得羊水有利于避免胚胎干细胞研究有关的伦理问题,可作为一种理想的治疗方法。本文通过回顾、总结人羊水间充质干细胞的研究进展,展望人羊水间充质干细胞治疗肿瘤的应用前景。