马钱子碱通过阻滞细胞周期抑制人肺癌细胞株PC-9增殖

背景与目的已有的研究表明:Cyclin D1和Cyclin E是细胞周期中重要的正性调控因子,其高表达与肿瘤的增殖密切相关。本研究旨在探讨马钱子碱(Brucine)对人肺癌细胞株PC-9增殖的影响,及其与Cyclin D1和Cyclin E表达的影响。方法将PC-9细胞分为4组:空白对照组、DMSO对照组(2‰)、150μM Brucine组、300μM Brucine组。CellTiter-Glo发光法、平板克隆形成实验观察该药对PC-9细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期,qRT-PCR检测细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin E mRNA的表达,Western blot检测细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin E蛋白的表达。结果与对照组比较,CellTiter-Glo发光法、平板克隆形成实验结果显示:Brucine可以抑制人肺癌细胞株PC-9的增殖,并呈时间-剂量依赖性(P<0.01);流式结果显示对细胞周期的影响主要是阻滞PC-9细胞于G0/G1期;qRT-PCR结果显示Cyclin D1、Cyclin E mRNA的表达下调;Western blot结果显示Brucine使Cyclin D1、Cyclin E的表达降低。结论 Brucine能明显抑制人肺癌细胞株PC-9的增殖,机制主要与其通过下调Cyclin D1、Cyclin E表达,进而阻滞细胞周期有关。

微小RNA-338-3p调控信号转导和转录激活因子1对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1表达和细胞凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-338-3p(miR-338-3p)对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1(PD-L1)表达和细胞凋亡的影响及相关机制。方法 体外培养PC-9细胞、PC-9/GR细胞,采用0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00μmol/L吉非替尼处理确定用药浓度;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-338-3p表达。将PC-9/GR细胞分为对照组、miR-338-3p NC组(转染miR-338-3p NC)、miR-338-3p组(转染miR-338-3p模拟物)和信号转导和转录激活因子1(STAT1)抑制剂组(转染miR-338-3p模拟物+100μmol/L氟达拉滨)。4组均添加1.00μmol/L吉非替尼,转染后qRT-PCR检测细胞中miR-338-3p表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白印迹(WB)法STAT1、p-STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 当吉非替尼浓度升高至1.00μmol/L时,PC-9细胞与PC-9/GR细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与PC-9细胞相比,PC-9/GR细胞中miR-338-3p表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。转染后,qRT-PCR结果显示,miR-338-3p组、STAT1抑制剂组的miR-338-3p表达水平均高于miR-338-3p NC组、对照组,差异有统计学意义(P>0.05)。与miR-338-3p NC组相比,miR-338-3p组PC-9/GR细胞增殖率及细胞中PD-L1、Bcl-2蛋白表达水平降低,凋亡率及细胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-338-3p组相比,STAT1抑制剂组PC-9/GR细胞增殖率及细胞中PD-L1、Bcl-2蛋白表达水平升高,凋亡率及细胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-338-3p可抑制EGFR-TKI耐药肺癌细胞株PC-9/GR细胞中PD-L1表达,并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与激活STAT1有关。

沉默肌球蛋白轻链9基因对非小细胞肺癌H1299细胞株增殖及迁移的影响

目的探讨沉默肌球蛋白调节轻链9(MYL9)基因对非小细胞肺癌H1299细胞株增殖及迁移的影响。方法将H1299细胞株分为对照组(CON组)、阴性对照组(NC组)和敲减组(KD组),CON组细胞不进行转染,NC组、KD组分别转染空载短发夹RNA慢病毒和沉默MYL9基因表达的短发夹RNA慢病毒。检测3组细胞MYL9 mRNA表达水平、增殖能力及迁移能力。结果与CON组和NC组比较,KD组MYL9的mRNA相对表达水平、细胞增殖及细胞迁移能力均更低(均P <0. 05)。结论沉默MYL9基因可下调非小细胞肺癌H1299细胞株MYL9基因的mRNA表达水平,降低其增殖和迁移能力。

