人肠道病毒71型感染免疫抑制恒河猴的分析

目的:通过建立人肠道病毒71型(EV71)感染在免疫抑制恒河猴的动物模型,进一步分析人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖、病理变化以及病毒抗原在不同组织的表达情况。方法:按照每天15 mg/kg的剂量给8只恒河猴口服环孢菌素A连续7 d后造成其免疫抑制状态,再经呼吸道和消化道感染EV71病毒FY23株,对其进行14 d的临床观察后处死,采集各器官组织进行病毒载量检测,同时对不同的组织进行病理学分析和免疫组化分析。结果:感染EV71病毒后,免疫抑制组的临床症状、病毒载量、病理分析和免疫组化结果都明显比非免疫抑制组严重,从病毒对机体造成的影响来看呼吸系统感染较消化系统感染明显严重。结论:本实验分析了人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖的情况,为建立用于EV71疫苗评价的恒河猴动物模型提供了依据,并对未来的EV71疫苗的使用人群范围做出了新的限定。

人肠道病毒分型方法和鉴定技术的研究进展

近年来,随着分子生物学和生物信息学的进步,人肠道病毒基因序列分析应用广泛,基因测序自动化发展迅速,促进了人肠道病毒分型方法和鉴定技术的发展。鉴于新型人肠道病毒不断被报道,人肠道病毒的范围目前明显扩大,本文就人肠道病毒分型方法和鉴定技术研究进展作一综述。

人肠道病毒71型动物模型研究进展

人肠道病毒71型是婴幼儿手足口病的致病原之一,其严重的并发症可导致神经系统疾病,甚至死亡,是近期威胁中国儿童健康的因素之一。目前尚无临床疫苗可以预防该病毒感染,而EV71的动物模型是进行致病机理、疫苗评价和药物等研究的基础。本文对EV71的两种常用动物模型:小鼠和猕猴(Macaca mulatta)模型进行了描述,并对其在研究中的应用给与概括,为研究者选择合适的动物模型提供了依据。

人肠道病毒71型类病毒颗粒在家蚕BmN细胞及幼虫体内的表达

人肠道病毒71型（human enterovirus 71,EV71）是近年来暴发危害较严重的手足口病的病原。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕卵巢培养细胞（Bm N）中共表达EV71病毒衣壳蛋白VP1与VP2,分析二者组装成病毒样颗粒（VLPs）的效率,比较用不同启动子构建重组病毒的表达效果,并利用家蚕幼虫进行2种蛋白质的共表达及VLPs纯化条件的研究。结果表明,重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2与v Bm Bac-vp1-IRES-vp2均可介导EV71的VP1、VP2蛋白在Bm N细胞中表达,并能够组装成病毒样颗粒,但采用Pph及Pp10启动子的表达和组装效率明显高于Pph及IRES启动子组合;将重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2以1×10^4TCID50/头的剂量注射5龄起蚕,Western blotting检测到VP1在幼虫血淋巴中特异性表达,并且随着感染时间的延长表达量增加;经蔗糖梯度密度离心能够有效地纯化蚕体血淋巴中的病毒样颗粒。研究结果为后续EV71疫苗研制奠定了一定的试验基础。

对人肠道病毒及其感染的再认识

长期以来,由于人肠道病毒种类众多,以隐性感染为主,引起的疾病症状从轻到重、表现多样,病原检测手段有限等原因,人们对人肠道病毒及其感染的基础与临床研究缺乏全面了解和认识。随着病毒学、分子生物学等技术的发展,特别是近年来各国频发人肠道病毒所致手足口病的流行,有必要对其及所致疾病再认识。

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的人肠道病毒71型(EV71)感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症。建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础。方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10。使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测。结果与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell,RD细胞)的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡。病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变。病理分析发现:感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一。结论建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具。

人肠道病毒71型亚单位疫苗的研制

目的利用原核表达技术制备人肠道病毒71型(EV71)的亚单位融合疫苗,并通过小鼠模型对其保护效果进行评价。方法在大肠杆菌中融合表达EV71的亚单位肽段,随后将肽段免疫雌鼠,对其交配后产下的幼鼠进行病毒感染,通过检测其组织内的病毒拷贝数和病理变化,对疫苗的保护效果进行评价。结果通过肽段融合的方法,得到五种备选疫苗,分别为VacA,VacB,VacC,VacD和VacE,这五种疫苗均具有一定的体外保护能力,并且VacB和VacC与正常人大脑组织无明显交叉反应。动物模型评价结果显示,VacB和VacE能赋予幼鼠抗病毒感染的保护效果。结论利用EV71的小鼠感染模型评价了针对EV71的亚单位联合疫苗,VacB和VacE的保护效果较好,此外,VacB与人脑组织间无明显交叉反应,可以作为潜在的无神经毒性的临床使用疫苗。

