人肝细胞癌HepG2细胞荷瘤裸鼠^(18)F⁃乙基胆碱、^(11)C⁃胆碱、^(18)F⁃FDG生物分布和PET肿瘤显像

目的单一^(18)F⁃FDG PET显像对高分化HCC诊断敏感低,因而探讨荷人肝细胞癌HepG2细胞裸鼠中^(18)F⁃乙基胆碱、^(11)C⁃胆碱、^(18)F⁃FDG的活体生物学分布以及^(18)F⁃乙基胆碱(^(18)F⁃FECh)、^(11)C⁃胆碱、^(18)F⁃FDG microPET显像检测荷瘤鼠肿瘤的价值。方法荷人肝癌细胞HepG2裸鼠3只,行^(18)F⁃FECh、^(11)C⁃胆碱、^(18)F⁃FDG microPET动态扫描,分析不同时间点3种显像剂在脑、心腔、肝、肺、肾皮质、肌肉、肿瘤的组织摄取值(%ID/g)和瘤/肝比、瘤/肌比。结果^(18)F⁃FECh、11 C⁃胆碱与^(18)F⁃FDG的生物分布有差异,肝、肾的^(18)F⁃FECh、^(11)C⁃胆碱摄取高,在其他正常组织摄取低。肾、心、肝和脑组织^(18)F⁃FDG摄取高。不同时间点^(18)F⁃FECh、^(11)C⁃胆碱瘤/肝比和瘤/肌比平稳,而^(18)F⁃FDG变化大。不同时间点^(18)F⁃FDG瘤/肝比和20~60 min时间点^(18)F⁃FDG瘤/肌比明显高于^(18)F⁃FECh和^(11)C⁃胆碱。5、10、20、30 min ^(18)F⁃FECh瘤/肝比与11 C⁃胆碱差异无统计学意义(P>0􀆰05),但在20、30 min ^(18)F⁃FECh瘤/肌比(3.70±1.27、3.85±1.44)显著高于11 C⁃胆碱(1.99±1.31、0.00±0.00),差异有统计学意义(P<0􀆰05)。结论荷瘤鼠中肾和肝是胆碱代谢的主要器官,^(18)F⁃FECh、^(11)C⁃胆碱的生物学分布理想。与^(11)C⁃胆碱相比,^(18)F⁃FECh更容易观察肿瘤,因此可选用^(18)F⁃FDG和^(18)F⁃FECh双探针PET显像模式,提高肝细胞癌诊断的准确性。

超微氧化铁纳米粒子通过强化自噬机制抑制人肝细胞癌HepG2细胞的迁移和侵袭

目的:探讨超微氧化铁纳米粒子(ultrasmall iron oxide nanoparticle,USIONP)对人肝细胞癌HepG2细胞迁移和侵袭的影响及其可能的机制。方法:采用粒径分析仪和透射电镜分别分析USIONP的水合粒径和核心粒径,Zeta电位和胶体稳定性实验分析USIONP的分散性及其稳定性以鉴定USIONP的成功制备;用不同质量浓度USIONP(0、50、100、200μg/ml)或200μg/ml USIONP+5 mmol/L 3-MA(自噬抑制剂)联合处理HepG2细胞,CCK-8法检测HepG2细胞的增殖活力,Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力,WB实验检测自噬标志物Beclin1、LC3、p62的表达,2’,7’-二氯二氢荧光素二醋酸(DCFH-DA)法测定细胞内活性氧(ROS)水平,铁离子比色法检测细胞内铁离子水平。结果:USIONP的平均水合粒径为(37.86±12.90)nm、核心粒径约10 nm,Zeta电位为–23.8 mV,有良好的水溶分散性,证实了USIONP的成功制备。随USIONP质量浓度升高和处理时间延长,HepG2细胞的增殖活力明显降低(均P<0.05);与对照组相比,200μg/ml USIONP处理HepG2细胞24 h后,迁移、侵袭细胞数量均显著减少(均P<0.05),而3-MA能够部分抵消上述影响(均P<0.05)。与对照组相比,100、200μg/ml USIONP处理组的HepG2细胞中Beclin1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05),而p62蛋白表达水平下降(均P<0.05);200μg/ml USIONP可显著提高细胞内ROS水平与铁离子水平,而加入3-MA可阻断其作用(均P<0.05)。结论:USIONP能促进HepG2细胞发生自噬,而自噬通路激活后降解USIONP释放铁离子和导致细胞ROS水平升高,从而抑制HepG2细胞的迁移和侵袭。

