日本血吸虫胞外囊泡的提取、鉴定及对人肝星状细胞影响的初探

旨在探讨日本血吸虫(Schistosoma japonicum)胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)的提取方法及特性。本研究利用尺寸排阻法收集Sj EVs,通过透射电镜、蛋白质谱对Sj EVs的形态学、蛋白谱进行解析并对鉴定到的蛋白进行生物信息学分析。将PKH67绿色荧光标记的Sj EVs与人肝星状细胞LX-2共孵育,观察细胞摄取Sj EVs的情况,并对细胞中虫源miRNAs及细胞内纤维化因子进行检测,初步探讨Sj EVs对肝星状细胞的影响。结果表明:Sj EVs呈圆形或椭圆形囊泡结构,内含EVs标志蛋白。生物信息学分析结果显示,Sj EVs蛋白可能与细胞进程、代谢等途径密切相关。Sj EVs与人肝星状细胞LX-2共孵育结果显示,LX-2细胞可成功摄取Sj EVs,且定量反转录PCR(RT-qPCR)结果显示LX-2细胞中部分虫源miRNAs显著升高,纤维化因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原纤维α1(Collagen typeⅠalpha 1,Col1α1)和Ⅲ型胶原纤维α1(Collagen typeⅢalpha 1,Col3α1)极显著升高,提示肝星状细胞活化。综上,本研究为解析Sj EVs在宿主肝纤维化中的作用提供了依据,为进一步探究Sj EVs的潜在功能奠定了基础。

铁死亡参与无机砷致人肝星状细胞活化的研究

目的研究亚砷酸钠(NaAsO 2)对人肝星状细胞(LX-2)铁死亡的影响。方法体外培养LX-2细胞,采用成组设计将不同浓度NaAsO 2(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L)染毒LX-2细胞24h,构建体外NaAsO 2致LX-2活化模型,同时设立对照组;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察NaAsO 2处理LX-2细胞线粒体结构变化情况;荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞Fe 2+水平;比色法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;蛋白免疫印迹法检测溶质载体家族7号成员11(solute carrier family number 7member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平。结果TEM结果显示,NaAsO 2组细胞线粒体膜完整性破损,线粒体嵴减少和消失;此外,与对照组比较,NaAsO 2处理组Fe 2+水平均升高(P<0.05);不同剂量NaAsO 2组MDA含量差异均有统计学意义(F=7.18,P均<0.05)。其中,与对照组比较,5、15μmol/L NaAsO 2组LX-2细胞MDA含量均高于对照组(P<0.05);在翻译水平上,纤维化指标α-SMA蛋白表达水平随着NaAsO 2剂量的升高而表达上调(P<0.05),铁死亡指标SLC7A11和GPX4蛋白表达水平随着NaAsO 2剂量的升高而减少(P<0.05)。结论铁死亡参与NaAsO 2致LX-2细胞活化过程。

柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬

背景:自噬在肝纤维化中发挥重要作用,可以通过诱导肝星状细胞活化促进肝纤维化的进程。前期研究表明,柔肝降酶方具有保护肝功能、抗炎、抗氧化应激反应等作用,其是否通过自噬抗肝纤维化的作用机制尚未阐明。目的:探讨柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞活化及自噬的影响及其潜在的作用机制。方法:用脂多糖建立人肝星状细胞活化模型,分成不同的处理组:(1)空白组:人肝星状细胞+空白血清;(2)模型组:人肝星状细胞+空白血清+脂多糖;(3)柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组:人肝星状细胞+低、中、高剂量柔肝降酶方含药血清+脂多糖;(4)柔肝降酶方高剂量含药血清联合雷帕霉素组:高剂量组基础上+雷帕霉素;(5)柔肝降酶方高剂量含药血清联合PI3K抑制剂组:高剂量组基础上+LY294002。CCK-8法观察细胞增殖情况;采用单丹磺酰尸胺染色法观察细胞自噬情况;WesternBlot检测细胞通路蛋白(PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR)、自噬相关蛋白(P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)、人肝星状细胞活化标志蛋白(α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原纤维)表达水平的影响。结果与结论:(1)柔肝降酶方含药血清能够降低人肝星状细胞的增殖活性,下调Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达,上调自噬P62蛋白的表达,降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达,且呈现剂量依赖性;(2)MDC荧光染色结果显示,柔肝降酶方含药血清可使细胞绿色斑点荧光强度降低;(3)加入自噬激动剂雷帕霉素后,P62蛋白表达降低,LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达升高;(4)经过柔肝降酶方含药血清处理后,PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平升高,呈剂量依赖性,这种作用能被PI3K抑制剂LY294002减弱;(5)提示柔肝降酶方含药血清可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬,减少脂多糖诱导的人肝星状细胞活化。

