褪黑素调控NLRP3/caspase-1通路减轻脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞损伤

目的探讨褪黑素通过调节核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)通路对脂多糖(LPS)诱导的人肺泡上皮细胞(A549)损伤的影响。方法体外培养A549细胞,分为对照组、LPS组(10 mg/L LPS)、LPS+褪黑素组(LPS+MT组,10 mg/L LPS+800μmol/L褪黑素)、LPS+抑制剂组(10 mg/L LPS+10μmol/L MCC950)。应用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)水平;RT-qPCR法检测细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平;Western blot法检测细胞中NLRP3、caspase-1蛋白表达水平。结果与对照组比较,LPS组A549细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例降低,细胞凋亡率、G0/G1期比例、TNF-α、IL-1β、IL-6水平和NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较,LPS+MT组与LPS+抑制剂组A549细胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例显著升高,细胞凋亡率、G0/G1期比例、TNF-α、IL-1β、IL-6水平和NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论褪黑素可减轻LPS诱导的A549细胞损伤,其作用机制可能与抑制NLRP3/caspase-1信号通路有关。

CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮细胞中的作用

目的:探讨CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮细胞中的作用。以及CD46和Nectin-4之间的相互作用。方法:分为麻疹病毒感染前处理组和感染后2 h组,均用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理人肺泡上皮细胞,并设对照组。检测细胞内病毒滴度的变化,采用Western blot和Real-time PCR检测NP蛋白的表达水平,并运用免疫共沉淀检测CD46与Nectin-4的相互作用。结果:与对照组相比,麻疹病毒感染前用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理的人肺泡上皮细胞内麻疹病毒滴度显著降低,分别为对照组的48.03%和49.53%,同时用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理使病毒滴度下降为27.15%,差异均有统计学意义(P<0.01)。然而,在麻疹病毒感染2 h后用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理,人肺泡上皮细胞内麻疹病毒滴度和NP蛋白量未见显著减少。Western blot和Real-time PCR结果与上述结果一致;免疫共沉淀实验显示,CD46与Nectin-4存在相互作用。结论:CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染肺泡上皮细胞中起到介导作用,CD46与Nectin-4可能存在协同作用,该作用对麻疹病毒的感染起到了增强效果。

右美托咪定对高氧诱导的人肺泡上皮细胞线粒体损伤及HIF-1α/ERK通路的影响

目的:观察右美托咪定(Dex)对高氧诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC线粒体损伤及缺氧诱导因子⁃1α(HIF⁃1α)/细胞外信号调节激酶(ERK)通路的影响。方法:培养HPAEpiC细胞,分为对照(Control)组、高氧模型(Hyperoxia)组、高氧和药物处理(Hyperoxia+Dex)组、高氧和HIF⁃1α激动剂处理(Hyperoxia+DMOG)组以及高氧和药物、HIF⁃1α抑制剂处理(Hyperoxia+Dex+YC⁃1)组。采用活性氧(ROS)检测试剂盒和MitoSOX^(TM) Red荧光染色分别检测细胞中和线粒体中ROS含量;线粒体膜电位检测试剂盒(JC⁃1法)检测线粒体膜电位;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞中HIF⁃1α/ERK通路相关蛋白及核呼吸因子⁃1(NRF⁃1)蛋白水平。结果:与Control组比较,Hyperoxia组HPAEpiC细胞中和线粒体中ROS含量升高,线粒体膜电位降低,细胞凋亡率增高,细胞中HIF⁃1α、p⁃ERK和NRF⁃1蛋白水平降低(P<0.05)。与Hyperoxia组比较,Hyperoxia+Dex组和Hyperoxia+DMOG组HPAEpiC细胞中和线粒体中ROS含量降低,线粒体膜电位升高,细胞凋亡率降低,细胞中HIF⁃1α、p⁃ERK和NRF⁃1蛋白水平升高(P<0.05)。与Hyperoxia+Dex组比较,Hyperoxia+DMOG组和Hyperoxia+Dex+YC⁃1组HPA⁃EpiC细胞中和线粒体中ROS含量升高,线粒体膜电位降低,细胞凋亡率增高,细胞中HIF⁃1α、p⁃ERK和NRF⁃1蛋白水平降低(P<0.05)。结论:Dex可能通过激活HIF⁃1α/ERK通路减轻高氧诱导的人肺泡上皮细胞线粒体损伤。