探讨嵌合内含子对非小细胞肺癌细胞系PC-9上皮间质转化的影响

目的:探讨嵌合内含子(chimeric intron)对人非小细胞肺癌PC-9细胞株上皮间质转化(EMT)的影响和作用。方法:以psiCHECK-2质粒为基本框架,插入嵌合内含子构建出psiCHECK-2-Intron双荧光素酶报告基因重组质粒载体,再将psiCHECK-2-Intron和psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,通过双荧光素酶活性快速检测该重组质粒载体在真核细胞中的表达情况,然后分别应用细胞划痕实验和Matrigel侵袭实验观察PC-9细胞迁移和侵袭能力的变化,再通过qRT-PCR以及Western-Blotting检测EMT相关分子标志物:N-钙黏蛋白(N-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)以及转录因子Snail表达水平的改变。结果:与对照组相比,Intron组PC-9细胞的侵袭能力明显降低(P<0.001),N-cadherin、β-catenin和Snail等相关分子标志物的表达量明显下调(P<0.001)。结论:嵌合内含子能够抑制非小细胞肺癌PC-9细胞株的EMT转化,其作用机制可能与N-cadherin、β-catenin和Snail表达量下调有关。

Cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖凋亡及Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响

目的研究cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法体外培养的PC-3细胞应用cyclopamine处理后,通过MTT测定细胞增殖抑制情况;电镜下观察肿瘤组织形态学变化;流式细胞仪检测凋亡率;Western印迹技术检测Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白的表达变化。结果MTT法结果显示4μmol/L,8μmol/L及12μmol/L浓度的cyclopamine对PC-3细胞增殖有显著抑制作用,与对照组相比差异有显著性(P<0.05或P<0.01),抑制效果都随着浓度的增大及时间的增加而增强。电镜下可观察到典型的凋亡细胞;流式细胞仪检测结果表明cyclopamine诱导PC-3细胞发生凋亡;Western印迹技术的结果:经培养72h后,随着药物浓度增大,Bcl-2蛋白表达呈逐渐减少,而Bax,有活性的caspase-9蛋白表达逐渐增多。结论Cyclopamine抑制PC-3细胞增殖,在一定剂量和时间范围内呈时间、浓度依赖关系,并可诱导其凋亡。Cyclopamine诱导PC-3细胞凋亡可能通过Bcl-2,Bax,caspase-9介导。

nm23-H1基因转染对肺癌细胞MMP-9和TIMP-1表达的影响

目的探讨nm23-H1基因转染对肺癌细胞株基质金属蛋白酶9(MMP-9)和金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)表达的影响。方法利用脂质体介导的基因转染技术,将nm23-H1基因转染入肺癌细胞株L9981;利用半定量RT-PCR技术检测nm23-H1基因转染前后L9981肺癌细胞株TIMP-1、MMP-9基因的mRNA表达;利用流式细胞仪技术检测nm23-H1基因转染前后L9981肺癌细胞株TIMP-1、MMP-9基因的蛋白表达。结果 nm23-H1基因转染后肺癌细胞株TIMP-1 mRNA及蛋白表达上调,MMP-9 mRNA及蛋白表达下调。结论 nm23-H1基因对L9981肺癌细胞株TIMP-1 mRNA与蛋白表达具有正向调控作用,对MMP-9 mRNA与蛋白表达具有负向调控作用。

槲皮素抑制肺癌肿瘤细胞的生长和转移的机制

目的:探讨基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)抑制剂槲皮素对肺癌肿瘤细胞的生长和转移抑制的机制。方法:采用酶联免疫吸附测定法和酶抑制动力学方法研究槲皮素对MMP-9的抑制作用和抑制动力学,MTT分析槲皮素及槲皮素联合组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1,TIMP-1)对肺癌肿瘤细胞株A549的生长和转移的抑制作用,RT-PCR法和Western印迹研究槲皮素对肺癌肿瘤细胞中MMP-9 m RNA,MMP-9蛋白和TGF-β1蛋白表达水平的影响。结果:槲皮素能够诱导肺癌肿瘤细胞A549的凋亡,槲皮素是一种可逆的竞争型MMP-9抑制剂(IC50为5.25μmol/L,抑制常数Ki为2.18μmol/L);随着槲皮素摩尔浓度的增加,MMP-9 m RNA、MMP-9蛋白和TGF-β1蛋白表达均呈现降低趋势;经过槲皮素干预后,肿瘤细胞穿过人工基底膜的能力减弱;低摩尔浓度的槲皮素与TIMP-1联合使用对肺癌肿瘤细胞A549的生长的抑制作用具有协同作用。结论:槲皮素是一个竞争性的MMP-9抑制剂,能够诱导MMP-9的活性降低,并导致MMP-9 m RNA,MMP-9蛋白和TGF-β1蛋白表达的降低,最终对肺癌肿瘤细胞株A549的凋亡起重要作用。