亚砷酸钠对人肝星状细胞的激活作用及其与铁死亡的关系

目的 观察亚砷酸钠(NaAsO_(2))对人肝星状细胞的激活作用,并探讨其与铁死亡的关系。方法 体外培养人肝星状细胞LX-2,将细胞分为NaAsO_(2)组和对照组,NaAsO_(2)组分别加入5、10、15μmol/LNaAsO_(2)培养24 h,对照组正常培养。倒置显微镜下观察细胞形态变化;比色法检测谷胱甘肽(GSH)含量;荧光探针法检测细胞脂质活性氧(ROS);RT-PCR法检测铁死亡指标溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)以及纤维化指标α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ) mRNA;采用Spearman相关分析法分析纤维化指标与铁死亡指标的相关性。结果 NaAsO_(2)组中随着NaAsO_(2)浓度升高,细胞触角逐渐回缩,细胞数量减少,细胞间距变宽。与对照组比较,NaAsO_(2)不同浓度组细胞GSH含量均减少,其中15μmol/LNaAsO_(2)组GSH含量低于10、5μmol/LNaAsO_(2)组,10μmol/LNaAsO_(2)组低于5μmol/LNaAsO_(2)组(P均<0.05)。与对照组比较,NaAsO_(2)不同浓度组脂质ROS荧光强度增强。与对照组比较,5、10、15μmol/LNaAsO_(2)组α-SMA、CollagenⅠmRNA表达水平均升高,且15μmol/LNaAsO_(2)组高于5、10μmol/LNaAsO_(2)组,10μmol/LNaAsO_(2)组高于5μmol/LNaAsO_(2)组(P均<0.05);与对照组比较,5、10、15μmol/LNaAsO_(2)组SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平均降低,且15μmol/LNaAsO_(2)组低于10、5μmol/LNaAsO_(2)组,10μmol/LNaAsO_(2)组低于5μmol/LNaAsO_(2)组。α-SMA mRNA与GPX4、SLC7A11 mRNA表达呈负相关(r分别为-0.72、-0.92,P均<0.01),CollagenⅠmRNA与GPX4、SLC7A11 mRNA表达亦呈负相关(r分别为-0.67、-0.90,P均<0.01)。结论 NaAsO_(2)能够改变肝星状细胞形状,促进细胞纤维化基因表达,引起肝星状细胞激活;在此过程中,SLC7A11、GPX4基因表达下调导致ROS堆积,促进肝星状细胞铁死亡;上述作用随着NaAsO_(2)浓度升高而增强。

桂郁金提取物对人肝星状细胞的胶原与金属蛋白酶分泌的影响

目的观察桂郁金乙醇提取物(挥发油)对人肝星状细胞的作用,了解其对该细胞胶原蛋白和基质金属蛋白酶分泌功能的影响。方法将人肝星状细胞株(HSC-LX2)与药物孵育48h后,用免疫组化法染色观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、MMP-1及MMP-13表达的部位和面积。结果低、中、高浓度桂郁金提取物均具有抑制HSC-LX2细胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原,并增加其分泌MMP-1及MMP-13的能力。以上作用具有剂量依赖性,且中、高剂量组作用明显比秋水仙碱组和复方鳖甲软肝片组强,经统计学分析差异均有显著性(P<0.05)。结论桂郁金提取物具有降低HSC-LX2细胞的纤维化蛋白分泌功能、增加纤维化蛋白降解的能力,从而可以干预肝纤维化病程;以上能力均具有剂量依赖性;且中、高剂量桂郁金提取物组能力明显比秋水仙碱组和复方鳖甲软肝片组强。