益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC间质转化的抑制作用

目的探讨益肺汤联合线粒体辅酶Q(MitoQ)对生长转化因子(TGF-β1)诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC间质转化的抑制作用。方法选择细胞株HPAEpiC为研究对象,采用TGF-β1(10 ng/ml)诱导的上皮间质转化模型进行实验。设置空白对照组、模型组、模型+MitoQ组、模型+益肺汤含药血清组、模型+MitoQ+益肺汤含药血清组。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测益肺汤联合MitoQ对细胞存活率的影响。实时荧光定量(qRT-PCR)分析益肺汤联合MitoQ对细胞内E-cadherin、ColⅠ、α-SMA mRNA表达水平的影响,流式细胞术检测细胞内ROS水平变化,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞内GRP78蛋白表达水平。结果与空白对照组比较,模型组细胞存活率明显增加,细胞ColⅠ、α-SMA mRNA表达、GRP78蛋白表达及ROS荧光强度明显增加,细胞E-cadherin mRNA表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,益肺汤联合MitoQ组细胞内ColⅠ、α-SMA mRNA表达有效降低(P<0.05),E-cadherin mRNA表达增加(P<0.01),细胞内GRP78蛋白表达及ROS荧光强度降低(P<0.05)。结论益肺汤联合MitoQ对TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC上皮间质转化有一定的抑制作用,为肺纤维化潜在的治疗药物,其可能的作用机制为下调ColⅠ、α-SMA mRNA及GRP78蛋白表达,上调E-cadherin mRNA表达。

高氧对人肺泡上皮细胞凋亡的影响及其作用机制

目的观察高氧对人肺泡上皮细胞(HPAEC)凋亡的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期HPAEC细胞,随机分为高氧组和对照组。对照组细胞不作处理,放置于50 m L/L CO2培养箱中培养;高氧组细胞换液1次后,以3 L/min速度通入含900 m L/L O2和50 m L/L CO2高纯混合气,通入时间10 min;两组细胞均培养24 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,免疫共聚焦检测细胞组蛋白去乙酰化酶(SIRT1)转位情况,Western blotting法检测细胞SENP1蛋白、乙酰化p53蛋白。结果高氧组和对照组细胞凋亡率分别为24.77%±2.17%、5.33%±2.60%,两组比较,P<0.05。高氧组细胞从正常的长梭形、多角形变成圆形、椭圆形,细胞间的间隙增宽,悬浮的细胞较多;对照组细胞大多为长梭形、多角形,贴壁较好,细胞间的间隙较小,悬浮的细胞较少。高氧组和对照组细胞SIRT1蛋白转位率分别为88.89%、16.23%,两组比较,P<0.05。高氧组和对照组细胞SENP1蛋白相对表达量分别为0.76±0.12、0.67±0.02,乙酰化p53蛋白相对表达量分别为0.81±0.07、0.52±0.03,两组比较,P均<0.05。结论高氧可促进HPAEC细胞凋亡,其机制可能是高氧诱导HPAEC细胞SENP1蛋白表达增加,进而SIRT1蛋白从胞核转位到胞质,使乙酰化p53蛋白表达增加。

LncRNA TUG1靶向miR-222-3p对肺炎链球菌诱导的人肺泡上皮细胞损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)对微小RNA(miRNA)-222-3p的靶向调控,以及对肺炎链球菌诱导的人肺泡上皮细胞(HPAEpiC细胞)损伤的影响。方法72株HPAEpiC细胞分为对照(NC)组、肺炎链球菌组(1×10^(8) CFU/mL肺炎链球菌)、肺炎链球菌+Si-NC组、肺炎链球菌+Si-TUG1组、肺炎链球菌+miR-NC组、肺炎链球菌+miR-222-3p组、肺炎链球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC组、肺炎链球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p组,并做相应的感染及转染。实时定量PCR、流式细胞术Western blotting分别检测TUG1、miR-222-3p表达,细胞凋亡,B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl2蛋白)、Bcl2相关X蛋白(Bax蛋白)表达。双荧光素酶报告实验分析TUG1与miR-222-3p的靶向调控。结果肺炎链球菌组HPAEpiC细胞中TUG1表达量、Bcl2蛋白表达量比NC组低,miR-222-3p、凋亡率、Bax蛋白表达量比NC组高,差异均有统计学意义(P<0.05)。肺炎链球菌+Si-TUG1组HPAEpiC细胞的凋亡率、Bax蛋白表达量均高于肺炎链球菌+Si-NC组,Bcl2蛋白表达量低于肺炎链球菌+Si-NC组,差异均有统计学意义(P<0.05)。TUG1靶向调控miR-222-3p的表达。肺炎链球菌+miR-222-3p组HPAEpiC细胞的凋亡率、Bax蛋白表达量比肺炎链球菌+miR-NC组高,Bcl2蛋白表达量比肺炎链球菌+miR-NC组低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与肺炎链球菌Si-TUG1+anti-miR-NC组比较,肺炎链球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p组HPAEpiC细胞凋亡率和Bax蛋白表达量减少,Bcl2蛋白表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TUG1在肺炎链球菌感染的HPAEpiC细胞中低表达,TUG1通过靶向miR-222-3p,抑制HPAEpiC细胞凋亡。