盐酸埃克替尼对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制探讨

目的观察盐酸埃克替尼对非小细胞肺癌PC-9细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期的PC-9细胞,以40μmol/L盐酸埃克替尼培养0、2、4、8、12、24 h,以0、20、40、60、80μmol/L的盐酸埃克替尼处理12 h,采用MTT法检测细胞增殖活性;将对数生长期的PC-9细胞分为给药组和对照组,分别以40μmol/L盐酸埃克替尼、DMSO处理8 h,用流式细胞仪检测凋亡细胞并计算凋亡率,Western blot法检测JAK2、p-JAK2、信号转导与激活因子3(STAT3)、p-STAT3和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白,细胞免疫荧光技术观察并计算STAT3入核细胞百分率。结果随着盐酸埃克替尼浓度的增加及作用时间的延长,PC-9细胞增殖活性逐渐降低,40、60、80μmol/L与0μmol/L-比较,8、12、24 h与0 h比较,P均<0.05。给药组PC-9细胞凋亡率3.70%±0.39%,明显高于对照组的1.40%±0.21%,P<0.05。与对照组比较,给药组p-JAK2、p-STAT3相对表达量均减少(P均<0.05),VEGF蛋白相对表达量亦减少(P<0.01)。给药组STAT3入核细胞百分率为36.48%±2.12%,低于对照组的86.56%±1.82%(P<0.01)。结论盐酸埃克替尼可抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡;其可能通过抑制JAK2-STAT3信号通路活性及STAT3入核,并下调VEGF蛋白表达发挥作用。

广藿香酮对肺癌PC-9细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨广藿香酮对肺癌PC-9细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移和凋亡的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:配制不同浓度的广藿香酮(50,100,150,200,250,300,350,400μmol·L^(-1))处理人肺癌PC-9、A549和95D细胞24,48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖活力,筛选出其中对广藿香酮最敏感的细胞株并确定低、中、高浓度用于后续实验;将PC-9细胞分为对照组和广藿香酮低、中、高浓度组,采用平板克隆实验、Transwell小室实验、划痕愈合实验和流式细胞术分别检测细胞克隆形成、侵袭、迁移能力和细胞凋亡;采用Western blot检测PC-9细胞中PCNA、Vimentin、MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved-caspase-3蛋白的表达。结果:广藿香酮可有效抑制PC-9、A549和95D细胞增殖能力,且呈剂量和时间依赖性,其中PC-9细胞对广藿香酮最敏感;广藿香酮浓度分别为100,150,200μmol·L^(-1)处理PC-9细胞48 h,与对照组比较,广藿香酮低、中、高浓度组中细胞克隆形成、侵袭和迁移能力显著下降,细胞凋亡率显著上升;Western blot结果显示,与对照组比较,广藿香酮低、中、高浓度组PC-9细胞中PCNA、Vimentin、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达显著减少,Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的表达显著增加。结论:广藿香酮能显著抑制肺癌PC-9细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,分子机制可能与下调细胞中PCNA、Vimentin、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达,上调Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的表达有关。

肺癌颅脑转移动物模型建立的比较

目的通过左心室注射、尾静脉注射、胸腔注射3种方法,建立肺癌颅脑转移的动物模型。方法18只BALB/c NUDE裸鼠随机分为三组,分别经左心室注射、尾静脉注射、胸腔注射途径,接种具有颅脑转移潜能的人肺腺癌PC-9细胞(1×10^(6)/0.1 mL),接种后观察裸鼠状态,在裸鼠出现恶病质时处死;解剖裸鼠,肉眼观察肺和颅脑的转移情况,并对其进行HE染色处理。结果左心室注射组:裸鼠注射后18 d开始出现体质量下降,逐步出现恶病质,并于27 d将裸鼠全部处死;解剖观察肺、颅脑无异常;HE染色证实,肿瘤病灶并未在它们的肺部发现;6只裸鼠均有共济失调、偏瘫、跛行的症状,是颅脑转移的病灶引起的。尾静脉注射组:注射后55 d裸鼠体质量开始减轻,92 d开始出现恶病质,处死于112 d;解剖观察肺、颅脑无异常;HE染色证实4只裸鼠身上出现肺部肿瘤灶;6只裸鼠均未发现颅脑转移。胸腔注射组:裸鼠于注射后22 d出现胸壁瘤结;35 d开始有消瘦,恶病质渐起,42 d处死;解剖观察肺部、胸腔见多发肿瘤结节,并胸膜、肋骨、脊柱浸润;HE染色证实6只裸鼠全部表现为肺部转移;6只裸鼠均未发现颅脑转移。结论左心室注射组脑转移率为100%,肺癌颅脑转移动物模型建立的可靠方法是经左心室注射途径。