桂郁金提取物对人肝星状细胞增殖、细胞周期及凋亡影响的研究

目的观察桂郁金提取物对人肝星状细胞的作用,了解其对该细胞的增殖、细胞周期和凋亡情况的影响。方法将人肝星状细胞株(HSC-LX2)与药物孵育48 h后,用MTT比色法测定细胞的增殖抑制率。用流式细胞术(PI染色法)检测各周期细胞的DNA含量及细胞凋亡的概况。结果低、中、高浓度桂郁金提取物均可抑制HSC-LX2细胞的增殖,48h的增值抑制率分别为15.4%、49.1%、58.3%;48 h的IC50为45μmol/L;均可阻止HSC-LX2细胞进入DNA合成增殖周期,并诱导HSC-LX2细胞发生早期及晚期凋亡,48 h的S期+G2/M期细胞总数百分比分别为70.1%、63.6%、50.2%;凋亡概率分别为13.9%、18.9%、23.5%。结论桂郁金提取物具有抑制HSC-LX2细胞增殖、阻止细胞进入DNA合成增殖周期、诱导细胞发生凋亡的能力,从而可以干预肝纤维化病程;以上能力均具有剂量依赖性;且中、高剂量桂郁金提取物组以上能力明显比秋水仙碱组和复方鳖甲软肝片组强。

桂郁金提取物对人肝星状细胞增殖、凋亡影响的研究

目的:观察桂郁金提取物对人肝星状细胞的作用,了解其对该细胞的增殖和凋亡的影响。方法:将人肝星状细胞株(HSC-LX2)与药物孵育48h后,用MTT比色法测定细胞的增殖抑制率。用流式细胞术(ANNEXIN V-PE/7-AAD双染色法)检测细胞凋亡各阶段的情况。结果:低、中、高浓度桂郁金提取物均可抑制HSC-LX2细胞的增殖,48h的增值抑制率分别为15.4%、49.1%、58.3%;48h的IC50为45μmol/L;均可诱导细胞发生早期及晚期凋亡,48h的总凋亡细胞百分比分别为20.7%、29.8%、34.4%。结论:桂郁金提取物具有抑制HSC-LX2细胞增殖、诱导细胞发生凋亡的能力,从而可以干预肝纤维化病程;以上能力均具有剂量依赖性;且中、高剂量桂郁金提取物组以上能力明显比秋水仙碱组和复方鳖甲软肝片组强。

复方861对人肝星状细胞α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达的调节作用

目的 研究复方861对人肝星状细胞(LX-2)中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因表达的调节作用。方法应用基于SYBR-Green I的实时定量荧光PCR方法,研究复方861分别作用24、48、72 h后,LX-2细胞中α-SMA mRNA含量的变化情况。结果 复方861在48和72 h可以显著降低LX-2细胞中α-SMA mRNA含量。结论 复方861可抑制LX-2细胞中α-SMA基因的表达,提示其抗肝纤维化作用可能与其抑制LX-2细胞的活化有关。

p27在荔枝核总黄酮抑制人肝星状细胞LX2增殖过程中的表达及其意义

目的:研究荔枝核总黄酮(total flavonoids of litchi,TFL)对人肝星状细胞LX2增殖的影响及其相关作用机制.方法:使用不同浓度(7.8125、15.6250、31.2500、62.5000、125.0000μg/m L)TFL处理LX2.采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,通过流式细胞仪分析各组细胞周期的分布,使用RT-PCR和Western blot技术测定细胞中p27基因m RNA和蛋白的表达.结果:TFL作用48、72 h可抑制LX2细胞增殖,且随着时间延长,抑制效果更加明显.T F L处理72 h后可测得L X2细胞被阻滞在S期,且明显上调p27基因的m RNA和蛋白的表达.结论:TFL抑制人肝星状细胞增殖并将其阻滞在S期,该作用机制可能与p27表达上调相关.

卡维地洛对瘦素诱导的人肝星状细胞活化增殖的影响及机制研究

目的:研究卡维地洛对瘦素诱导的LX2人肝星状细胞(HSC-LX2)活化增殖的影响及机制。方法:取对数生长期的HSC-LX2细胞分为空白对照组、瘦素刺激组和卡维地洛低、中、高浓度组(5、10、20μmol/L),除空白对照组外,其余各组均加入0.1 g/L的瘦素及相应浓度的卡维地洛作用24 h。采用MTT法检测细胞的光密度(OD)值,计算细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)、瘦素及瘦素受体m RNA表达;Western blot法检测磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)蛋白表达。结果:与空白对照组比较,瘦素刺激组细胞的OD值增加、凋亡率降低、G_0/G_1期细胞减少(P<0.05);α-SMA、TIMP-1、瘦素、瘦素受体m RNA表达和p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均增强(P<0.05)。与瘦素刺激组比较,卡维地洛各浓度组细胞的OD值减小、凋亡率升高、细胞主要阻滞在G_0/G_1期(P<0.05);α-SMA、TIMP-1、瘦素、瘦素受体m RNA表达和p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均减弱(P<0.05),且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:卡维地洛能够抑制瘦素诱导的HSC-LX2细胞的活化增殖,促进HSC-LX2细胞凋亡;其机制可能与下调瘦素、瘦素受体基因表达并阻断瘦素诱导的细胞内JAK2/STAT3信号通路激活有关。

