不同浓度CO_2对肺泡Ⅱ型上皮细胞模型A549细胞活性的影响

目的观察不同浓度的CO2对A549细胞生物学性状的影响,探讨允许性高碳酸血症(PHC)的肺保护机制。方法 A549细胞株,分别采用5%CO2(A组)、10%CO2(B组)、18%CO2(C组)培养。分别于细胞培养24 h、36 h、48 h时,应用噻唑蓝比色法检测各组的细胞活性(吸光度值);采用血气分析仪检测细胞培养液p H值、二氧化碳分压(PCO2)、碳酸氢根(HCO3-);应用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果 (1)3组A549细胞吸光度值随培养时间延长而增高(P<0.05),B组各时点吸光度值均高于A组;与A组比较,C组于36 h、48 h的吸光度值降低(P<0.05)。(2)3组p H值随培养时间延长而降低(P<0.05),B、C两组p H值均低于A组相同时点,C组的p H值较B组更低(P<0.05)。3组PCO2值随培养时间延长而升高(P<0.05),B、C两组各时点的PCO2值均高于A组,C组的PCO2值较B组更高(P<0.05)。3组HCO3-值随时间延长而降低(P<0.05),B、C两组各时点HCO3-均高于A组,C组36 h、48 h时的HCO3-较B组更高(P<0.05)。(3)3组G1峰值和凋亡率随培养时间延长而升高(P<0.05);A组与B组比较,各时点的G1峰值和凋亡率均无统计学差异(P>0.05);与A组比较,C组在24 h、36 h G1峰值明显增高,并于干预后36 h、48 h凋亡率增加(P<0.05)。结论 10%CO2不影响A549的增殖,但可增加A549细胞活性;18%CO2抑制A549细胞的增殖并促进其凋亡。

大鼠肺泡II型上皮细胞系RAE-1的建立及其生物学特性

建立肺泡II型细胞系为研究细胞恶性转化提供实验模型。采用Nycodenz密度梯度离心法分离了大鼠肺泡II型上皮细胞 ,原代培养大鼠肺泡II型上皮细胞并将SV4 0病毒的早期区大T基因转导入上皮细胞 ,建立了可在体外长期稳定传代的细胞系RAE - 1。对此细胞系的生物学特性分析表明 :细胞的基因组中整合了SV4 0T基因 ;染色体分析以非整倍体为主 ,众数染色体为 4 4条 ;细胞不能在软琼脂上形成克隆 ;除了转化特性以外 ,RAE - 1细胞仍保留了正常的上皮组织角蛋白Ck8。

不同液体培养对脂多糖刺激后人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549产生凝血及纤溶因子的影响

