苦参碱和氧化苦参碱致HL7702细胞毒性研究

目的：探讨苦参碱和氧化苦参碱在体外对人正常肝细胞（HL7702）的影响。方法：①采用MTT法检测苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞活力的影响;②采用光镜对给药后的细胞形态进行观察;③检测给予苦参碱和氧化苦参碱后,肝细胞培养上清液中的肝功能指标（ALT、AST、ALP、LDH）。结果：①MTT法显示,2.5~5mg/mL的苦参碱对HL7702细胞有明显的抑制作用（P〈0.01）,5mg/mL的氧化苦参碱能够显著性降低肝细胞活力（P〈0.05）;②光镜结果显示,给予苦参碱和氧化苦参碱后,细胞出现皱缩,变圆,体积变小,亮度增加,且药物浓度越大,呈现此状态的数目越多,苦参碱对HL7702细胞形态的影响大于氧化苦参碱;③5mg/mL的苦参碱和氧化苦参碱均能明显升高细胞上清液中的AST、ALP、LDH水平（P〈0.01或P〈0.05）,相同剂量苦参碱的上清液中AST、ALP、LDH水平的升高程度大于氧化苦参碱。结论：苦参碱和氧化苦参碱对肝脏可能具有毒性作用,且苦参碱的肝毒性作用大于氧化苦参碱。

用肝肾共培养体系研究细胞毒性的方法学考察

目的建立肝肾共培养体系,并证明此体系的合理性与可行性方法采用MTT法比较川楝素(20、40、80、160μg/mL)、葛根素(200、100、50、25μg/mL)、苦参碱(5、2.5、1.25、0.625 mg/mL)、汉防己乙素(50、25、12.5、6.25 mg/mL)在肝肾单独培养和共培养体系中对肝、肾细胞活力的影响。结果 2种体系中:川楝素仅对肝细胞的活力有抑制作用,葛根素对肝肾细胞均无抑制作用,苦参碱对肝细胞活力的抑制程度大于肾细胞,汉防己乙素对肾细胞活力的抑制程度大于肝细胞。结论用肝肾细胞共培养体系与单独培养体系进行实验得出的结果一致,这2种体系均可用于药物对细胞的毒性研究,其中共培养体系能更好地反映药物对靶器官的选择性。

rhGLP-1(7-36)对肝细胞Akt/GSK3信号通路的影响

目的观察rhGLP-1(7-36)对肝细胞Akt/GSK3信号通路的影响。方法培养人HL7702细胞系至对数生长期,将其分为实验组和空白对照组,分别用含rhGLP-1(7-36)100nM的培养基、不含rhGLP-1(7-36)的培养基培养90min。用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测两组Akt、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase,GSK3)、糖原合酶(glycogen synthase,GS)水平。结果与空白对照组(1.00±0.00)比,实验组p-Akt(Thr308)蛋白相对表达水平(1.81±0.28)明显增加(P=0.01),Akt及p-Akt(Ser473)蛋白表达水平无明显变化;实验组p-GSK3α(Ser21)(1.27±0.09)、p-GSK3β(Ser9)(1.24±0.09)蛋白表达水平明显升高(P值分别为0.003、0.002),GSK3α及GSK3β蛋白表达水平无明显变化;实验组p-GS(Ser641)蛋白表达水平(0.70±0.16)降低(P=0.03),GS蛋白表达水平无明显变化。结论GLP-1可抑制GSK3/GS信号通路,激活GS活性,促进糖原合成。

逍遥散保护受损肝细胞和抗肝纤维化的作用机理研究

目的探讨逍遥散保护受损肝细胞和抗肝纤维化的作用机制。方法观察不同浓度的逍遥散对CCI4诱导的肝细胞（HL7702）损伤模型及HSC—LX2细胞0D值，ALT，AST，SOD，MDA，LDH，Hyp和TIMP-1的影响。结果0．008-0．200mg·ml^-1逍遥散治疗组的OD值，SOD活力，ALT，AST，LDH，MDA含量，与模型对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）；0．200，0．040mg·ml^-1逍遥散组的OD值、Hyp、TIMP-1含量与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论逍遥散通过提高SOD活性，降低ALT，AST，LDH，MDA含量保护受损的肝细胞，通过抑制肝星形细胞增殖，降低上清液中Hyp和TIMP-1的含量起到抗肝纤维化的作用。

RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制

目的研究RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制，为抑制肝癌细胞生长寻找分子靶点。方法构建siRNA．RhoC载体，建立RhoC基因沉默的肝癌细胞株。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长，硝酸银染色检测细胞增殖，平板克隆实验检测细胞克隆形成能力，流式细胞术（FACS）检测细胞周期，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞周期蛋白表达。PcDNA3-RhoC转染肝细胞，建立RhoC高表达细胞株，检测RhoC基因对正常肝细胞生长的影响。结果siRNA-RhoC载体转染Bel7402细胞后，RhoC基因表达的抑制效率为82．3％。细胞培养第4天，RNAi组吸光度（A）值为0．4 ±sO．10，显著低于Bel7402细胞组（0．73±0．11，P〈0．05）和阴性对照组（0．71±0．07，P〈0．05）。此后，RNAi组的细胞增殖速度持续低于Bel7402细胞组和阴性对照组，直到第7天实验结束。RNAi组的细胞核平均银染颗粒数明显少于Bel7402细胞组和阴性对照组（分别为1．23±0．35、3．47±0．93和3．17±0．78，均P〈0．01）；Go／G，期细胞显著升高[分别为（73．14±5．93）％、（57．05±5．97）％和（52．99±4．80）％，均P〈0．05]；cyclinD1表达下降（分别为0．45±0．21、1．25±0．24和1．12±0．15，均p〈0．05）；CDK4表达下降（分别为0．55±O．08、1．18±0．32和1．10±0．29，均P〈0．05）；p16表达升高（分别为1．07±0．23、0．36±0．12和0．35±0．13，均P〈0．01）；p21表达升高（分别为0．42±0．12、0．174±0．06和0．19±0．08，均P〈0．05）。HL7702细胞转染PcDNA3-RhoC质粒后，Rhoc高表达，至转染的第3天，RhoC转染组A值为0．83±0．10，显著高于HL7702细胞组（0．54±0．11，P〈0．05）和空载体对照组（0．58±0．55，P〈0．05）。其后，RhoC转染细胞生长速度持续高于HL7702细胞组和空载体对照组，直至第7天实验结束。结论RhoC是调控肝癌细胞生长的关键分子，是抑制肝癌细胞生长的良好分子靶点。

叔丁基对苯二酚对人正常肝细胞的毒性

目的:研究叔丁基对苯二酚在大鼠体内代谢后的浓度及在该浓度范围内的体外细胞毒性。方法:大鼠高剂量(700mg/kg)灌胃后,运用液相色谱/质谱联用法检测血清中叔丁基对苯二酚的浓度。以人正常肝细胞HL7702为研究对象,采用MTT法检测叔丁基对苯二酚的细胞毒性,采用倒置显微镜观察细胞形态变化,并评估叔丁基对苯二酚在体内浓度范围内的体外细胞毒性。结果:叔丁基对苯二酚抑制细胞生长,并使细胞形态学特征改变;随着浓度升高(0.01～1.2mmol/L)和细胞培养时间延长(12～48h),其对细胞的毒性作用加剧(细胞毒性等级0～4);细胞培养时间为12、24、48h时,半致死浓度分别为0.63、0.34、0.16mmol/L;大鼠血清中叔丁基对苯二酚的浓度≤0.12mmol/L,细胞毒性等级0～2级。结论:经口进入体内的叔丁基对苯二酚,代谢后的体内浓度不会引起高细胞毒性反应。

血清药理学方法评价叔丁基对苯二酚的安全性

运用血清药理学方法评价食品抗氧化剂叔丁基对苯二酚的毒性。大鼠灌胃700 mg/kg叔丁基对苯二酚后,分别于0.08、0.25、0.50、24.00、48.00 h采血,分离血清。以人正常肝细胞HL7702为研究对象,采用MTT法检测叔丁基对苯二酚、含叔丁基对苯二酚及其代谢物血清的细胞毒性,在倒置显微镜下观察细胞生长形态变化。结果表明:虽然高浓度的叔丁基对苯二酚会抑制细胞生长,并使细胞形态学特征改变,但叔丁基对苯二酚经体内代谢后的血清对细胞生长无显著性抑制作用。因此,在卫生标准许可范围内,叔丁基对苯二酚食用安全。

吴茱萸次碱对肝肾毒性的初步研究

目的:探讨吴茱萸次碱Rutecarpine(Rut)在体外对人正常肝细胞(HL7702)、人胚胎肾细胞(HEK293)的影响,采用共培养体系初步比较Rut对肝肾细胞活力的影响,并选用小鼠进行整体验证。方法:①采用MTT法检测Rut在肝肾细胞单独培养或共培养体系中对细胞活力的影响并采用倒置显微镜对细胞形态进行观察;②给予Rut后,检测肝肾细胞培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),尿素氮(BUN),肌酐(Cr),乳酸脱氢酶(LDH)的变化;③整体实验观察静脉给予Rut对小鼠肝肾功能和组织病理学的影响。结果:①MTT法显示,2,4μg·mL-1的Rut使肝肾细胞活力均下降,且相同浓度下的Rut对肝细胞的抑制作用大于肾细胞;②4μg·mL-1的Rut使肝细胞上清液中的AST,ALP,LDH水平均升高(P<0.01);③整体实验表明,小鼠静脉给予10 mg·kg-1 Rut 7 d后,血清中的ALP水平有极显著的上升(P<0.01),ALT,AST,BUN,Cr水平只出现升高的趋势,病理学检查发现约1/3的小鼠肝脏出现肝细胞核分裂象增多,仅有1只小鼠肾脏出现嗜碱性病变。结论:大剂量Rut可能对肝肾具有一定的毒性作用,肝肾细胞共培养体系与细胞单独培养体系均可用于药物对细胞的毒性研究。