甲基阿魏酸对TGF-β_1刺激人肝星状细胞增殖及活化的抑制作用

目的探讨甲基阿魏酸（MFA）对转化生长因子（TGF）-β_1刺激人肝星状细胞（HSC）-LX-2增殖及活化的抑制作用。方法将体外培养的HSC-LX-2细胞作为正常对照组,采用1μg/L TGF-β_1刺激HSC-LX-2进行细胞造模为模型组,药物组含终质量浓度为1μg/L的TGF-β_1和0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/L的MFA。根据MTT法检测MFA对药物组HSC-LX-2细胞增殖的影响,选择MFA作用浓度为1.25、2.5、5 mg/L作为低、中、高剂量组,将细胞孵育72h后,采用RT-PCR法检测各组α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA、Ⅰ型前胶原（PCⅠ）mRNA表达;采用Western blotting法检测各组α-SMA蛋白表达;采用ELISA法检测各组PCⅠ蛋白表达。结果在0.312 5-5 mg/L质量浓度范围内,随着MFA质量浓度升高,HSC-LX-2细胞生长抑制率逐渐升高,呈浓度依赖性（P均〈0.05）;当MFA质量浓度大于10 mg/L时,HSC-LX-2生长抑制率逐渐降低（P均〈0.05）。在1.25-5.0 mg/L范围内随MFA质量浓度逐渐增高,HSC-LX-2细胞中α-SMA及PCⅠ的mRNA及蛋白表达量逐渐降低（P均〈0.05）。结论 MFA可抑制TGF-β_1刺激的人肝星状细胞-LX-2增殖,减弱α-SMA、PCⅠ表达,抑制HSC-LX-2细胞外基质的合成及HSC-LX-2表型的转化。

靶向CTGF锤头核酶对TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Ⅰ型胶原的作用

目的:探讨靶向结缔组织生长因子(CTGF)的锤头核酶抑制TGF-β1作用下人肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原(Col I)合成及其细胞周期进程的作用.方法:构建含有人CTGF锤头核酶cDNA序列的重组质粒pTriCTGF-Rz.将空质粒pTriEx2和重组质粒pTriCTGF-Rz分别转染人肝星状细胞系(LX-2)细胞.细胞分为4组:pTriEx2转染组,pTriEx2转染加TGF-β1组,pTriCTGF-Rz转染加TGF-β1组和pTriCTGF-Rz转染组.采用半定量RT-PCR测定LX-2细胞CTGF mRNA和Col I mRNA转录水平,采用ELISA和流式细胞仪分别用于LX-2细胞Col I分泌功能和LX-2细胞周期进程的检测.结果:TGF-β1可明显提高LX-2细胞CTGFmRNA和Col I mRNA的转录水平及分泌ColI蛋白功能(t=11.14,14.36,7.17,均P<0.01);p Tr i C T G F-R z转染L X-2细胞既能降低基础CTGF mRNA和Col I mRNA水平及Col I蛋白水平(t=2.86,3.06,2.97,均P<0.05),又能部分拮抗TGF-β1诱导LX-2细胞CTGF mRNA和Col I mRNA转录和Col I蛋白分泌的增加(t=2.99,3.09,3.02,均P<0.05).TGF-β1对LX-2细胞周期进程无影响.结论:CTGF是TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Col I的下游介导者,TGF-β1对HSC周期进程无影响,靶向CTGF有可能成为肝纤维化基因治疗的新靶点.