三七总皂苷对人肺泡上皮细胞间质转化的抑制作用

该研究探讨了三七总皂苷对TGF-β1诱导的A549人肺泡上皮细胞间质转化和细胞外基质分解能力的影响。首先应用MTT法检测三七总皂苷对A549细胞增殖的影响,在12.5~200 mg·L^(-1),未发现三七总皂苷对A549细胞增殖有显著性的影响。接着将A549细胞分组。除正常组外,其余各组细胞应用5μg·L-1TGF-β1刺激,其中TGF-β1组正常培养,其他刺激组分别用50,100,200 mg·L^(-1)三七总皂苷干预。收集细胞和上清,先后采用圆形度值评估细胞的形态变化,免疫组化法检测特异性蛋白的表达以及酶联免疫吸附法检测MMP-9和TIMP-1的水平。TGF-β1刺激后,与正常组比较,细胞的形态发生变化,圆形度值显著减少(P<0.01);上皮特征性蛋白E-cad表达显著减少(P<0.05)而间质特征性蛋白α-SMA和FN的表达显著增加(P<0.05)。与TGF-β1组比较,三七总皂苷干预能显著增加圆形度值、降低α-SMA和FN的表达(P<0.05,P<0.01),但对E-cad的表达没有明显的影响。另外,TGF-β1刺激后,细胞分泌MMP-9的能力显著增强(P<0.05),而TIMP-1的分泌量未见显著变化。与TGF-β1组比较,三七总皂苷增加MMP-9的分泌量(P<0.05),减少TIMP-1的分泌量(P<0.05,P<0.01)。上述结果表明三七总皂苷能抑制肺泡上皮细胞的间质转化,促进细胞外基质分解,具有治疗肺纤维化的应用前景。

桑白皮提取物桦木酸对TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC上皮间质转化的抑制作用

目的探讨桑白皮提取物桦木酸对生长转化因子(TGF-β1)诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC上皮间质转化的抑制作用及其可能机制。方法以HPAEpiC细胞为研究对象,采用0.5 ng·mL^-1 TGF-β1诱导的上皮间质转化模型进行实验。设置空白对照组、模型组、桦木酸给药组。MTT法检测桦木酸对HPAEpiC细胞存活率的影响;Real-time PCR分析桦木酸对诱导后的HPAEpiC细胞内miR-200b-5p、miR-200c-5p表达水平及上皮间质转化标志物(Coll、E-cad、α-SMA mRNA)表达水平的影响。酶联免疫吸附法(ELISA)检测桦木酸对诱导后HPAEpiC细胞内羟脯氨酸(HYP)分泌水平的影响。结果桦木酸对HPAEpiC细胞增殖活性呈单向抑制趋势,且增殖抑制率与药物浓度呈依赖关系。与模型组比较,桦木酸可有效抑制诱导后细胞内miR-200b-5p(P<0.05)、miR-200c-5p(P<0.01,P<0.05)表达,同时降低细胞内ColⅠ(P<0.01)、α-SMA mRNA(P<0.05)表达,促进E-cadherin mRNA表达(P<0.01,P<0.05),降低细胞内HYP含量(P<0.01,P<0.05)。结论桑白皮提取物桦木酸对TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞HPAEpiC上皮间质转化有一定的抑制作用,为特发性肺纤维化潜在的治疗药物,其可能的作用机制为抑制miR-200b-5p、miR-200c-5p表达;下调ColⅠ和α-SMA mRNA,上调E-cad mRNA。