目的观察生理盐水（NS）、羟乙基淀粉130／0．4氯化钠溶液（万汶）及乳酸钠林格溶液对脂多糖（LPS）刺激后的人丌型肺泡上皮细胞（AECⅡ）株A549产生凝血及纤溶相关因子的影响，并寻找最佳刺激剂量。方法将处于对数生长期的A549细胞按随机数字表法分为空白对照组、LPS损伤组、NS组、万汶组及林格组，每组再分为20％及40％组；各组加入终浓度为75mg／L的LPS体外刺激A549细胞株，空白对照组仅加普通培养液。培养12h后，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）及实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞中组织因子（TF）、可溶性内皮细胞蛋白C受体（sEPCR）、纤溶酶原激活物抑制因子（PAI—1）、组织型纤溶酶原激活物（t—PA）的蛋白含量及mRNA表达水平，并计算PAI-1／t—PA蛋白和rnRNA的比值。结果与空白对照组比较，LPs损伤组TF、sEPCR、PAI—1、t—PA蛋白含量均明显增高，PAI-1／t—PA蛋白比值也明显增高；LPS损伤组相应的TF、EPCR、PAT-1及t—PA的mRNA表达也明显升高。与LPS损伤组比较，20％、40％NS组TF、sEPCR、PAI-1、t—PA蛋白表达均明显降低，而40％NS组降低更为明显，但仍高于空白对照组，40％NS组PAI-1／t—PA蛋白比值较LPS组明显降低。20％、40％NS组TF和sEPCR的mRNA表达及40％NS组PAI—1和t—PAmRNA表达均较LPS损伤组明显降低，且仍以40％NS组降低较为明显。20％林格组TF和sEPCR蛋白表达较LPS损伤组下降，40％林格组TF、sEPCR蛋白表达却高于LPS损伤组，两组PAI—1及PAI—0／t—PA蛋白比值均高于LPS损伤组，以40％林格组升高明显；20％、40％林格组sEPCRmRNA均较LPS损伤组明冠升高，20％林格组PAI-1mRNA较LPS损伤组降低，而40％林格组PAI—1mRNA较LPS损伤组升高；20％万汶组sEPCR蛋白较LPS损伤组降低，40％万汶组TF及sEPCR蛋白均较LPS损伤组升高；20％、40％万汶组PAI-1、PAI-1／t—PA蛋白比值均高于LPS损伤组，以40％万汶组升高更为显著；20％、40％万汶组sEPCRmRNA及40％万汶组TFmRNA、PAI-1／t—PAmRNA比值均较LPS损伤组升高。20％林格组及20％万汶组TF、TFmRNA、EPCRmRNA、PAI—1、PAI-1／t—PA蛋白比值均高于20％NS组；20％万汶组PAI-1、TFmRNA、EPCRmRNA高于20％林格组；40％林格组及40％万汶组TF、TFmRNA、sEPCR、EPCRmRNA、PAI-1、PAI-1mRNA、PAI—1／tPA蛋白比值均高于40％NS组，40％万汶组TF、TFmRNA、PAI-1、PAI-1mRNA、PAI-1／t—PA蛋白比值高于40％林格组。结论NS、乳酸林格液及万汶培养对LPS损伤后A549细胞产生凝血及纤溶相关因子存在不同影响，NS可抑制LPS刺激后A549细胞TF、sEPCR及PAI-1的合成，且其抑制作用随着培养量的增加而增加；而随着林格液及万汶培养量的增加，对TF、EPCR的合成由抑制逐渐转为促进作用，而对PAI-1则主要表现为促进作用，以万汶作用更为明显。

黄连解毒汤含药血清对脂多糖诱导的肺泡上皮A549细胞炎症反应的作用研究

目的探讨黄连解毒汤对脂多糖诱导的肺泡上皮A549细胞炎症反应的作用,为临床合理应用该方提供理论依据和数据支撑。方法将处于对数生长期的肺泡上皮A549细胞完全随机分为对照组、模型组和低、中、高剂量中药组。对照组加入5%正常大鼠血清;模型组加入含20 mg/L脂多糖的5%正常大鼠血清;低、中、高剂量中药组分别加入含20 mg/L脂多糖的5%、10%、15%黄连解毒汤含药血清。培养24 h后,噻唑蓝法检测肺泡上皮A549细胞活性,酶联免疫吸附试验法检测各组细胞上清中炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α含量,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法分别检测各组细胞CD147和核因子κB p65的mRNA和蛋白表达。结果模型组细胞上清中IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α水平及细胞CD147和核因子κB p65的mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组(均P<0.01)。中剂量中药组和高剂量中药组IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α水平均明显低于模型组和低剂量中药组[(133±14)、(119±14)ng/L比(219±20)、(189±20)ng/L,(308±31)、(288±28)ng/L比(400±39)、(367±35)ng/L,(362±37)、(310±32)ng/L比(473±46)、(448±46)ng/L](P<0.01或P<0.05)。中剂量中药组和高剂量中药组CD147和核因子κB的mRNA和蛋白表达水平均明显低于模型组和低剂量中药组(P<0.01或P<0.05)。结论黄连解毒汤可抑制脂多糖诱导的肺泡上皮A549细胞炎症因子表达,其作用机制与CD147和核因子κB表达下调有关。