斑蝥酸钠维生素B_6对人肝星状细胞增殖的影响及其机制

目的探讨斑蝥酸钠维生素B6注射液对人肝星状细胞LX-2增殖活化的影响及其机制。方法培养人肝星状细胞LX-2,将其分为3个观察组(斑蝥酸钠维生素B6的浓度分别为1、5、10μg/mL)和1个空白对照组;培养24、48、72 h后,采用MTT法检测细胞增殖活性,采用荧光定量PCR方法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1基因表达变化。结果与空白对照组比较,观察组人肝星状细胞LX-2增殖活化被显著抑制(P均<0.05),Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1mRNA表达下降(P均<0.05)。结论斑蝥酸钠维生素B6可以抑制人肝星状细胞LX-2增殖活化,其机制可能与其抑制、转化生长因子β1信号通路有关。

荔枝核总黄酮抑制人肝星状细胞增殖作用机制的研究

目的研究荔枝核总黄酮(TFL)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肝星状细胞(HSC-LX2)增殖与核因子-k B(NF-кB)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。方法体外培养HSC-LX2,TGF-β1刺激24 h后给予不同浓度的TFL(80、160、320、640、800μg/ml)干预;给药后24、48、72 h,用MTT法分别检测TFL对HSC-LX2增殖的影响;采用半定量PCR检测各组NF-кB、α-SMA mRNA的表达;Western blot检测NF-кB、α-SMA蛋白的表达情况。结果 MTT检测结果显示TFL呈时间依赖性抑制TGF-β1诱导HSC-LX2增殖,以作用48 h最为明显,其半数抑制浓度(IC50)为302μg/ml。TFL各剂量组作用48 h后,HSC-LX2细胞中NF-кB和α-SMA基因和蛋白的表达水平都降低,尤以300μg/ml和600μg/ml药物浓度组较明显,与对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。结论 TFL在体外对TGF-β1诱导的HSC-LX2的增殖有抑制作用,其作用机制可能是通过抑制细胞中NF-кB的表达,从而起到抗肝纤维化的作用。

丹参酚酸B盐对人肝星状细胞内肌细胞增强因子2的影响

以分离和培养的人肝星状细胞(H-HSC)为研究对象,观察H-HSC是否表达肌细胞增强因子2(MEF2)且与转化生长因子β1(TGF-β1)之间的关系,进一步探讨丹参酚酸B盐(SA-B)抗肝纤维化的作用机制,分离H-HSC后,用TGF-β1刺激培养的H-HSC,通过免疫印迹分析及分别转染含有MEF2启动子和I型胶原启动子的luciferase报道基因质粒入H-HSC,检测荧光素酶活性,观察经SA-B干预后MEF2,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及I型胶原表达的变化.结果显示H-HSC能够表达MEF2,且随H-HSC的活化而增加;经TGF-β1刺激的H-HSC内α-SMA的表达、I型胶原启动子的活性和I型胶原蛋白的生成均明显增强,同时MEF2启动子的活性和MEF2A和MEF2C的蛋白表达也明显增强;SA-B对以上这些物质的表达均有明显的抑制作用.上述结果说明MEF2参与了肝纤维化的形成,SA-B抑制H-HSC活化的作用与其抑制TGF-B1在H-HSC内的信号传导与抑制转录因子MEF2A和MEF2C的表达有关.

乌索酸抑制人肝星状细胞增殖的PDGF-ERK信号通路研究

目的:研究乌索酸对人肝星状细胞(HSC-LX-2)增殖的影响及作用机制。方法:将不同剂量的乌索酸作用于体外培养的HSC-LX-2细胞48 h后,MTT方法测定乌索酸对HSC-LX-2细胞增殖的影响;Western-blot方法测定PDGF-ERK信号通路相关蛋白水平的表达。结果:乌索酸呈剂量依赖性地抑制HSC-LX-2细胞的增殖,20、30和40μmol·L^(-1)浓度的乌索酸增殖抑制率分别为9.1%、42.3%、62.6%,IC50为35.2μmol·L^(-1);不同浓度乌索酸作用HSC-LX-2细胞48 h后,该细胞的PDGF受体和磷酸化ERK等蛋白含量水平下降,其中以30和40μmol·L^(-1)两种浓度的乌索酸作用效果最为明显,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),而各组中ERK蛋白水平无明显变化。结论:从研究结果推断,乌索酸能抑制HSC-LX-2细胞的增殖,其作用机制可能与阻断PDGF-ERK信号通路有关。