地黄对人肺泡上皮细胞间质转化的抑制作用

目的:探讨地黄(环烯醚萜类苷、低聚糖和多糖提取物按照一定比例形成的组合物)对人肺泡上皮细胞间质转化的影响和机制。方法:MTT法分析地黄对A549细胞增殖的影响。TGF-β1诱导A549肺泡上皮细胞的间质转化并进行不同剂量的地黄干预;圆形度定量法和免疫细胞化学法分析细胞形态和细胞E-cad、FN、Collagen-I和α-SMA蛋白的表达;双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞分泌MMP-9和TIMP-1水平。结果:地黄对A549细胞增殖的抑制作用随着剂量的增加而增强,200μg/ml剂量显著抑制细胞增殖(P<0.01)。与正常组比较,TGF-β1组圆形度和E-cad表达显著降低,α-SMA、FN和Collagen-I表达显著升高,MMP-9和TIMP-1分泌量显著增加(P<0.01)。与TGF-β1组比较,50μg/ml、100μg/ml组的圆形度和E-cad表达显著升高,α-SMA表达显著降低;地黄对FN、Collagen-I的表达和MMP-9分泌量没有显著的影响;25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml组TIMP-1分泌量显著增加。结论:地黄能有效抑制A549人肺泡上皮细胞的上皮间质转化,作用机制涉及TGF-β1信号转导通路,尚有抑制MMP-9降解细胞外基质的作用。

沉默Pin1表达抑制高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡

目的研究沉默Pin1表达对高氧诱导人肺泡上皮细胞(A549细胞)凋亡的影响。方法在体外常规培养A549细胞,随机分为对照组、高氧组、空载体组和Pin1-sh RNA组,以3L/min速度向各处理组细胞中通入95%O_2和5%CO_2的高纯混合气10min。培养24h后,倒置相差显微镜下观察细胞形态;流式细胞术检测细胞凋亡率;SP细胞免疫化学法检测细胞凋亡相关蛋白XIAP和Caspase-9表达;荧光显微镜检测细胞线粒体活性氧簇(ROS)及线粒体膜电位。结果高氧组和空载体组细胞均生长状态差,Pin1-sh RNA组活细胞数量较高氧组和空载体组多,但比对照组少。与对照组相比,高氧组和空载体组细胞凋亡率增加、Caspase-9表达增加、XIAP表达降低、ROS含量增加、线粒体膜电位下降(均P<0.05)。而Pin1-sh RNA组与高氧组和空载体组相比,细胞凋亡率下降、Caspase-9表达降低、XIAP表达增加、ROS含量降低、线粒体膜电位升高(均P<0.05),但与对照组相比差异亦有统计学意义(均P<0.05)。结论抑制人肺泡上皮细胞Pin1表达可减轻高氧诱导的细胞凋亡。

特布他林对海水浸泡人肺泡上皮细胞钠钾泵及钠通道的影响

目的探讨特布他林对海水浸泡的人肺泡上皮细胞（A549）钠水转运通道的影响。方法将常规培养的A549细胞分为海水处理（SG）组、特布他林（20txmol／L孵育6h）处理（TG）组和阴性对照（NG）组。采用甲基噻唑基四唑（MTY）法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞的凋亡和坏死情况，Westernblotting法检测钠钾泵仪1亚单位（Na＋／K＋-adenosinetriphosphatase—cd，NKA—od）、钠通道d亚单位（epithelailsodiumchannds—d，a-ENaC）的表达，水解比色法检测Na＋-K＋-ATP酶（Na-／K＋-exchangingATPase，NKA）活性。结果MTI＂法及流式细胞仪检测结果均显示，特布他林处理对海水孵育后细胞的存活率无影响。NG组的NKA—al和仅-ENaC蛋白表达显著高于SG组（P〈0．01）和TG组（t=3．71，3．78，P〈0．01），TG组显著高于SG组（t=2．58，2．64；P〈0．05）。与NG组NKA酶活性[（31．298±5．779）μmol／（mg·h）]比较，sG组[（14．211±3．885）p．mol／（mg·h）]和TG组[（19．521±1．648）μmol／（mg·h）]明显降低（t=2．54，2．71；P〈0．05）；TG组的NKA酶活性[（19．521±1．648）μmol／（mg·h）]较SG组升高（t=2．51，P〈0．05）。结论特布他林不影响人肺泡上皮细胞存活，并且可以抑制海水浸泡引起的仪-ENaC、NKA—cd含量及NKA活性的下降。