甲磺酸阿帕替尼联合放疗对肝癌HepG2细胞的体外协同增敏作用

目的:探讨甲磺酸阿帕替尼(阿帕替尼)联合放射治疗(放疗)对肝癌HepG2细胞的体外协同抑制作用,阐明其相关抗肿瘤机制。方法:体外培养肝癌HepG2细胞,以不同浓度阿帕替尼和(或)不同剂量X射线处理后,采用MTT法检测各组细胞活性,计算各组细胞增殖抑制率和阿帕替尼20%抑制浓度(IC20),并确定后续实验的X射线照射剂量。HepG2细胞分为阿帕替尼组、放疗组和阿帕替尼+放疗组(联合组),流式细胞术检测各组细胞凋亡率,细胞划痕实验检测各组细胞迁移率,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)水平。结果:MTT法检测,阿帕替尼的IC20为1.32μmol·L^(-1),以此作为后续实验阿帕替尼作用浓度,确定2 Gy为后续实验X射线照射剂量。与对照组比较,阿帕替尼组和放疗组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),联合组细胞凋亡率升高(P<0.05)。与对照组比较,阿帕替尼组、放疗组和联合组细胞迁移率降低(P<0.05);与阿帕替尼组和放疗组比较,联合组细胞迁移率降低(P<0.05)。与对照组比较,阿帕替尼组和联合组细胞培养上清中VEGF水平降低(P<0.05);与阿帕替尼和放疗组比较,联合组细胞培养上清中VEGF水平降低(P<0.05)。结论:阿帕替尼联合放疗在体外可明显抑制肝癌HepG2细胞增殖和迁移,并诱导细胞凋亡,其作用可能与抑制细胞VEGF分泌有关。

circRNA CCND1对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

目的 探讨circRNA CCND1对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法 采用荧光原位杂交(FISH)实验及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circRNA CCND1在HepG2细胞及L02细胞中的表达情况;进一步干扰及过表达circRNA CCND1后,通过qRT-PCR检测circRNA CCND1在HepG2细胞中的表达情况,CCK-8法和EDU法检测HepG2细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期,Transwell实验检测细胞侵袭情况,划痕实验检测细胞迁移情况。结果 HepG2细胞circRNA CCND1相对表达量较LO2细胞高(P <0.05)。Si-circRNA CCND1组circRNA CCND1相对表达量较Control组和Si-NC组下降(P <0.05),Oe-circRNA CCND1组较Control组和Oe-NC组升高(P <0.05)。各组细胞培养0、24、48、72和96 h后细胞增殖活性比较,经重复测量设计的方差分析,结果:(1)不同时间点细胞增殖活性比较,差异有统计学意义(P <0.05);(2)各组细胞增殖活性比较,差异有统计学意义(P <0.05);(3)各组细胞增殖活性变化趋势比较,差异有统计学意义(P <0.05)。与Control组及Si-NC组比较,Si-circRNA CCND1组细胞凋亡率升高(P <0.05),G_(0)/G_(1)期比值升高(P <0.05),S及G_(2)/M期比值下降(P <0.05);与Control组及Oe-NC组比较,OecircRNA CCND1组细胞凋亡率下降(P <0.05),G_(0)/G_(1)期比值下降(P <0.05),S及G_(2)/M期比值升高(P <0.05)。Si-circRNA CCND1组细胞侵袭数、细胞迁移数较Control组、Si-NC组少(P <0.05),Oe-circRNA CCND1组较Control组及Oe-NC组多(P <0.05)。结论 circRNA CCND1能够促进人肝癌细胞HepG2细胞增殖、侵袭和迁移,抑制细胞凋亡。