维生素D抑制细颗粒物(PM_(2.5))诱导的A549人肺泡上皮细胞自噬及细胞因子释放

目的探讨维生素D(VD)在细颗粒物(PM_(2.5))诱导A549人肺泡上皮细胞发生自噬过程中的作用及对上皮细胞因子产生的影响。方法燃烧器的乙炔扩散火焰上部采集制备PM_(2.5),采用PM_(2.5)体外处理A549细胞,并给予VD或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理。Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)及beclin-1的表达,实时荧光定量PCR检测A549细胞白细胞介素25(IL-25)、IL-33及胸腺间质淋巴细胞生成素(TSLP)的mRNA表达,透射电镜观察自噬体的形成。结果PM_(2.5)导致A549细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、beclin-1蛋白表达增加,自噬体形成增多,给予VD处理后,PM_(2.5)诱导的细胞自噬水平降低;在3-MA抑制A549细胞自噬水平后,PM_(2.5)仍可诱导细胞自噬,且VD依然可逆转PM_(2.5)诱导的自噬;PM_(2.5)通过诱导自噬促进A549细胞分泌IL-25、IL-33及TSLP,而3-MA及VD可抑制该过程。结论VD抑制PM_(2.5)诱导的A549细胞自噬及细胞因子释放,发挥保护作用。

麻黄碱对LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎症和COX-2基因表达的影响

目的探讨麻黄碱对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎症和环氧化酶-2(COX-2)基因表达的影响。方法体外培养肺泡上皮细胞A549,采用10μg/ml LPS干预A549细胞,实验分为Control组(未做任何处理)、LPS组(10μg/ml LPS)和Ephedrine组(10μg/ml LPS和800μg/ml麻黄碱)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和流式细胞术检测3组A549细胞增殖和凋亡能力,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测凋亡相关蛋白剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)和Cleaved Caspase-9的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)的含量,比色法检测超氧化物气化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)的含量,DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(ROS)水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测3组细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达量。结果与LPS诱导的A549细胞相比,麻黄碱能够明显提高LPS诱导的A549细胞增殖能力(P<0.05),增加SOD的活力(P<0.05),减少LPS诱导的A549细胞凋亡(P<0.05),下调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和COX-2的表达(P<0.05),降低TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量及ROS水平(P<0.05)。结论麻黄碱能够有效缓解LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎症损伤和氧化应激,并下调COX-2基因的表达。

miR-141-3p靶向调控HMGB1对LPS诱导的A549细胞损伤的影响

目的探讨miR-141-3p通过靶向调控高迁移率族蛋白1(HMGB1)对脂多糖(LPS)诱导的A549细胞损伤的影响。方法以Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,将miR-141-3p mimics、mimics NC、HMGB1基因过表达质粒(pcDNA3.1-HMGB1)和空载质粒(Vector)分别或共转染至A549细胞中,再采用10μg/ml LPS处理24 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞增殖活性;比色法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p与HMGB1之间的靶向调控关系。结果LPS干预后,A549细胞增殖活性及细胞中miR-141-3p表达水平降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及上清液中LDH活性升高(P<0.05)。过表达miR-141-3p可增强LPS处理后的A549细胞增殖活性(P<0.05),降低细胞凋亡率及细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和上清液中LDH活性(P<0.05)。然而,HMGB1基因过表达可逆转miR-141-3p对LPS诱导A549细胞损伤的改善作用。双荧光素酶报告基因实验证实,HMGB1是miR-141-3p下游靶基因。结论miR-141-3p可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡,降低炎症因子表达水平,改善A549细胞损伤,其作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。