非受体酪氨酸激酶Tec在内毒素/脂多糖诱导人肺泡上皮细胞A549白细胞介素8产生中的作用及机制

目的探讨非受体酪氨酸激酶Tec在内毒素/脂多糖(LPS)诱导人肺泡上皮细胞A549促炎性细胞因子白细胞介素8(IL-8)产生中的作用及机制。方法将人肺泡上皮细胞A549用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养液常规培养传代,取第2或第3代细胞进行后续实验。(1)取细胞,按随机数字表法分为6组,每组4孔。空白对照组细胞常规培养2h;单纯LPS组细胞常规培养1h后加入1μg/mL的LPS刺激1h;单纯LFM-A13组细胞于常规培养液中加入75μmol/L的LFM-A13处理1h后更换培养液常规培养1h;25μmol/LLFM-A13+LPS组、75μmol/LLFM-A13+LPS组、100μmol/LLFM-A13+LPS组细胞分别于常规培养液中加入25、75、100μmol/L的LFM-A13处理1h后,均更换培养液并加入1μg/mL的LPS刺激1h。采用蛋白质印迹法检测各组细胞内Tec的蛋白表达情况,采用酶联免疫吸附测定法检测各组细胞培养上清液中IL-8的含量。(2)取细胞,按随机数字表法分为5组,每组4孔。空白对照组细胞常规培养2h;小干扰RNA(siRNA)对照+LPS组细胞用空的慢病毒转染10h后,于常规培养液中加入1μg/mL的LPS刺激2h;Tecmus-298RNAi+LPS组、Tecmus-299RNAi+LPS组、Tecmus-300RNAi+LPS组细胞分别用搭载Tecmus-298RNAi、Tecmus-299RNAi、Tecmus-300RNAi的慢病毒转染10h后,均于常规培养液中加入1μg/mL的LPS刺激2h。采用蛋白质印迹法检测各组细胞内Tec的蛋白表达情况,筛选沉默Tec基因效果最佳的Tec-siRNA。(3)取细胞,按随机数字表法分为4组,每组4孔。空白对照组细胞常规培养2h;病毒对照组细胞转染空的慢病毒10h后,常规培养2h;单纯LPS组细胞于常规培养液中加入1μg/mL的LPS刺激2h;Tec-siRNA+LPS组细胞转染搭载沉默Tec基因效果最佳的Tec-siRNA的慢病毒10h后,于常规培养液中加入1μg/mL的LPS刺激2h。采用蛋白质印迹法检测各组细胞内p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)MAPK的蛋白表达。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。结果(1)与空白对照组比较,单纯LPS组细胞中Tec蛋白表达明显升高(t=9.72,P<0.05),单纯LFM-A13组细胞中Tec蛋白表达无明显变化(t=4.31,P=0.05)。与单纯LPS组比较,25μmol/LLFM-A13+LPS组、75μmol/LLFM-A13+LPS组、100μmol/LLFM-A13+LPS组细胞中Tec蛋白表达明显降低(t=9.72、9.07、16.33,P<0.05或P<0.01)。与空白对照组的(189±22)pg/mL比较,单纯LPS组细胞培养上清液中IL-8含量明显升高[(214±10)pg/mL,t=2.18,P<0.05],单纯LFM-A13组细胞培养上清液中IL-8含量无明显变化[(173±43)pg/mL,t=0.64,P>0.05]。与单纯LPS组比较,25μmol/LLFM-A13+LPS组细胞培养上清液中IL-8含量无明显变化[(204±38)pg/mL,t=0.54,P>0.05],75μmol/LLFM-A13+LPS组、100μmol/LLFM-A13+LPS组细胞培养上清液中IL-8含量明显降低[(144±44)、(137±51)pg/mL,t=3.63、2.55,P<0.05或P<0.01]。(2)与空白对照组比较,siRNA对照+LPS组细胞中Tec蛋白表达明显升高(t=14.24,P<0.01)。与siRNA对照+LPS组比较,Tecmus-298RNAi+LPS组、Tecmus-299RNAi+LPS组细胞中Tec蛋白表达明显下降(t=36.03、18.23,P<0.01),Tecmus-300RNAi+LPS组细胞中Tec蛋白表达无明显变化(t=4.08,P>0.05)。Tecmus-298RNAi+LPS组细胞中Tec蛋白表达最低,遂将Tecmus-298RNAi用于后续实验。(3)与空白对照组的1.16±0.16、0.78±0.11比较,病毒对照组细胞内p38MAPK和ERKMAPK蛋白表达无明显变化(1.66±0.13、0.89±0.11,t=11.09、3.60,P>0.05),单纯LPS组细胞内p38MAPK和ERKMAPK蛋白表达明显升高(2.83±0.29、1.86±0.37,t=9.70、7.23,P<0.05)。与单纯LPS组比较,Tec-siRNA+LPS组细胞内p38MAPK和ERKMAPK蛋白表达明显下降(0.69±0.16、1.03±0.24,t=13.78、4.12,P<0.05或P<0.01)。结论Tec可能通过p38MAPK、ERKMAPK信号通路介导LPS诱导人肺泡上皮细胞A549促炎性细胞因子IL-8的产生和释放。