人参皂苷Rb1通过KEAP1/PGAM5/AIFM1通路促进肝细胞癌HepG2细胞发生氧死亡

目的:探讨人参皂苷Rb1(Gn-Rb1)对肝细胞癌(HCC)HepG2细胞氧死亡的影响及其可能的分子机制。方法:采用生物信息学方法分析氧死亡的关键基因PGAM5表达对HCC患者生存期的影响。选取辽宁省肿瘤医院收治的8例HCC患者的HCC组织与癌旁组织,通过WB法及qPCR检测氧死亡相关基因蛋白与mRNA的表达情况。将HepG2细胞随机分为对照组与Gn-Rb1组(予以200μmol/L Gn-Rb1干预),采用细胞克隆形成实验、划痕愈合实验分别检测Gn-Rb1对HepG2细胞的集落形成能力、迁移能力的影响,ELISA检测对细胞ROS生成水平的影响,微板法检测对细胞LDH释放水平的影响;WB法、qPCR法检测Gn-Rb1对HepG2氧死亡关键基因蛋白质与mRNA水平表达的影响。结果:生物信息学分析发现,PGAM5高表达肝癌患者总生存时间较低表达患者更长(P<0.05)。在临床HCC组织与癌旁组织样本中发现,相较于癌旁组织,在蛋白质与mRNA水平上,肿瘤组织KEAP1与PGAM5表达显著降低,NRF2表达显著升高(均P<0.01),p-AIFM1蛋白水平显著升高(P<0.05)。对HepG2细胞予以200μmol/L Gn-Rb1干预后,相较于对照组,Gn-Rb1组HepG2细胞的迁移能力与集落形成能力显著降低(均P<0.01),而LDH水平显著升高(P<0.05);相比于对照组,在mRNA和蛋白质水平上,Gn-Rb1组细胞中KEAP1、PGAM5表达均显著升高而NRF2表达均显著降低(均P<0.05),p-AIFM1蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:HCC组织中氧死亡被抑制,而Gn-Rb1能够通过调控KEAP1/PGAM5/AIFM1通路促进HepG2细胞氧死亡的发生,抑制细胞增殖和迁移能力。

microRNA-338-3p抑制HepG2肝癌细胞的迁移和侵袭

目的研究microRNA-338-3p对HepG2肝癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的影响。方法取HepG2肝癌细胞,随机分为三组:control组(未转染)、vector组(转染空质粒)、OE组(转染microRNA-338-3p质粒),分别取生理盐水、空质粒、microRNA-338-3p转染,培养48小时。实时荧光定量PCR(qPCR)检测microRNA-338-3p的转染效率;划痕实验检测细胞的迁移指数;Transwell法检测细胞的侵袭能力;蛋白质印迹法(Western blot实验)检测细胞E-cadherin、N-cadherin的相对蛋白表达量。结果(1)microRNA-338-3p的转染阳性率超过90%,符合实验标准。(2)HepG2肝癌细胞的迁移指数,control组与vector组相比较,差异无统计学意义(P>0.05);OE组与control组、vector组相比较,迁移指数明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)HepG2肝癌细胞的侵袭能力,control组与vector组相比较,差异无统计学意义(P>0.05);OE组HepG2与control组、vector组相比较,侵袭能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.001)。(4)E-cadherin相对蛋白表达量,control组与vector组相比较,差异无统计学意义(P>0.05);OE组与control组、vector组相比较,E-cadherin相对蛋白表达量均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)N-cadherin的相对蛋白表达量,control组与vector组相比较,差异无统计学意义(P>0.05);OE组与control组、vector组相比较,N-cadherin相对蛋白表达量减少,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论(1)microRNA-338-3p可抑制HepG2肝癌细胞的迁移、侵袭能力;(2)microRNA-338-3p通过促进E-cadherin蛋白表达并抑制N-cadherin蛋白表达,从而抑制HepG2肝癌细胞的上皮间质转化。

WNK2通过抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路延缓肝细胞癌的增殖和侵袭

目的探讨WNK2对肝细胞癌(hepatocellocellua carcinoma,HCC)中ERK1/2/ROS/SHP2信号通路的影响,并探讨其在HCC细胞增殖和迁移中的作用。方法将WNK2-mimic和sh-RNA WNK2以及相应的阴性对照转染HepG2细胞,采用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验检测WNK2对肝细胞癌增殖能力的影响;采用Western Blot检测瘤组织中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用SHP2抑制剂PHPS1进行处理之后,采用Western Blot检测HepG2细胞中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用细胞划痕实验和Transwell检测HepG2细胞的迁移能力和侵袭能力;采用单克隆增殖实验和CCK-8检测HepG2细胞的增殖能力。结果与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组裸鼠的瘤体体积显著增大(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组裸鼠的瘤体体积显著减小(P<0.01);Western Blot结果显示,与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组WNK2的表达显著升高(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.01);在体外实验当中,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);相对于sh-NC+PHPS1组,sh-RNA WNK2+PHPS1组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),而p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达则被逆转并且与sh-NC+PHPS1组不具有显著性差异(P>0.05);细胞划痕实验和Transwell结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著升高(P<0.01);sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05);单克隆增殖实验结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的增殖能力显著升高(P<0.01),而sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的增殖能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05)。结论WNK2可以抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路,从而抑制ERK1/2/AKT信号通路,延缓HCC的增殖和迁移。

