上海市长宁区儿童家长肠道病毒71型灭活疫苗接种意愿及影响因素分析

目的 了解上海市长宁区托幼机构儿童家长为孩子接种肠道病毒71型灭活疫苗(EV71疫苗)的意愿并分析影响因素,为推广EV71疫苗接种提出建议。方法 采用随机抽样的方式抽取长宁区托幼机构就读的儿童,向儿童家长发放问卷进行调查。结果 有75.40%的家长愿意为孩子接种EV71疫苗。Logistic回归分析,不认为EV71会产生强烈副作用、疫苗犹豫量表得分越高、主动获取知识得分越低的家长更愿意为孩子接种EV71疫苗。结论 家长为儿童接种EV71疫苗的意愿受到对EV71疫苗副作用的认知、疫苗犹豫和主动获取知识情况的影响,应对家长开展相关健康教育,以提升接种率。

2018—2020年黔东南少数民族自治州肠道病毒A71型基因特征分析

目的对2018—2020年黔东南州手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)进行鉴定分析,并对肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)VP1编码区进行基因特征分析。方法2018—2020年黔东南州共采集HFMD病例标本2789份,首先,采用荧光定量RT-PCR初筛肠道病毒核酸,阳性病例标本采用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞进行病毒分离,对分离到的病毒株提取病毒核酸,经RT-PCR方法扩增VP1编码区核苷酸序列并进行序列测定。使用MEGA 11.0软件构建遗传进化树进行基因特征分析。结果2789份HFMD标本中检出EV-A71核酸阳性标本为328份,阳性率为11.8%。从部分EV-71阳性患者的咽拭子及肛拭子中,分离培养获得7株病毒株,其中6株来自于轻症病例,另1株为重症病例,均属于EV-A71基因型C4a基因亚型,分成2个不同的簇。7株EV-A71 VP1序列之间核苷酸和氨基酸同源性分别为89.8%~99.9%和98.0%~99.7%;与BrCr原型参考株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为77.1%~78.8%和94.8%~96.6%;并在VP1有18处氨基酸位点发生变异。结论2018—2020年黔东南州EV-A71分离株属于C4a基因亚型,多处氨基酸位点存在变异,可导致多条传播链循环。

湖北肠道病毒EV71型流行株VP1基因以及蛋白结构特征分析

目的全面研究和了解2011年湖北省肠道病毒71型的VP1基因及蛋白结构特征，分析EV71型病毒在湖北省的基因型别，探讨该型病毒在全省的地理分布特征。方法对2011年湖北省8个区市的20株EV71流行株进行VP1区全长基因序列测定，并对核苷酸序列进行同源性比较及系统进化分析，并对VP1蛋白序列的亲水性、柔韧性等二级和三级结构进行分析。结果2011年湖北省EV71型流行株的基因亚型为C4a亚型，其VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性较高，分别为96．5％～98．7％和98．3％～100％。VP1蛋白特征分析发现该区主要免疫表位均没有发生变异且存在较多亲水性区域。二级结构以无规则卷曲为主，其次为8片层。蛋白质同源建模未发现不同毒株间VP1蛋白三级结构差别。结论2011年湖北省Ev71型流行株与我国其它地区的毒株有较高同源性，且存在一定的地理区域聚集性特征和遗传多样性特点。同时综合多种方法预测EV71VP1的二级结构和三级结构，为进一步研究开发相关药品和防治EV71感染提供理论基础。

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建

目的构建肠道病毒71(enterovrius 71,EV71)的感染性克隆,为研究EV71毒力基因及新型疫苗设计等建立一个技术平台。方法用RT-PCR方法扩增出EV71FJ08149株全基因组,通过TA克隆组装进TOPO-XL-PCR载体中,获得全长cDNA克隆pFJ08149T5和pFJ08149T25。应用T7聚合酶系统在体外将线性化后全长cDNA克隆转录出RNA并转染RD细胞。通过间接免疫荧光试验、RT-PCR、序列测定及免疫电镜等对拯救病毒进行鉴定。结果 RNA转染后72h观察到典型的肠道病毒致细胞病变,拯救病毒经RT-PCR、间接免疫荧光和免疫电镜检测鉴定为EV71型,表明已成功构建了EV71感染性克隆。结论本研究成功构建出具有感染性的EV71全长cDNA克隆,为深入研究EV71的致病机制等提供了有利的工具。