人肺泡Ⅱ型上皮细胞表面抗原在急性呼吸窘迫综合征患者中的变化及地塞米松的保护作用

目的研究血清人肺泡Ⅱ型上皮细胞表面抗原（KL-6）在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者中的变化，及地塞米松的保护作用。方法采用回顾性研究方法，选择40例ARDS患者，按是否应用地塞米松分为常规治疗组（20例）和地塞米松治疗组（20例）；于ARDS确诊后1、2、3d检测血清KL-6水平（酶联免疫吸附试验）和氧合指数（PaO2／FiO2）变化。设健康对照组20例。结果健康对照组血清KL-6[（243±121）kU／L]和PaO：／FiO2[（452．78±35．86）mmHg，1mmHg=0．133kPa]水平均在正常范围内。常规治疗组和地塞米松治疗组随病情进展血清KL-6（kU／L）、Pa02／FiO2（mmHg）进行性升高。与健康对照组比较，两组1、2、3d血清KL-6明显升高（常规治疗组：980±132、1121±151、1320±143，地塞米松治疗组：697±132、832±125、957±136），PaO2／FiO2明显下降（常规治疗组：125．73±33．26、172．33±22．18、228．32±41．72，地塞米松治疗组：159．92±30．21、230．18±32．78、352．64±48．72），差异均有统计学意义（均P〈0．01）；且地塞米松治疗组血清KL-6较常规治疗组明显下降，Pa02／FiO：较常规治疗组明显升高，差异有统计学意义（均P〈0．05）。结论ARDS患者血清KL-6表达升高，早期应用地塞米松可降低KL-6水平，减轻肺组织损伤。

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸对人肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞转化的调节作用

目的：探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP）是否通过对转化生长因子-β1（TGF-β1）介导的ROCK/SRF/α-SMA信号转导通路活化的调节,阻抑肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转化,即上皮-间质转化（EMT）,进而发挥其抗（矽）肺纤维化的作用.方法：培养人A549肺泡Ⅱ型上皮细胞株,免疫细胞化学显色检测角蛋白、波形蛋白及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达；免疫印迹检测E-钙黏蛋白（E-cad）、波形蛋白及Rho相关卷曲蛋白激酶（ROCK）、血清反应因子（SRF）、α-SMA及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达；Real-Time PCR检测ROCK、SRF、α-SMA的表达情况.结果：在TGF-β1的诱导下,上皮细胞向肌成纤维细胞的形态改变,伴随着上皮标志物角蛋白、E-cad降低,而间质细胞标志物波形蛋白增高,α-SMA表达并增多.与对照组相比,TGF-β1诱导刺激组ROCK、SRF、α-SMA蛋白和基因表达水平上调,Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达上调.给予ROCK阻滞剂Y-27632、Ac-SDKP干预后,ROCK、SRF、α-SMA及Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达显著降低.结论：Ac-SDKP通过阻断TGF-β1介导的ROCK/SRF/α-SMA信号转导通路,阻抑肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化及胶原的合成,进而发挥其抗（矽）肺纤维化的作用.