载脂蛋白C1表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的:探讨载脂蛋白C1 (APOC1)表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步阐明其相关分子机制。方法:通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析肝癌患者癌组织中APOC1 mRNA表达水平及其与患者预后的关系。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测不同肝癌细胞中APOC1mRNA表达水平,筛选APOC1低表达的人肝癌HepG2细胞作为研究对象。将pcDNA3.1-APOC1质粒转染至HepG2细胞过表达APOC1 (APOC1过表达组),以转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞为对照组,采用MTS法和5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测2组细胞增殖活性和增殖率,Transwell小室实验检测2组细胞中迁移细胞数,流式细胞术和TUNEL法检测2组不同细胞周期细胞百分率和细胞凋亡率,Western blotting法检测2组细胞中细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、蛋白激酶B (AKT)、磷酸化AKT (p-AKT)、B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)和活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (cleaved caspase-3)蛋白表达水平。结果:TCGA数据库分析,肝癌患者癌组织中APOC1 mRNA表达水平低于正常肝组织(P<0.05),并且APOC1 mRNA低表达组肝癌患者预后较差。RT-qPCR法检测,HepG2细胞中APOC1 mRNA表达水平最低,选取该细胞作为后续研究对象。与对照组比较,APOC1过表达组细胞增殖活性和增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01),迁移细胞数明显减少(P<0.01), S期细胞百分率和细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。与对照组比较,APOC1过表达组细胞中p-ERK、 p-AKT和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:APOC1高表达能够抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其机制可能与其抑制p-ERK、p-AKT、Bcl-2蛋白表达和促进cleaved caspase-3蛋白表达有关。

翼核果素对肝癌HepG2细胞增殖、迁移的影响

目的研究翼核果素对肝癌HepG2细胞增殖、迁移的影响。方法通过CCK-8法、克隆形成实验、划痕实验、荧光定量聚合酶链反应(PCR)、Western印迹研究翼核果素对肝癌HepG2细胞的影响。结果与空白对照组比较,翼核果素对HepG2细胞增殖、集落形成有显著抑制作用,可显著降低细胞迁移率,对原癌基因(c-Myc)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)3 mRNA表达有显著的抑制作用,对细胞骨架蛋白β微管蛋白(tubulin)、埃兹蛋白(Ezrin)表达有显著的抑制作用(P<0.05,P<0.01),但对c-Jun mRNA表达无明显影响(P>0.05)。结论翼核果素对HepG2细胞增殖迁移有抑制作用,机制可能与下调c-Myc、FGFR3、β-tubulin、Ezrin表达有关。

细胞外囊泡装载仑伐替尼对肝癌细胞株HepG2增殖、侵袭及凋亡的影响

目的 探讨细胞外囊泡装载仑伐替尼对肝癌细胞株HepG2增殖、侵袭及凋亡的影响。方法 设肝癌细胞株HepG2组、细胞外囊泡组(extracellular vesicles, EVs混悬液5 mL、106个/mL)、仑伐替尼组(仑伐替尼5 mL、30 mg/L)、仑伐替尼载药囊泡组(EVs混悬液5 mL、106个/mL+仑伐替尼5 mL、30 mg/L),以上各组细胞每孔设6个平行样,培养72 h。培养结束后,测定细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡水平,应用RT-PCR法和蛋白印迹法测定各组细胞miR-482、CYR61表达水平。结果 与肝癌细胞株HepG2组比较,细胞外囊泡组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、迁移距离、凋亡率、miR-482、CYR61 mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。与肝癌细胞株HepG2组和细胞外囊泡组比较,仑伐替尼组、仑伐替尼载药囊泡组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、迁移距离、CYR61 mRNA和蛋白水平降低,凋亡率、miR-482升高(P<0.05)。与仑伐替尼组比较,仑伐替尼载药囊泡组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、迁移距离、CYR61 mRNA和蛋白水平降低,凋亡率、miR-482升高(P<0.05)。结论 细胞外囊泡装载仑伐替尼后能明显增强仑伐替尼对肝癌细胞株HepG2的杀伤力,增加其抑制增殖、侵袭与促凋亡作用;其机制可能与细胞外囊泡装载仑伐替尼能促进肝癌细胞株HepG2高表达miR-482,低表达CYR61有关。