超细碳黑对肺泡Ⅱ型上皮细胞的氧化损伤作用

目的研究超细碳黑(Ulfrafine carbon black,UFCB)对肺泡Ⅱ型上皮细胞A549的氧化损伤作用。方法A549细胞暴露于不同浓度的UFCB颗粒物混悬液(50、200、800μg/ml),染毒24 h后采用噻唑蓝(MTT)法测细胞存活率,测定细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)释放水平和细胞内超氧化物歧化酶(SOD)含量,并通过鲁米诺诱导的化学发光法测定细胞内氧自由基水平。结果随着染毒浓度上升,A549细胞存活率下降,细胞培养上清液中的LDH活力(U/L)逐渐增加,分别为2947.89±157.90、3087.51±157.90和3183.58±118.85 U/L。细胞内SOD含量降低,显示出浓度依赖关系,中、高浓度组结果差异有统计学意义,分别为53.28±4.56和47.62±4.73(U/g prot)。鲁米诺诱导的化学发光平均每秒的照度,随着染毒浓度的增高而逐渐增加,并且与对照组相比差异均有统计学意义。结论UFCB对肺泡Ⅱ型上皮细胞有氧化损伤作用,对颗粒本身渗透进入间隙组织,进一步损伤肺部有一定意义。

盐酸戊乙奎醚对肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤的影响

目的探讨盐酸戊乙奎醚对肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤的保护作用。方法用过氧化氢(H2O2)加入A549细胞培养液中制成A549细胞氧化损伤模型,实验分为空白对照组(C组)、H2O2处理组(H组)和盐酸戊乙奎醚-过氧化氢处理组(P组)。用MTT方法测A549细胞存活率,用TUNEL方法测定细胞凋亡指数,并测定细胞内的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)含量。结果与C组比较,H组的细胞存活率下降,凋亡指数增加,MDA含量上升,SOD、GSH、NADPH的含量下降(P<0.05)。与H组比较,P组的细胞存活率增加,凋亡指数下降,MDA含量下降,SOD、GSH、NADPH的含量增加(P<0.05)。结论盐酸戊乙奎醚对A549细胞过氧化损伤具有保护作用。

慢性阻塞性肺疾病患者C-反应蛋白的变化及LPS诱导下人肺泡型细胞(A549)C-反应蛋白的表达

目的:观察人肺上皮细胞在细菌脂多糖(LPS)诱导下CRP mRNA的表达及CRP分泌.方法:收集临床慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者同步晨痰和血浆,进行CRP ELISA检测;对培养的人肺泡上皮细胞株(A549细胞)给予不同浓度、不同时间LPS刺激,同时设立对照组,细胞处理后提取RNA用于RT-PCR.同时,对培养上清液进行CRP ELISA检测.结果:COPD患者痰中CRP浓度明显高于同期外周血中CRP的浓度(P<0.05).培养的A549在不同浓度和不同时间的LPS诱导下有CRP mRNA表达及CRP的分泌,且呈时间依赖性,与对照组比较有统计学意义(P<0.05～0.01).结论:COPD患者呼吸道内可能存在CRP的自分泌;A549在LPS诱导下存在CRP mRNA的表达及分泌.

鞭毛蛋白致肺微血管内皮细胞炎症诱发共培养肺泡上皮细胞炎症的级联放大效应与信号传导通路

目的探讨鞭毛蛋白感染后炎症级联放大效应与信号传导通路。方法建立Transwell共培养体系，将人肺微血管内皮细胞株（ human pulmonary microvascular endothelial cells, HPMECs ）接种于Transwell小室的下层，培养2h后，将人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549细胞株接种于小室的上层与HPMECs共培养15d。实验分为3组：HPMECs与A549细胞共培养空白对照组、鞭毛蛋白（2μg／mL）感染HPMECs再与A549细胞共培养组（实验组I）、HPMECs加DAPT（Notch信号阻断剂，终浓度10μmol／L）预处理再行鞭毛蛋白感染与A549细胞共培养组（实验组Ⅱ）。用ELISA法检测各组HPMECs和A549细胞培养上清液TNF-α蛋白表达，检测HPMECs上清液Notchl蛋白表达水平。结果与共培养空白对照组比较，鞭毛蛋白感染HPMECs后，共培养HPMECs和A549细胞上清液TNF-α蛋白[（11．45±1．59）pg／mLvs（6．13土0．86）pg／mL，（P〈0．01）、（9．93±1．46）pg／mLvs（5．895：0．83）pg／mL，（P〈0．01）]和HPMECs上清液中Notchl蛋白[（7．03±1．06）pg／mL坩（5．39±0．76）pg／mL，（P〈0．05）]表达水平皆明显升高，提示鞭毛蛋白引起HPMECs炎症，且向A549细胞传导级联放大，而HPMECs使用Notch信号阻断剂处理后，HPMECs上清液Notchl蛋白表达水平明显降低[（3．78±0．53）pg／mLvs（7．03±1．06）pg／mL，（P〈0．01）]，共培养A549细胞上清液TNF-α蛋白表达水平也显著下降[（7．47±1．05）pg／mL坩（9．93±1．46）pg／mL，（P〈0．05）]，表明HPMECs炎症反应经过Notch信号通路传导向A549细胞级联放大。结论鞭毛蛋白感染肺微血管内皮细胞能引起炎症反应，并可能经过Notch信号通路传导向肺泡上皮细胞级联放大。