高氧抑制SIRT1和PGC-1α表达引起肺泡上皮细胞线粒体功能障碍

目的探讨沉默配对型信息调节因子2同源物1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(SIRT1-PGC-1α)信号途径介导高氧对A549人肺泡上皮细胞线粒体功能的影响及其可能机制。方法取对数生长期的人肺泡上皮细胞,随机分为对照组和高氧组。对照组置于37℃、50 mL/L CO2饱和湿度培养箱中培养,高氧组予以950 mL/L O2处理。培养24 h后,Mito SOX^TM染色法检测线粒体活性氧(Mito-ROS)水平,JC-1染色检测线粒体膜电位,实时定量PCR检测线粒体DNA含量及SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子1(NRF1)和线粒体转录因子A(TFAM)mRNA水平,Western blot法检测SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM蛋白水平。结果与对照组相比,高氧组细胞Mito-ROS明显增加,膜电位明显下降;高氧组线粒体DNA含量减少,SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM的mRNA和蛋白表达均下降。结论高氧诱导SIRT1和PGC-1α表达降低引起人肺泡上皮细胞线粒体功能障碍。

人脐带间充质干细胞对感染状态下人肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

【目的】探讨人脐带间充质干细胞(h UCMSC)对感染铜绿假单胞菌(PA)状态下人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)的影响。【方法】人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549(1×105/m L)2 m L与PA(3×104CFU/m L)2 m L共培育6 h后,加入h UCMSC(1×106/m L)2 m L为实验组,加入等量磷酸缓冲液(PBS)为感染组,A549与PBS及培养基共培育为对照组。比较组间A549细胞形态学改变(透射电镜),A549细胞存活率(CCK-8新型细胞增殖检测试剂盒),A549细胞凋亡率(Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪)以及A549肺表面活性物质A(SP-A)表达量(Western Blot)。【结果】电镜细胞形态学观察显示,感染组A549细胞受损明显,胞质出现空泡变性,染色质高度凝集,可见凋亡小体;实验组细胞包膜结构完整,核膜完整,核仁明显,核染色质电子密度低,染色质均一,未见凋亡小体;对照组A549细胞结构完整,细胞膜表面微绒毛丰富,核膜完整,核周间隙结构正常,染色质均一;感染组与对照组相比,感染组A549细胞细胞存活率显著降低[(70.35±2.89)%与(97.37±2.07)%,n=3,P<0.01],凋亡率显著增加[(8.63%±0.16)%与(2.55±0.11)%,n=3,P<0.01],SP-A表达显著降低[(0.105±0.01)与(0.232±0.015),n=3,P<0.01];实验组与感染组相比,实验组细胞存活率显著增加[(85.69±3.07)%与(70.35±2.89)%,n=3,P<0.01],凋亡率显著下降[(6.34±0.12)%与(8.63±0.16)%,n=3,P<0.01],感染组中,PA可能损伤A549细胞,使其SP-A表达量著减少(n=5,P<0.05),实验组中,h UCMSC可能对感染后A549细胞的保护作用,其SP-A表达量增加(n=5,P<0.05)。【结论】h UCMSC能抑制感染状态下的A549细胞凋亡,保护A549细胞分泌SP-A。

和厚朴酚抑制CFP-10、ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症因子表达

目的 研究和厚朴酚（HNK）对早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10）作为特异性抗原刺激人肺泡Ⅱ型上皮细胞（A549）炎症因子表达的抑制作用,探讨抗炎在结核病治疗中的潜在价值.方法 用MTS法检测HNK（0～80μmol/L）对A549细胞的毒性反应,确定合适的药物实验浓度.用ELISA法检测以CFP-10、ESAT-6（0～40μg/ml）为抗原刺激的A549表达IL-8水平,选择最适刺激浓度.将A549细胞与CFP-10,ESAT-6及不同浓度的HNK（0～20μmol/L）共同培养24h后收集培养上清液和细胞,用ELISA法检测各组培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的表达水平,分析HNK对细胞因子的剂量依赖抑制.结果 20μmol/L及以下的HNK浓度对A549细胞无明显毒性反应.抗原最适刺激浓度为5μmol/L.CFP-10,ESAT-6刺激可显著诱导A549细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的产生.HNK（0～20μmol/L）剂量依赖性地抑制CFP-10,ESAT-6诱导的炎症因子的表达.结论 HNK能有效抑制CFP-10,ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性细胞因子的表达.