颈内动脉注射法建立人非小细胞肺癌PC-9细胞脑转移动物模型

目的通过裸鼠颈内动脉注射人非小细胞肺癌PC-9细胞建立肺癌脑转移的实验动物模型。方法7只裸鼠通过手术暴露颈内动脉,注射处于对数生长期的人非小细胞肺癌PC-9(2.0×10^5·mL^-1)细胞100μL。接种后观察裸鼠生活状态并记录其体质量。建模第24天采用小动物核磁共振(MRI)成像仪活体成像后,取出脑组织、HE染色,评价脑内成瘤情况。结果裸鼠颈内动脉注射PC-9细胞后,14 d左右开始出现体质量下降、行动迟缓、嗜睡、弓背等恶液质现象。通过小动物MRI成像仪检测,7只接种裸鼠中有5只扫描到了脑部异常信号,并通过病理切片进一步证实了肿瘤病灶在脑组织中存在,建模成功率为71%。结论颈内动脉注射法技术简单、实验周期短、成功率高,可用于人非小细胞肺癌PC-9细胞脑转移实验动物模型的建立。小动物MRI成像仪可应用于裸鼠脑内肿瘤活体检测,但其准确度和清晰度仍需进一步提高。

多西他赛和吉非替尼不同时序用药对人肺腺癌细胞株PC-9的作用机制研究

目的:观察吉非替尼与化疗药物多西他赛按不同时序用药对表皮生长因子受体(EGFR)突变的肺腺癌细胞株的作用,探索最佳时序用药模式。方法:人肺腺癌EGFR基因19号外显子天然缺失的PC-9细胞株,分别经吉非替尼和多西他赛单独或不同时序联合处理,采用CCK-8法测定各组细胞增殖抑制,FCM法检测细胞凋亡,免疫印迹法检测EGFR下游信号通路蛋白磷酸化EGFR(pEGFR)、磷酸化氨酸/苏氨酸激酶(pAkt)表达。结果:多西他赛作用24 h序贯吉非替尼作用48 h组的肿瘤细胞凋亡明显,Sub-G1期DNA达到34%±2%,同其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:该序贯用药模式存在增效作用,促细胞凋亡的同时对信号通路中的pEGFR、pAkt有抑制作用。

全反式维A酸诱导肺鳞癌细胞凋亡与Rb基因表达的关系

目的研究全反式维A酸(ATRA)诱导肺鳞癌细胞株A2凋亡作用并初步探讨其作用机制,寻找肺癌治疗的新途径。方法体外培养A2细胞,随机分为两组,实验组加ATRA使其终浓度为5μmol/L,对照组加入二甲亚砜使其终浓度为0.1%,继续培养48 h后用流式细胞仪技术分别检测Rb、p53基因表达率,同时用DNA凋亡分析法检测肿瘤细胞凋亡发生率,研究三者之间的相关关系。结果A2细胞实验组中细胞凋亡发生率显著增高(P<0.01),Rb和p53基因表达率显著增强(P<0.01)。A2细胞中凋亡发生率与Rb基因表达率之间正相关(P<0.05),与p53基因表达率之间亦呈正相关关系(P<0.05)。结论ATRA可能通过上调Rb和p53基因表达途径使A2细胞阻滞在G0/G1期,进而诱导肺癌细胞A2凋亡。

吉非替尼获得性耐药的非小细胞肺癌细胞株PC9／AB2相关耐药机制研究

为了探讨吉非替尼获得性耐药的非小细胞肺癌细胞株PC9／AB2的相关耐药机制。