降脂药奥利司他通过靶向脂代谢途径对肝细胞癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的探究脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)进展中的功能,以期为HCC治疗提供有利的理论依据。方法生信分析FASN在HCC肿瘤组织中的表达及富集通路;细胞计数盒8(cell counting kit-8,CCK-8)、克隆形成、流式细胞术分别检测细胞活力、增殖和凋亡;实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测FASN的水平;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测BCL2相关X蛋白(BCL2-associated X,Bax)和B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达;亲脂性荧光染料BODIPY 493/503检测中性脂质的积累情况;试剂盒检测游离脂肪酸和甘油的水平。结果FASN在HCC肿瘤组织中的表达高于邻近癌旁组织。在体外细胞模型中进行验证,结果显示,与MIHA细胞相比,HCC细胞系(Huh-7、HepG2、Hep3B)中FASN的表达显著上调(P<0.05)。与对照组相比,si-FASN组细胞中FASN的表达降低,而oe-FASN组细胞中FASN的表达提高(P<0.05)。与对照组相比,si-FASN组HepG2细胞活力和克隆数降低,而oe-FASN组Hep3B细胞活力和克隆数提高(P<0.05)。与对照组相比,si-FASN组HepG2细胞凋亡率提高,而oe-FASN组HepG2细胞凋亡率降低(P<0.05)。与对照组相比,si-FASN组细胞中Bax的表达提高,Bcl-2的表达降低;oe-FASN组细胞中Bax的表达降低,Bcl-2的表达提高(P<0.05)。与对照组相比,si-FASN组细胞的中性脂质含量降低,而oe-FASN组细胞中的中性脂质含量升高(P<0.05)。与对照组相比,si-FASN组细胞中游离脂肪酸水平和甘油水平降低,而oe-FASN组细胞中游离脂肪酸水平和甘油水平提高(P<0.05)。与oe-NC+DMSO组相比,oe-NC+Orlistat组细胞中FASN的表达降低,而与oe-NC+Orlistat组相比,oe-FASN+Orlistat组细胞中FASN的表达提高(P<0.05)。与oe-NC+DMSO组相比,oe-NC+Orlistat组细胞的增殖水平降低,并诱导细胞凋亡;而与oe-NC+Orlistat组相比,oe-FASN+Orlistat组细胞的增殖水著提高,并抑制细胞凋亡(P<0.05)。与oe-NC+DMSO组相比,oe-NC+Orlistat组细胞中促凋亡因子Bax的表达提高,降低抗凋亡因子Bcl-2的表达;而与oe-NC+Orlistat组相比,oe-FASN+Orlistat组细胞中促凋亡因子Bax的表达显著降低,提高抗凋亡因子Bcl-2的表达(P<0.05)。与oe-NC+DMSO组相比,oe-NC+Orlistat组细胞中的中性脂质含量、游离脂肪酸含量以及甘油水平降低;与oe-NC+Orlistat组相比,oe-FASN+Orlistat组细胞中的中性脂质含量、游离脂肪酸含量以及甘油水平提高(P<0.05)。结论本研究强调FASN在HCC进展及脂质代谢中的促进作用。脂肪酸合酶抑制剂奥利司他可以抑制FASN的表达,通过调控脂肪酸代谢重编程抑制HCC的进展。

和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2增殖凋亡的影响

目的探讨和枢消积方对人肝癌细胞系HepG2增殖凋亡的影响,揭示可能的分子机制。方法使用和枢消积方作用于人肝癌细胞系HepG2,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、平板克隆实验检测细胞增殖能力。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(BAX)、丙型肝炎病毒(HCV)非结构5A蛋白(NS5A)反式激活基因13(NS5ATP13)及蛋白激酶B(AKT)/糖原合酶激酶(GSK)/雷帕霉素靶蛋白(MTOR)相关通路蛋白的表达水平。结果和对照组相比,和枢消积方各组可使HepG2细胞活性、增殖率显著降低(P<0.05);同时可上调BAX的蛋白表达,下调BCL-2及磷酸(p)-AKT、p-GSK、p-MTOR及NS5ATP13的表达(P<0.05),呈浓度依赖性。结论和枢消积方可以抑制HepG2细胞的增殖并诱导凋亡,这可能与和枢消积方抑制NS5ATP13的表达,继而抑制AKT/GSK/MTOR信号转导通路的活化有关。