人脐带间充质干细胞对感染状态下人肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

【目的】探讨人脐带间充质干细胞(h UCMSC)对感染铜绿假单胞菌(PA)状态下人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)的影响。【方法】人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549(1×105/m L)2 m L与PA(3×104CFU/m L)2 m L共培育6 h后,加入h UCMSC(1×106/m L)2 m L为实验组,加入等量磷酸缓冲液(PBS)为感染组,A549与PBS及培养基共培育为对照组。比较组间A549细胞形态学改变(透射电镜),A549细胞存活率(CCK-8新型细胞增殖检测试剂盒),A549细胞凋亡率(Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪)以及A549肺表面活性物质A(SP-A)表达量(Western Blot)。【结果】电镜细胞形态学观察显示,感染组A549细胞受损明显,胞质出现空泡变性,染色质高度凝集,可见凋亡小体;实验组细胞包膜结构完整,核膜完整,核仁明显,核染色质电子密度低,染色质均一,未见凋亡小体;对照组A549细胞结构完整,细胞膜表面微绒毛丰富,核膜完整,核周间隙结构正常,染色质均一;感染组与对照组相比,感染组A549细胞细胞存活率显著降低[(70.35±2.89)%与(97.37±2.07)%,n=3,P<0.01],凋亡率显著增加[(8.63%±0.16)%与(2.55±0.11)%,n=3,P<0.01],SP-A表达显著降低[(0.105±0.01)与(0.232±0.015),n=3,P<0.01];实验组与感染组相比,实验组细胞存活率显著增加[(85.69±3.07)%与(70.35±2.89)%,n=3,P<0.01],凋亡率显著下降[(6.34±0.12)%与(8.63±0.16)%,n=3,P<0.01],感染组中,PA可能损伤A549细胞,使其SP-A表达量著减少(n=5,P<0.05),实验组中,h UCMSC可能对感染后A549细胞的保护作用,其SP-A表达量增加(n=5,P<0.05)。【结论】h UCMSC能抑制感染状态下的A549细胞凋亡,保护A549细胞分泌SP-A。

脂多糖对人肺泡上皮细胞一氧化氮分泌的影响

目的探讨脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导人肺泡上皮细胞(A549)一氧化氮(Nitric oxide,NO)分泌的影响。方法对A549给予不同浓度的LPS,分别收集其培养上清液,用硝酸还原法检测NO浓度。结果不同浓度LPS诱导A549,NO分泌量高于未经LPS诱导的对照组,且具有浓度、时间依赖性。结论LPS诱导A549NO的分泌,提示LPS具有诱导肺泡上皮细胞急性炎症和氧化应激的作用。

机械拉伸对人Ⅱ型肺泡上皮细胞表达纤溶酶原激活物抑制剂-1的影响

机械通气（MV）是重危患者治疗、手术全麻必不可少的治疗手段.机械通气也能激活肺组织炎症级联反应,促进炎性细胞因子释放,诱发肺损伤（VILI）[1].VILI相关的生物伤一直为国内外研究者关注的重点[2,3],其致病机制复杂,有待于进一步阐明.纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）是纤溶的调节剂（uPA）,在肺部炎症中也发挥重要的作用[4,5].本研究拟通过对机械拉伸A549细胞PAI-1表达的影响,探讨机械通气致肺损伤的机制.