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。

河南省2010年肠道病毒EV71型分离株全基因组序列分析

目的:了解2010年河南省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征。方法:筛选2010年河南省分离的EV71型病毒株1株(EV71/Henan/DC/2010),进行全基因组序列测定和基因进化特性分析。结果:EV71/Henan/DC/2010与其他EV71病毒株相比,编码区无核苷酸的缺失或插入,5’UTR区和3’UTR区长度和序列有一定差异。核苷酸同源性比较显示,EV71/Henan/DC/2010与2008年北京暴发流行株同源性最高(99.2%),与安徽阜阳暴发流行株和河南省暴发流行株均具有很高的同源性(98.1%和99.1%);与EV71各亚型代表株的比较结果显示,除VP3区以外,EV71/Henan/DC/2010各区均与C4亚型代表株同源性最高;氨基酸同源性比较结果显示,EV71/Henan/DC/2010大多数核苷酸变异属无义突变,相应氨基酸并未随之发生改变。根据VP1区基因序列构建遗传进化分析树显示,EV71/Henan/DC/2010与C4亚型同属一个分支。结论:EV71/Henan/DC/2010与2008年北京EV71流行株亲缘关系最为接近,同属于C4亚型。与我省及我国既往流行毒株相比,未发生大的变异。

2009年广州人肠道病毒EV71型分离株重组分析

对人肠道病毒EV71型2009年广州分离株Guangzhou09构建序列系统进化树并分析其重组特点。P1、P2和P3区种系发生进化树提示该分离株发生重组,相似性曲线以及bootscan进一步分析显示该分离株于非结构编码蛋白2B片段区(核苷酸位置4 027bp)处存在EV71亚型C4Shanghai-FJ713137与CVA409-HQ728260型间重组。该分离株与中国大陆目前优势株流行趋势一致,是广州首例发生型间重组且由C4亚型及CVA4型发生重组。

我国肠道病毒71型(EV71)疫苗株生物信息学分析

目的 比较3个EV71疫苗株病毒的生物信息学特点,为疫苗的质控和探讨该病毒疫苗的免疫机制提供参考.方法 本研究利用DNAstar MegAlign、DNAMAN Alignment、ANtheProt等生物学软件,比较了我国已进入临床试验的3家EV71全病毒灭活疫苗毒株的基因组及氨基酸序列,并对英衣壳蛋白二级结构及可能存在的抗原表位进行了预测分析.结果 3个疫苗株病毒基因同源性为97％～99％；氨基酸同源性为98％～99％；二级结构一致率在95％以上；均存在35个潜在抗原表位区域.结论 3个疫苗株生物信息学分析结果存在高度的一致性,提示疫苗具有相似的抗原性和免疫原性.

新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制和评价标准的研究

目的研究建立新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制标准和评价体系,为EV71疫苗研发提供基础。方法根据创新型疫苗研发的要求,充分发挥技术优势,开展EV71疫苗质控标准、标准品和评价方法研究。结果与结论建立EV71灭活疫苗的中和抗体和抗原定量测定标准品,统一不同企业疫苗的质控标准,规范疫苗的评价体系,为EV71疫苗的研发提供保障。

肠道病毒EV71型浙江分离株HZ08全基因组序列分析

目的了解浙江省流行的肠道病毒71型HZ08株的基因特征,研究肠道病毒71型的进化及变异状况。方法设计特异性引物,RT-PCR扩增HZ08株全基因,PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定和基因进化分析。结果 HZ08株的全基因组由7 405个核苷酸组成,编码2193个氨基酸。HZ08的5非编码区(UTR)、VP1、VP2、VP3、VP4、P2、P3、3非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的毒株序列较高,分别为96.2%~99.1%,92.6%~99.1%,92.7%~98.4%,88%~99.2%,93.8%~99.5%,89.4%~99.2%,91.4%~98.8%,87.8%~100%和91.1%~98.9%。HZ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%。根据VP1基因和全基因序列进行种系统发生分析显示HZ08株与中国陆和台湾的病毒进化关系较近,与国际标准株以及东南亚毒株进化关系统较远。其中HZ08株与国内流行株BJ08和Fuyang08的进化关系最近。HZ08株与C4亚型相关氨基酸序列一致,VP1的抗原性表位发生了变异。结论 HZ08病毒分离株为C4亚型,与Fuyang08和BJ08株进化途径相同,为肠道病毒71型的基因组功能学和疫苗学研究奠定基础。