人肠道病毒2A蛋白酶生物学作用研究进展

人肠道病毒(HEVs)是近年来危害亚太地区婴幼儿健康的重要病原体。随着HEVs研究的进展,对其2A蛋白在病毒复制、关闭宿主蛋白合成以及逃避机体固有免疫反应等方面的作用有了进一步的认识。本文主要对2A蛋白酶的生物学功能作一综述,对相关病毒致病机制研究以及2A蛋白开发应用有启发作用。

用于高灵敏检测人肠道病毒71型的纳米金电化学免疫传感器

在玻碳电极表面滴加纳米金,通过纳米金(AuNPs)的生物相容性以固定人肠道病毒71型(EV71)抗体从而制备EV71电化学免疫传感器,该电化学免疫传感器可灵敏检测EV71。在pH 7.0的含有0.1mol·L-1氯化钾和5mmol·L-1 K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的磷酸盐缓冲溶液中,通过循环伏安法考察了该免疫传感器的分析性能。当EV71的质量浓度在0.1~80μg·L-1范围内时,氧化还原探针[Fe(CN6)]3-/4-的氧化峰电流随EV71质量浓度的增大呈线性降低,检出限(3S/N)为0.025μg·L-1。对20μg·L-1的EV71抗原标准溶液测定5次,测定值的相对标准偏差为3.0%。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率在98.3%~100%之间。

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。

人SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的细胞实验证实人清道夫受体B2(hSCARB2)是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型。方法构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠。通过Western Blot和免疫组化检测目的蛋白在各组织中的表达。EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的蛋白表达对病毒感染的促进效果。结果人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍。结论人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能。

噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白

目的利用T7噬菌体展示技术筛选与人肠道病毒71型3A蛋白相互作用的蛋白。方法构建3A蛋白的原核表达载体,表达并纯化3A蛋白,以3A蛋白为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到产物进行DNA序列分析及同源性研究。结果表达并纯化了3A蛋白,经过4轮筛选后,选择37个阳性克隆,采用T7特异性引物扩增插入片段,将PCR产物送公司进行测序。经过同源性分析,确定了2个与人肠道病毒3A蛋白相互作用蛋白。结论通过T7噬菌体展示技术可以得到与3A蛋白相互作用蛋白,通过研究此蛋白的功能就可以初步推测出3A蛋白可能的功能,为进一步研究人肠道病毒的致病机制鉴定了基础。

人肠道病毒复制子的研究进展

人肠道病毒(human enteroviruses,HEVs)感染人类并造成严重的健康问题。目前缺乏针对HEVs的特异性抗病毒药物,且预防HEVs感染的疫苗的种类有限。HEVs的基因组结构简单且保守,故基于病毒基因组结构的病毒复制子已成为研究HEVs的重要工具,可用于病毒的分子生物学特性、病毒与宿主的关系及抗病毒药物的筛选及疫苗的研发等方面。现就HEVs复制子的研究进展作一综述。

人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的现况研究

手足口病最早由新西兰学者Seddon于1957年报道，1958年加拿大学者Robinson等在手足口病患者的咽拭子及粪便中分离出CA16病毒，CA16病毒第一次被认为是手足口病的病原。1959年英国学者Atsop从患者疱疹液中又分离出CA16病毒，CA16病毒是引起手足口病的病原体进一步被证实，手足口病因患者的临床特点被命名。1969年肠道病毒71在美国1名脑炎患者的脑脊液、粪便中被分离出，1992年EV71型血清型被确定。

非融合绿色荧光蛋白标记EV71型人肠道病毒的构建

目的构建非融合绿色荧光蛋白(EGFP)标记的肠道病毒71型(EV71),为EV71抗病毒机制研究及抗病毒药物的筛选提供方法。方法取野生型病毒EV71,在EV71基因组的3D蛋白编码区后添加HBV的link序列,将EGFP基因连入link与EV71型病毒3'非翻译区之间,构建EGFP标记的EV71病毒基因组,并转染横纹肌瘤RD细胞以获得EV71-link-EGFP重组病毒。采用PCR方法鉴定重组病毒中link、EGFP位置。感染RD细胞后24、48、72、96、120、144和168 h时收获病毒,采用组织半数感染量法测定病毒滴度,绘制病毒生长曲线,比较重组病毒与野生型病毒的生长动力学。RT-PCR测定EGFP转录表达。将重组病毒感染RD细胞后72 h裂解,采用Western blotting法检测RD细胞中GFP、P1蛋白的表达情况。重组病毒感染RD细胞后,经过13轮传代,Western blotting法检测EGFP基因稳定性。结果 RD细胞内表达较强的GFP荧光,病毒感染细胞后病毒的mRNA正常表达,重组病毒中link序列、EGFP基因链接位置正常,证实EV71-link-EGFP重组病毒拯救成功。重组病毒滴度的曲线峰值与野生型病毒滴度的峰值相同。重组病毒中EGFP的表达在48 h时最高。重组病毒中GFP和P1蛋白表达正常稳定。经过13轮传代,第13代重组病毒表达的GFP蛋白与第1代无明显差别。结论通过添加link序列成功构建了非融合表达的EV71-link-EGFP重组病毒,可在RD细胞中良好生长并高效表达EGFP,且具有稳定的遗传性。