腺病毒E1A基因对肺泡上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 探讨腺病毒E1A基因对细菌脂多糖(LPS)所致肺泡上皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法 通过脂质体转染的方法将腺病毒E1A基因转染肺泡上皮细胞(A549细胞)，经G418筛选、Westem blot鉴定E1A阳性表达A549细胞单克隆，不同浓度的LPS活化，测定不同时间细胞ICAM-1表达。结果 与未转染和空质粒转染A549细胞相比较，经LPS活化后E1A阳性表达A549细胞ICAM-1表达显著增加，且呈浓度和时间依赖性。结论 腺病毒E1A基因显著增加LPS所致的气道上皮细胞ICAM-1表达，提示腺病毒潜伏感染可能通过放大外界刺激因素所致的气道炎症反应在COPD的发病中发挥重要作用。

miR-23b-3p靶向PALM3对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子表达的影响

目的研究miR-23b-3p对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症的作用及机制。方法将肺泡上皮细胞A549细胞分为对照组、感染组、转染组、感染组+转染组;对照组A549细胞常规培养,感染组用1×108 CFU/mL肺炎链球菌培养A549细胞,转染组转染不同载体,感染组+转染组在A549细胞被肺炎链球菌处理前48h进行转染。qRT-PCR检测细胞中miR-23b-3p和paralemmin-3(PALM3)mRNA的水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞中PALM3、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax),酶联免疫法(ELISA)检测肺炎链球菌诱导后细胞培养上清中白介素-6(interleukin 6,IL-6)和白介素-10(interleukin 10,IL-10)的含量;双荧光素酶报告系统验证miR-23b-3p与PALM3的关系。结果与对照组相比,感染组A549细胞中miR-23b-3p、IL-10、Bcl-2含量明显降低(P<0.05),PALM3、IL-6、Bax水平及细胞凋亡率明显升高(P<0.05);过表达miR-23b-3p和干扰PALM3表达均可抑制肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症;miR-23b-3p靶向负调控PALM3的表达;过表达PALM3逆转了过表达miR-23b-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡和炎症的作用。结论 miR-23b-3p靶向PALM3抑制肺炎链球菌诱导的A549炎症和细胞凋亡。

microRNA-130a对肺泡上皮细胞肺表面活性物质合成的影响

目的:探讨microRNA-130a对A549肺泡上皮细胞中肺表面活性物质(PS)合成的影响。方法:体外培养A549肺泡上皮细胞株,应用microRNA-130a模拟物和抑制剂干预细胞,将细胞分为模拟物组(mimic组)、模拟物阴性对照组(mimic-NC组)、抑制剂组(inhibitor组)、抑制剂阴性对照组(inhibitor-NC组)和空白对照组(blank组);采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况;采用RT-PCR法检测microRNA-130a和SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA表达水平;采用Western blot法检测SP-A、SP-B、SP-C、SP-D蛋白表达水平。结果:mimic组microRNA-130a表达水平显著高于mimic-NC组和blank组(P<0.05);inhibitor组microRNA-130a表达水平明显低于inhibitor-NC组和blank组(P<0.05);同一时点各组细胞增殖活力间差异无统计学意义(P>0.05);mimic组SP-A、B、C、D mRNA和蛋白表达水平均显著低于mimic-NC组和blank组(P<0.05);inhibitor组SP-A、B、C、D mRNA和蛋白表达水平均明显高于inhibitor-NC组和blank组(P<0.05)。结论:microRNA-130a可抑制A549肺泡上皮细胞中PS的合成。