CaMKK2调控肝细胞癌化疗耐药性的作用和机制

目的 探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2,CaMKK2)调控肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)化疗耐药性的作用及其机制。方法 (1)为了检测CaMKK2在HCC耐药细胞株中的表达变化,将实验分为亲本组和耐药组。采用浓度梯度递增法建立奥沙利铂(oxaliplatin, OXA)耐药细胞株MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA。采用Western blot检测CaMKK2的磷酸化和总蛋白表达水平。(2)为了检测CaMKK2对肝细胞癌化疗药性的调控作用,将实验分为对照组和CaMKK2敲除组。采用CRISPR/Cas9技术敲除MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA细胞株中的CaMKK2基因表达,采用Western blot验证CaMKK2敲除效率。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)实验检测CaMKK2敲除对MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA细胞株细胞存活率的影响。采用流式细胞术检测CaMKK2敲除对MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA细胞株凋亡的影响。采用Western blot检测CaMKK2敲除对微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)和UNC-51样激酶1(UNC51-like kinase 1,ULK1)蛋白表达水平的影响。(3)为了验证CaMKK2对肝细胞癌化疗药性的调控作用,将实验分为CaMKK2敲除+空载体组和CaMKK2敲除+CaMKK2载体组。采用Western blot检测CaMKK2的蛋白表达水平。采用CCK-8实验检测重新表达CaMKK2对CaMKK2敲除的细胞耐药性的影响。采用Western blot检测重新表达CaMKK2对CaMKK2敲除的细胞中AMPK、ULK1和LC3蛋白表达水平的影响。结果 (1)与亲本组相比,耐药组HCC细胞株中CaMKK2的总蛋白表达水平无显著变化(P>0.05),而CaMKK2的磷酸化水平显著升高(P<0.01)。(2)与对照组比较,CaMKK2敲除组细胞中CaMKK2表达水平显著减少(P<0.01)。与对照组比较,CaMKK2敲除组HCC耐药细胞对OXA的敏感性显著提高(P<0.05),OXA细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。与对照组比较,CaMKK2敲除组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著降低,p62蛋白水平显著升高,p-AMPK/AMPK以及p-ULK1/ULK1显著降低(均P<0.01)。(3)与CaMKK2敲除+空载体组比较,CaMKK2敲除+CaMKK2载体组HCC耐药细胞对OXA的敏感性显著降低(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK和p-ULK1/ULK1显著升高(P<0.01)。结论 基因敲除CaMKK2有效逆转HCC化疗耐药性,其作用机制与调控AMPK/ULK1介导的自噬通路相关。

lncRNA ENST00000452996.1通过ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路调控肝癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的研究一种新的长链非编码RNA ENST00000452996.1对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭等的影响及其调控机制。方法TCGA数据集分析肝癌组织ENST00000452996.1表达;构建ENST00000452996.1的shRNA载体,包装病毒感染Huh-7细胞(shENST00000452996.1组),CCK-8法、克隆形成法、流式细胞术、划痕法和Transwell小室法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力;Western blot法检测shENST00000452996.1组、ERK激动剂EGF处理组和GSK-3β抑制剂TDZD-8处理组的ERK/GSK-3β/β-catenin信号分子的表达。结果TCGA分析发现,肝癌组织ENST00000452996.1表达水平明显高于癌旁组织,且与Edmondson-Steiner分级呈正相关,与总生存时间呈负相关;与对照组相比,shENST00000452996.1组细胞增殖、迁移及侵袭能力明显下降,凋亡能力明显增强,p-ERK1/2、p-GSK-3β^(Ser9)和β-catenin表达均下调,GSK-3β和p-β-catenin表达上调,核β-catenin表达下降;与shENST00000452996.1组相比,EGF处理组p-ERK1/2表达升高,EGF处理组和TDZD-8处理组p-GSK-3β^(Ser9)和β-catenin及核β-catenin表达均升高,GSK-3β和p-β-catenin表达均降低。结论干扰ENST00000452996.1表达抑制ERK1/2磷酸化,阻止GSK3β^(Ser9)磷酸化,导致β-catenin磷酸化,抑制β-catenin核转位,推断ENST00000452996.1通过ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路增强肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡,从而发挥促进肝细胞癌的作用。