护肝布祖热对CCl4诱导人肝星状细胞LX-2活化的作用及机制研究

目的探讨护肝布祖热(HGBZR)抗肝损伤的作用及机制。方法体外培养人肝星状细胞LX-2,采用MTT法检测LX-2细胞存活率以确定四氯化碳(CCl)造模浓度和药物干预浓度。细胞实验分为6组:空白组、模型组、阳性组(水飞蓟素,10μg·mL)及HGBZR低、中、高剂量组(5、10、20μg·mL),除空白组以外,其余各组分别加入终浓度5 mmol·L^(-1)CCl损伤干预24 h,然后再进行药物干预24 h。采用MTT法检测各组细胞存活率;Annexin V/PE双染法检测细胞凋亡率;qRT-PCR法检测各组细胞α-平滑肌动蛋白(SMA)、TIMP-1、PTP1B、转化生长因子(TGF)-β、Smad3、Smad4、Smad7、CHOP、PERK、IRE1、ATF6 mRNA表达情况;Western Blot法检测各组细胞Jak1、Stat3、TGF-β、Smad3、Smad4、Smad7、CHOP、Caspase12、核因子(NF)-κB p65蛋白表达情况。结果随着CCl浓度(5~30 mmol·L^(-1))升高,LX-2细胞存活率逐渐下降,当CCl浓度为5 mmol·L^(-1)时细胞呈现增殖状态,故选择5 mmol·L^(-1)CCl处理24 h作为肝损伤模型复制条件。与模型组比较,HGBZR中、高剂量组的细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显升高(P<0.05);LX-2细胞的α-SMA、TIMP-1、TGF-β、Smad3、Smad4、CHOP、PERK、IRE1、ATF6 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PTP1B、Smad7 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);LX-2细胞的Jak1、Stat3、TGF-β、Smad4、CHOP、Caspase12及NF-κB p65(核蛋白)蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Smad7、NF-κB p65(质蛋白)蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Smad3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。结论HGBZR可能通过调控TGF-β/Smad、Jak/Stat和内质网应激信号通路相关目标基因转录水平及蛋白表达,促进活化LX-2细胞的凋亡,对CCl诱导的化学性肝损伤具有一定保护作用。

白花丹醌对人肝星状细胞的增殖抑制、凋亡及细胞外基质分泌功能的影响

目的:研究白花丹醌对人肝星状细胞株(HSC-LX2)的作用,观察该药对细胞的增殖抑制率、细胞凋亡、分泌细胞外基质和金属蛋白酶功能的影响。方法:HSC-LX2与药物孵育48 h,以MTT法检测细胞增殖抑制率;以流式细胞术检测细胞凋亡情况;免疫组化法观察Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白,MMP-1和MMP-13表达的部位和面积。结果:白花丹醌低、中、高浓度均可抑制HSC-LX2细胞增殖,诱导细胞发生凋亡,降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原分泌水平,并增加其分泌MMP-1及MMP-13的能力。以上作用具有剂量依赖性,有统计学差异(P<0.05);中、高剂量组上述的作用比秋水仙碱强。结论:白花丹醌具有抑制HSC-LX2细胞增殖、诱导细胞发生凋亡、降低细胞外基质的分泌,并增加纤维蛋白降解酶分泌水平的能力,而对肝纤维化进程有干预作用;上述能力均有剂量依赖性;且中、高剂量组的干预能力强于秋水仙碱。

靶向CTGF锤头核酶对人肝星状细胞Ⅰ型胶原及细胞周期的影响

目的:探讨靶向人结缔组织生长因子(CTGF)锤头核酶对人肝星状细胞系(LX-2)细胞Ⅰ型胶原转录和分泌及细胞增殖的抑制作用,为肝纤维化基因治疗提供实验依据。方法:构建含有CTGF锤头核酶及其5′和3′端分别连接一自剪酶cDNA序列的重组质粒pTriCTGF-Rz。实验分5组:未转染组、空质粒pTriEx2转染组、空质粒转染加TGF-1组、pTriCTGF-Rz转染组和pTriCTGF-Rz转染加TGF-1组。半定量RT-PCR检测CTGF mRNA和Ⅰ型胶原mRNA水平,ELISA检测LX-2细胞分泌Ⅰ型胶原的水平,流式细胞仪检测LX-2细胞周期。结果:与pTriEx2转染组比较,pTriCTGF-Rz组LX-2细胞CTGF mRNA水平和TGF-1诱导CTGFmRNA的水平降低(P<0.05),pTriCTGF-Rz组LX-2细胞Ⅰ型胶原mRNA转录和蛋白分泌减少,TGF-1诱导I型胶原的转录水平降低(P<0.05)。与空质粒pTriEx2转染组比较,pTriCTGF-Rz转染组LX-2细胞G0-G1期细胞数增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.01)。结论:靶向CTGF的锤头核酶具有抑制人肝星状细胞介导肝纤维化的作用,可能成为肝纤维化基因治疗的新途径。