脂磷壁酸对A549细胞分泌白细胞介素-8的影响及量效关系研究

严重脓毒症可导致多器官功能不全综合征，其中肺损伤的发生率最高。随着医院内革兰阳性菌感染的逐年增加，1／3-1／2以上的脓毒症是由革兰阳性菌感染导致。脂磷壁酸（LTA）是革兰阳性菌表面与黏附有关的两性线性磷酸甘油多聚体，与革兰阳性细菌的各种生物学效应有关。研究证实，LTA在革兰阳性菌所致脓毒症及脓毒症休克中起了主要作用。本研究以人肺泡上皮样细胞株A549细胞为靶细胞，观察LTA刺激对肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌炎性细胞因子白细胞介素-8（IL-8）及对细胞增殖活性的影响，从而探讨革兰阳性致病菌在肺损伤发生中的病理机制。

自噬在脂多糖诱导的A549细胞炎症反应中的作用及机制研究

目的 探讨自噬在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺泡上皮A549细胞炎症反应中的作用及机制。方法 用LPS刺激A549细胞建立炎症反应模型,按浓度(0、1、5、10μg/mL)和时间(0、4、8、12、24h)分组(各组n=3)。用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理细胞,分为对照组、LPS组、3-MA组、3-MA+LPS组(各组n=3);用自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理细胞,分为对照组、LPS组、RAPA组、RAPA+LPS组(各组n=3)。通过Toll样受体4 (Toll-like receptor 4,TLR4)过表达质粒和siRNA转染A549细胞,实验分为两部分,每部分各分4组(各组n=3):TLR4过表达对照组、TLR4过表达组、TLR4过表达对照+LPS组、TLR4过表达+LPS组;TLR4沉默对照组、TLR4沉默组、TLR4沉默对照+LPS组、TLR4沉默+LPS组。采用CCK-8法检测细胞存活率,免疫印迹法检测炎症指标(NLRP3、Caspase-1、ASC)、自噬指标(LC3B、Beclin-1、P62)、TLR4蛋白表达水平。结果 1μg/mL浓度的LPS刺激12h后,炎症指标(NLRP3、Caspase-1、ASC)、自噬指标(LC3B、Beclin-1、P62)和TLR4蛋白表达均明显升高并达峰值(P<0.05)。与LPS组比较,3-MA+LPS组自噬相关蛋白表达降低,炎症相关蛋白表达升高,TLR4蛋白表达上调;RAPA+LPS组自噬相关蛋白表达升高,炎症相关蛋白表达降低,TLR4蛋白表达下调(P<0.05)。TLR4过表达+LPS组较TLR4过表达对照+LPS组自噬相关蛋白表达降低,炎症相关蛋白表达升高;TLR4沉默+LPS组较TLR4沉默对照+LPS组自噬相关蛋白表达升高,炎症相关蛋白表达降低(P<0.05)。结论 在LPS诱导的人肺泡上皮A549细胞炎症反应中,自噬流对A549细胞具有一定保护作用;TLR4介导自噬流对LPS诱导的人肺泡上皮A549细胞炎症反应进行负向调控。

PLTP在香烟诱导A549细胞合成白介素8中的作用

目的:研究磷脂转运蛋白(Phospholipid transfer protein,PLTP)对香烟诱导人肺泡上皮A549细胞合成白介素8(Interleukin-8,IL-8)的影响。方法:体外培养人肺泡上皮A549细胞株24 h,加入不同浓度的烟草提取物(Cigarette smoking extracts,CSE)共培养24 h;1.0%CSE与A549细胞株共培养6、12、24、48 h;PLTP siRNA预处理后,加入CSE共培养24 h。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测A549细胞增殖情况;实时定量PCR(RT-PCR)检测PLTP和IL-8 mRNA的表达量;蛋白质印迹法(Western blot)检测PLTP的表达量;酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测IL-8相对含量。结果:0.125%烟草提取物促进A549细胞增殖,0.25%、0.5%、1.0%CSE浓度对A549细胞生长无明显影响,而2.0%、4.0%CSE浓度抑制A549细胞增殖;不同浓度的(0.25%、0.5%、1.0%)CSE作用24 h后,PLTP和IL-8 mRNA及蛋白表达量增加,并且IL-8蛋白分泌呈现一定时间依赖性;PLTP siRNA处理后,IL-8表达量明显升高(P<0.001)。结论:PLTP基因缺失促进香烟诱导A549细胞合成IL-8。