绵羊肺炎支原体对人肺泡Ⅱ型上皮细胞活性及炎症反应的影响

为探究绵羊肺炎支原体(MO)是否对人体造成潜在影响,本研究以人肺泡Ⅱ型上皮细胞为细胞模型,将MO Y98株荧光染色后感染人肺泡Ⅱ型上皮细胞,于激光共聚焦显微镜下可见MO存在于细胞中;分别利用CCK-8及CellTiter-LumiTM试剂盒检测细胞的增殖及活力,结果显示MO对人肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖及活性均无显著影响;扫描电镜检测细胞形态,结果显示肺泡上皮细胞伪足明显增多;基因芯片分析筛选出3个mRNA及5个lncRNA,荧光定量PCR验证后确定SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1及lncRNA RP11-29G8.3-001在MO感染后的转录水平发生显著变化;荧光定量PCR检测肺泡上皮细胞中IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7等炎症因子,结果显示这些因子基因的转录水平无明显变化;采用将lncRNA RP11-29G8.3-001过表达的方法对其功能进行研究,结果显示少量lncRNA RP11-29G8.3-001表达增高不会调控细胞免疫相关基因的表达。本研究结果表明MO并不降低人肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖及活性,且MO对人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症因子的表达无显著影响,提示MO对人肺泡Ⅱ型上皮细胞影响较小。本研究为防范MO对人呼吸系统存在的潜在影响提供了实验依据。

不同浓度重组人促红细胞生成素对高氧暴露下人肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的影响研究

目的探讨不同浓度重组人促红细胞生成素(rhEPO)对高氧暴露下人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)功能的影响。方法 2017年1—12月,培养A549细胞,取对数生长期的A549细胞,将其随机分为对照组(将细胞置于37℃恒温的50 ml/L CO2培养箱中进行培养)、高氧组(以3 L/min速度通过900 ml/L O2和50 ml/L CO2高纯混合气,持续通气10 min,之后进行密闭培养)及10、20、50、100 U/ml rhEPO组(分别将细胞加入含10、20、50、100U/ml rhEPO的培养基,之后预处理24 h,再用高氧诱导),每组中包含8个复孔。24 h后,采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化,细胞增殖实验检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果高氧组细胞间空隙较大,细胞受损明显,活细胞数量显著降低,悬浮细胞明显增多;10、20、50、100 U/ml rhEPO组细胞损伤改善,50、100U/ml rhEPO组细胞形态学变化与对照组较为相似。高氧组及10、20 U/ml rhEPO组细胞增殖水平小于对照组(P<0.05);10、20、50、100 U/ml rhEPO组细胞增殖水平大于高氧组(P<0.05);50、100 U/ml rhEPO组细胞增殖水平大于10、20 U/ml rhEPO组(P<0.05);100 U/ml rhEPO组细胞增殖水平大于50 U/ml rhEPO组(P<0.05)。高氧组及10、20U/ml rhEPO组细胞凋亡率大于对照组(P<0.05);10、20、50、100 U/ml rhEPO组细胞凋亡率小于高氧组(P<0.05);50、100 U/ml rhEPO组细胞凋亡率小于10、20 U/ml rhEPO组(P<0.05);100 U/ml rhEPO组细胞凋亡率小于50 U/ml rhEPO组(P<0.05)。结论高氧抑制A549细胞增殖、促进A549细胞凋亡,而rhEPO可减轻这种作用,且50、100U/ml rhEPO能有效抑制A549细胞发生损伤。

苹果多酚通过激活AMPK/SIRT1信号通路对LPS诱导的肺上皮细胞自噬反应的影响

目的:探讨苹果多酚通过调节腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1(AMP-activated protein kinase/Sirtuin1,AMPK/SIRT1)信号通路对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺泡上皮细胞(A549)自噬反应的影响。方法:使用不同浓度的苹果多酚提取物(apple polyphenol extract,APE)预处理A549细胞2 h后,LPS诱导A549细胞培养24 h,MTT法检测增殖活性,筛选APE最佳预处理浓度;将A549细胞分为对照组、LPS组(3 mg/L LPS)、LPS+APE组(3 mg/L LPS+20μg/mL APE)、APE+Compound C组(3 mg/L LPS+20μg/mL APE+50μmol/L Compound C),免疫荧光染色观察A549细胞自噬;流式细胞术检测A549细胞凋亡;Western blot法检测细胞中自噬相关蛋白及AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达水平。结果:与对照组比较,经LPS诱导的A549细胞增殖活性、自噬水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达降低,p62蛋白表达及细胞凋亡率升高(P<0.05);与LPS组比较,LPS+APE组细胞增殖活性、自噬水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著升高,p62蛋白表达及细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与LPS+APE组比较,APE+Compound C组A549细胞增殖活性、自噬水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著降低,p62蛋白表达及细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论:苹果多酚通过激活AMPK/SIRT1信号通路提高LPS诱导的肺上皮细胞自噬,降低细胞凋亡。