基于聚邻苯二胺/石墨烯修饰电极的肠道病毒71型(EV71)电化学免疫传感器

采用改性的Hummers法制备石墨烯氧化物(GO),并将其滴涂在玻碳电极(GCE)表面。通过电化学还原将GO还原为石墨烯,并进一步采用电化学聚合法在石墨烯表面形成聚邻苯二胺(PoPD)膜,从而制备了PoPD/石墨烯修饰GCE。将EV71抗体固定在修饰电极表面,制备新型的电化学免疫传感器。当发生免疫反应时,由于EV71抗原与抗体生成的免疫复合物阻碍了电子的传递,PoPD的氧化峰电流下降。当抗原的浓度在0.1-80ng/mL范围内,PoPD氧化峰电流的降低值与抗原的浓度成正比。该免疫传感器对EV71的检测限为0.08ng/mL(信噪比为3)。

IL-6和IL-13与EV71型肠道病毒感染手足口病患者发病的相关性

目的观察肠道病毒71型(EV71)感染手足口病(HFMD)患者血清白细胞介素(IL)-6和IL-13水平变化情况及其临床意义,并对血清IL-6和IL-13细胞来源进行初步的探讨。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定HFMD患者和健康对照血清中IL-6和IL-13水平,比较不同严重程度的HFMD患者血清中IL-6和IL-13水平,并同时检测HFMD患者治疗后血清IL-6和IL-13水平变化情况。流式细胞术(FCM)分析外周血单个核细胞(PBMC)中单核细胞分泌IL-6和T细胞分泌IL-13的情况。EV71病毒感染健康人单核细胞和T细胞后,FCM检测单核细胞分泌IL-6和T细胞分泌IL-13变化情况。结果 EV71感染HFMD患者血清IL-6和IL-13水平分别为(79.63±29.45)pg/mL和(36.45±15.13)pg/mL,健康对照组血清IL-6和IL-13水平分别为(27.26±7.82)pg/mL和(13.46±3.14)pg/mL,HFMD患者血清IL-6和IL-13水平显著高于健康对照者(P<0.01),同时,随着HFMD患者疾病严重程度增加,血清IL-6和IL-13水平亦逐渐升高(P<0.01)。治疗后HFMD患者血清中IL-6和IL-13水平分别为(48.23±23.14)pg/mL和(23.25±9.63)pg/mL,与治疗前相比显著降低(P<0.01)。HFMD患者外周血单核细胞分泌IL-6水平和T细胞分泌IL-13的水平与健康对照者相比显著升高;EV71病毒处理健康人单核细胞和T细胞后单核细胞和T细胞分泌IL-6和IL-13能力显著升高。结论 EV71病毒可能时通过促进单核细胞分泌IL-6和T细胞分泌IL-13,致使血清IL-6和IL-13水平升高,从而参与HFMD的发生和发展。

肠道病毒EV71新型VLPs疫苗的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)的新型病毒样颗粒(VLPs)疫苗,为手足口病防治奠定基础。方法应用分子克隆技术构建外壳蛋白VP1融合基因cVP1,免疫细胞化学及Western Blot测定该融合基因在HeLa细胞表达情况;将cVP1克隆于杆状病毒表达载体pFastbac1,应用昆虫细胞TN5制备重组杆状病毒cVP1 rBV,再将此重组病毒与本室保存的gag rBV以不同MOI比例共感染昆虫细胞TN5,得到含有VP1的重组嵌合病毒样颗粒cVP1 VLPs,最后以Westem Blot及电镜进行鉴定。结果免疫细胞化学及Western Blot结果显示构建的融合基因cVP1可在真核细胞内表达,并成功制备成cVP1 rBV,该重组杆状病毒和gag rBV共感染昆虫细胞制备的VLPs结构完整。结论成功制备了EV71的新型VLPs疫苗,为后续研究打下了基础。

肠道病毒71型3C蛋白酶原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达肠道病毒71型3C蛋白酶(enterovirus 713C protease,EV71-3Cpro)并制备其特异性多克隆抗体。方法首先依据密码子优化原则合成EV71-3Cpro基因,将其克隆到pET-28a表达载体NdeⅠ和XhoⅠ位点间构建重组质粒,再以冷CaCl 2法将其转化到大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,优化原核表达条件。以HisTrap TM亲和层析柱进行分离纯化,以纯化的EV71-3Cpro作为抗原免疫大鼠,分离血清后以酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质印迹法(western blotting,WB)鉴定多克隆抗体的效价及其特异性。结果ELISA和WB结果显示制备的大鼠抗EV71-3Cpro多克隆抗体效价达1∶1024000,且具有较好的特异性。结论抗EV71-3Cpro多克隆抗体的成功制备为EV71-3Cpro生物学功能的研究及其联合疫苗的开发奠定了实验基础。