miR-222-5p靶向WNK2基因促进肝细胞癌生长

目的 探讨miR-222-5p对肝细胞癌(HCC)生长的影响及其分子机制。方法 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-222-5p和WNK2 mRNA在HCC组织、癌旁组织及正常肝细胞系L02、不同HCC细胞系Hep3B、HepG2、HuH-7中表达;生物信息学预测和双荧光素酶验证miR-222-5p和WNK2靶向关系;取生长密度达50%~60%的HepG2癌细胞,分为miR-222-5p NC组、miR-222-5p mimics组、miR-222-5p inhibitor组、miR-222-5p NC+pSUPER-si NC组、miR-222-5p NC+pSUPER-si WNK2组、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si NC组、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si WNK2组、miR-222-5p NC+pcDNA组、miR-222-5p NC+pcDNA-WNK2组、miR-222-5p mimics+pcDNA组、miR-222-5p mimics+pcDNA-WNK2组,另取未转染L02正常肝细胞和HepG2癌细胞。24 h后,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖率;平板克隆法检测克隆形成能力;裸鼠成瘤实验检测细胞在动物体内成瘤能力;Western印迹法检测WNK2蛋白表达水平。结果 与癌旁组织及正常肝细胞相比,HCC组织及各细胞系中miR-222-5p表达水平明显升高,WNK2 mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)。与miR-222-5p NC组相比,miR-222-5p mimics组miR-222-5p表达水平、增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05),miR-222-5p inhibitor组miR-222-5p表达水平、增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低,WNK2蛋白表达水平升高(P<0.05)。miR-222-5p和WNK2存在靶向关系。与miR-222-5p NC+pcDNA组相比,miR-222-5p NC+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低(P<0.05);miR-222-5p mimics+pcDNA组增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05)。与miR-222-5p NC+pcDNA WNK2组相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05)。与miR-222-5p mimics+pcDNA组相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低(P<0.05)。结论 过表达miR-222-5p可能通过靶向抑制WNK2表达促进肝癌HepG2细胞的增殖、克隆形成和成瘤能力,促进HCC生长。

下调HMGB2表达对肝癌LM3细胞上皮-间质转化的抑制作用及其AKT/mTOR信号通路机制

目的:探讨下调肝癌细胞中高迁移率族框蛋白2 (HMGB2)表达对肝癌细胞生物学行为及上皮-间质转化(EMT)进程的影响,并阐明其作用机制。方法:对数生长期的人肝癌LM3细胞分为阴性对照组和HMGB2 RNA干扰组(HMGB2 siRNA组),分别以Lipofectamin 2000为载体转染无关序列的RNA寡核苷酸(RNA oligo)和敲除HMGB2序列的RNA oligo。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测2组细胞中HMGB2 mRNA和蛋白表达水平,分别采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测2组细胞的迁移和侵袭能力,采用Western blotting法检测2组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、 N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达水平。结果:与阴性对照组比较,HMGB2 siRNA组细胞中HMGB2 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),HMGB2 siRNA组细胞划痕愈合率明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin、Vimentin、mTOR、AKT和磷酸化AKT (p-AKT)蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:下调HMGB2的表达可降低肝癌LM3细胞迁移和侵袭能力并抑制EMT,其作用机制可能与参与调节AKT/mTOR通路相关蛋白表达有关。

增强MRI采用LI-RADS v2018对肝细胞癌的诊断效能

目的:探讨增强MRI采用2018版肝脏影像报告和数据系统(LI-RADS)在高危人群中对肝细胞癌(HCC)的诊断效能。方法:回顾性分析本院2017年至2022年经病理证实的69例HCC患者,并且行MRI增强检查。基于LI-RADS v2018,对每个病灶MRI图像的主要/辅助征象进行评价及LI-RADS分类。以病理结果为金标准,评价增强MRI采用LI-RADS v2018对HCC的诊断效能。采用组内相关系数(ICC)评价阅片者的一致性。结果:3位阅片者间LI-RADS分类的ICC值为0.782(95%可信区间0.713~0.841)。基于LI-RADS v2018,以LR-5为诊断标准,MRI阅片者1诊断HCC的敏感度、特异度和准确率分别为83.9%、70.4%和79.8%;阅片者2分别为80.6%、74.1%和78.7%;阅片者3分别为80.6%、77.8%和79.8%。以LR-4联合LR-5为诊断标准,阅片者1诊断HCC的敏感度、特异度和准确率分别为93.5%、63.0%和84.3%,阅片者2分别为90.3%、66.7%和83.1%,阅片者3分别为91.9%、66.7%和84.3%。结论:基于LI-RADS v2018,增强MRI在高危人群中诊断HCC具有较高的诊断价值。