2010-2017年天津市滨海新区健康人群人肠道病毒71型血清中和抗体动态变化研究

目的:了解天津市滨海新区健康人群人肠道病毒71型(EV-A71)中和抗体动态变化,为手足口病防控方案提供依据。方法:采集2010-2017年天津市滨海新区健康人的血清学标本368份,进行EV-A71中和抗体测定,并对监测结果进行统计学分析。结果:EV-A71中和抗体阳性率为79.35%;不同年份间的抗体阳性率差异有统计学意义(χ^2=6.695,P=0.01),呈周期性变化;不同年龄组人群的抗体阳性率差异有统计学意义(χ^2=46.531,P<0.01),5岁及以下年龄组抗体阳性率最低为59.26%;5岁以下各年龄组抗体阳性率无统计学差异(χ^2=1.481,P=0.830);不同性别间抗体阳性率差异无统计学意义(χ^2=3.480,P=0.062);以健康人群EV-A71中和抗体阳性率作为应变量,对健康人群的卫生习惯及环境进行Logistic回归分析,发现与没去过医院的相比,半年内去过医院患病风险更大(OR=2.291,95%CI:1.488~4.946)。结论:天津市滨海新区人群EV-A71中和抗体水平较高,易感人群为5岁及以下年龄组儿童,继续加强和完善EV-A71流行监测系统是防控手足口病的重要环节。

新加坡人肠道病毒71型的血清流行病学

人肠道病毒71型(HEV71)已在世界许多地方引起多起大爆发,尤其在南业,有过一些致死的病例。2000年9～10月,在新加坡全国范围内由HEV71感染引起一起手足口病的大爆发。大部分病例是6岁以下的儿童,4例死亡。 在新加坡及世界大部分地区,HEV71感染的流行病学还没有很好地研究。作者于1996年7月～1997年12月的18个月间,在新加坡国立大学医院儿科共观察了856名12岁以下的儿童。

人肠道病毒EV71衣壳蛋白VP4的表达、纯化

人肠道病毒EV71衣壳蛋白VP4,在大肠杆菌中以包涵体形式得到很好表达;VP4包涵体在一系列前处理后,经过镍金属亲和柱层析可以得到95%电泳纯度的目标蛋白.

重视儿童人肠道病毒呼吸道感染

人肠道病毒(enterovirus,EVs)是一类小RNA病毒,主要通过粪-口和呼吸道飞沫途径传播,是儿童呼吸道感染的主要病原体之一。儿童感染后主要表现为亚临床感染或轻度呼吸道症状,如咳嗽、流涕,偶有致重症肺炎、中枢神经系统感染、心肌炎等[1-4]。目前在儿科临床多未开展呼吸道标本EVs常规检测,故EVs在儿童呼吸道感染中的地位常被忽视[5-6]。2014年肠道病毒D68(EV-D68)在全球暴发并导致大量儿童感染重症肺炎、急性弛缓性脊髓炎,欧美地区随之建立全国性EVs监测网络[7-9]。目前除了肠道病毒A71(enterovirus-A71,EV-A71)疫苗外,尚无临床可用的EVs疫苗和无特异性抗EVs药物,但重症EVs感染如能及早诊断、及早使用人静脉丙种球蛋白(intravenous immunoglobulins,IVIG),可能会有临床获益[10-12]。

蓝芩口服液联合利巴韦林气雾剂对手足口病患儿症状恢复时间及病毒转阴率的影响

目的探讨蓝芩口服液联合利巴韦林气雾剂对手足口病患儿症状恢复时间及病毒转阴率的影响。方法选取2021年7月至2023年6月聊城市第二人民医院收治的96例手足口病患儿作为研究对象,按随机数字表法将其分为对照组(48例)和观察组(48例)。对照组采用利巴韦林气雾剂治疗,观察组在对照组基础上采用蓝芩口服液治疗,两组均治疗2周。比较两组临床疗效、症状恢复时间、血清免疫球蛋白水平与病毒转阴率。结果观察组临床总有效率高于对照组,症状恢复时间及住院时间均短于对照组,观察组治疗后免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)水平高于对照组,观察组肠道病毒转阴率与人肠道病毒71型(EV71)病毒转阴率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在利巴韦林气雾剂基础上给予蓝芩口服液治疗能够显著提高临床疗效,快速缓解临床症状,改善免疫球蛋白水平,提升病毒转阴率。