USP26负性调控RLR信号通路对肠道病毒71型复制的影响

目的研究泛素特异性蛋白酶26(ubiquitin-specific protease 26,USP26)通过调控RLR信号通路影响肠道病毒71型(EV71)感染的机制和功能,深入了解EV71感染及其逃逸免疫防御关系,为临床治疗EV71感染提供依据。方法利用RT-PCR和Western blot分别检测EV71感染横纹肌肉瘤细胞(RD)0、2、4、8、12、24 h后的USP26 mRNA、VP1 mRNA及其蛋白质的表达水平;在RD细胞中设置转染USP26-siRNA(实验组)和转染阴性对照siRNA(对照组),再用EV71感染RD细胞,收集感染8、12和24 h时的mRNA样本,RT-PCR检测VP1 mRNA的表达情况;收集感染8 h时的蛋白质样本,Western blot检测细胞中MDA5、p-IRF3、IRF3蛋白的表达水平并计算p-IRF3/IRF3的相对比值;利用空斑试验检测病毒滴度水平。结果Western blot和RT-PCR结果表明,EV71感染过程中USP26的表达上调(P<0.05);RD细胞转染后实验组EV71中VP1 mRNA的表达水平明显低于同一时间的对照组(P<0.05),感染8 h实验组中MDA5蛋白和p-IRF3蛋白的表达水平均显著高于对照组(P<0.05);两组IRF3总蛋白的表达水平差异无统计学意义;空斑试验中实验组EV71的病毒滴度显著低于对照组(P<0.05)。结论USP26可通过负性调控RLR信号通路参与抗病毒免疫反应,敲减USP26可抑制EV71在细胞中的复制。

肠道病毒71型(EV71)的检测

目的探讨肠道病毒71型(EV71)的检测方法。方法采用酶联免疫法(ELISA法)、免疫胶体金法(胶体金法)、荧光定量PCR法(PCR法)对1399例手足口病患儿的样本进行检测,并对检测结果进行卡方检验。结果1399例手足口病患儿样本ELISA法、金标法、PCR法结果的阳性率分别为37.8%、36.0%、39.8%,三种方法检验结果无显著性差异(χ2=4.197,P>0.05)。ELISA法与胶体金法及PCR法结果比较均无显著性差异(χ2=0.959,P>0.05;χ2=1.180,P>0.05);胶体金法与PCR法两者之间差异有统计学意义(χ2=4.26,P<0.05)。结论这三种肠道病毒71型(EV71)检测方法无显著差异,但胶体金法方便快捷,PCR法精准,ELISA法可作为常规使用。

上海市普陀区2013—2022年出生队列儿童肠道病毒71型疫苗接种情况分析

目的 分析上海市普陀区适龄儿童肠道病毒71型(EV71)疫苗接种情况。方法 通过上海市免疫规划信息系统收集2013年1月至2022年6月出生儿童EV71疫苗接种信息,应用Excel 2010进行数据整理、采用SPSS 27.0统计学软件进行统计分析。描述性分析出生队列儿童EV71疫苗接种率及其特征。结果 截至2022年底,上海市普陀区2013—2022年出生队列儿童EV71疫苗总全程接种率为44.35%,第2剂完成率为96.44%;常住儿童EV71疫苗第2剂完成率、接种及时率均高于流动儿童(P <0.05)。受种者中,首剂接种年龄在6月龄至2岁的儿童占84.18%;6月龄至1岁接种首剂疫苗的儿童较2~5岁的儿童第2剂及时接种率高(P <0.05)。结论 普陀区需进一步加强健康宣教工作,提高儿童家长防病意识和接种意识,从而提高适龄儿童EV71疫苗接种率。做好适龄儿童,尤其是流动儿童的预防接种管理工作,提高EV71疫苗全程接种率和接种及时率。

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建

肠道病毒71是小RNA病毒科肠道病毒属中的一员,常在婴幼儿中引起手足口病的大范围爆发流行,并能导致重症、甚至死亡病例的发生。

荆门地区肠道病毒EV71型感染的流行病学调查

目的探讨肠道病毒EV71型在湖北荆门地区手足口病流行病学中的重要意义。方法收集2008年荆门地区手足口病临床诊断病例682份,对该病发生地区、时间、人群分布进行统计;分离102份血清、粪便、咽拭子及疱疹液标本的病毒并运用RT-PCR扩增技术对其病原学进行检测。结果该市2008年手足口病城区发病率为113.55/l0万,农村发病率为49.26/10万,城区发病显著高于农村（P〈0.01）;流行季节以春季及初夏为主;病原学检查主要为EV71;2-3岁年龄段多发。结论手足口病流行具有明显的地域、时间、年龄等特点;EV71病毒是手足口病实验室诊断病例的主要病原。