lncRNA MIR100HG与肝细胞癌恶性生物学行为的相关性及其与hsa-miR-2355-3p调控关系的研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)MIR100HG在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,并验证lncRNA MIR100HG与hsa-miR-2355-3p的调控关系及其对肝细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测cDNA芯片中lncRNA MIR100HG和hsa-miR-2355-3p的表达;分析肝细胞癌组织中lncRNA MIR100HG相对表达水平与患者临床病理参数及预后的关系;采用双荧光素酶报告实验验证lncRNA MIR100HG与hsa-miR-2355-3p之间的调控关系;通过Transwell实验验证lncRNA MIR100HG与hsa-miR-2355-3p对肝细胞癌细胞系HepG2迁移和侵袭能力的影响。结果相较于hsa-miR-2355-3p在肝细胞癌组织中的表达下调,lncRNA MIR100HG在肝细胞癌组织中异常高表达,肝细胞癌组织中lncRNA MIR100HG高表达组中肿瘤最大径越大,更倾向于淋巴结转移、血管侵犯、肿瘤远处转移;血清γ-谷氨酰基转移酶水平越高,肿瘤TNM分期越高,更倾向于肿瘤复发。在TNMⅠ~Ⅳ期、TNMⅠ期、TNMⅡ期的肝细胞癌患者中,lncRNA MIR100HG高表达组患者总体生存率和无复发生存率较低表达组显著降低。多因素回归分析显示,lncRNA MIR100HG异常高表达是肝细胞癌患者预后不良的独立危险因素。Transwell实验表明,下调hsa-miR-2355-3p能够逆转lncRNA MIR100HG沉默介导的对肝细胞癌侵袭和迁移的抑制作用;双荧光素酶报告实验表明,lncRNA MIR100HG可能与hsa-miR-2355-3p存在物理学上的结合位点。结论lncRNA MIR100HG异常高表达与肝细胞癌恶性生物学行为密切相关,其可能通过介导hsa-miR-2355-3p促进肝细胞癌迁移和侵袭。

原发性肝癌患者TACE术后Th1/Th2细胞因子、VEGFR水平变化及其临床意义

目的探究原发性肝癌患者经肝动脉插管化疗栓塞术(TACE)治疗后Th1/Th2细胞因子、血管内皮生长因子受体(VEGFR)水平变化及其临床意义。方法选取接受TACE术治疗的原发性肝癌患者92例,根据治疗效果将完全缓解、部分缓解者纳入有效组(n=50),将疾病进展、疾病稳定者纳入无效组(n=42)。比较2组患者的一般临床资料及术前、术后血清Th1/Th2细胞因子水平[白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-18(IL-18)]、VEGFR水平变化,采用Logistic回归模型进行分析上述指标与疗效的相关性,并通过ROC曲线预测分析上述指标术后水平对疗效的预测效能,比较各指标术后不同水平患者的无进展生存期差异。结果术后2组患者的IL-2、IL-4和VEGFR均较术前下降,且有效组显著低于无效组(P<0.05);术后2组患者的IL-18均较术前显著上升,且有效组显著高于无效组(P<0.05)。IL-2、IL-4、IL-18和VEGFR均与临床疗效具有显著相关性(P<0.05),ROC曲线显示,IL-2、IL-18、VEGFR的AUC值均有评估价值(P<0.05),而IL-4的ROC曲线AUC值评估价值不高(P>0.05)。IL-2、VEGFR高水平患者平均无进展生存期显著短于IL-2、VEGFR低水平患者(P<0.05),IL-18低水平患者无进展生存期显著短于IL-18高水平患者(P<0.05)。结论原发性肝癌患者在TACE术后Th1/Th2细胞因子免疫平衡得以纠正,VEGFR水平表现出下降,其中血清IL-2与VEGFR水平均与疗效及生存期密切相关,可在临床疗效及预后评估中提供参考。

ATP5J通过TOMM20调节线粒体功能并促进人肝细胞癌细胞转移

目的:探讨ATP合成酶H+转运线粒体F0复合体亚基F6(ATP5J)通过调节肝癌细胞线粒体功能介导细胞骨架重塑影响肝癌细胞转移的作用及其机制。方法:培养人肝细胞癌Li-7细胞株,基因修饰ATP5J表达(过表达和敲减)。使用JC-1染色检测每组细胞线粒体膜电位情况;利用DCFH-DA荧光探针检测Li-7细胞的活性氧(ROS)含量;线粒体ATP荧光探针检测线粒体功能;微丝绿色荧光探针(Actin-Tracker Green-488)检测细胞骨架重塑情况;Transwell检测细胞侵袭能力;Western blot检测ATP5J和线粒体外膜转位酶20(TOMM20)的表达水平。结果:过表达ATP5J可上调线粒体膜电位水平和线粒体ATP荧光强度、诱导细胞骨架重塑、促进细胞侵袭和TOMM20蛋白表达,抑制ROS生成(P<0.01)。相反,敲减ATP5J显著降低线粒体膜电位和线粒体ATP荧光强度,显著降低细胞侵袭能力和TOMM20表达,促进ROS产生,阻断细胞骨架重塑(P<0.01)。结论:ATP5J可调节肝癌细胞线粒体能量转化,其通过TOMM20调节线粒体膜电位水平和线粒体ATP产生介导细胞骨架重塑影响肝癌细胞转移。