吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株A549/DDP耐药机理的实验研究

目的观察吴茱萸碱逆转人肺腺癌耐药株A549/DDP细胞耐药性的效果并探讨其与阻断NF-κB信号传导通路的相关性。方法采用MTT法检测单用吴茱萸碱、顺铂(DDP)以及两药联用在不同时间对A549/DDP细胞的增殖影响,计算IC50及耐药逆转倍数。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。RT-PCR检测各组MDR1、NF-κB、Bcl-2、MMP-2和VEGF的mRNA表达。Westernblot法检测各组细胞的pIκB-α、pIKKα蛋白表达水平。结果吴茱萸碱0.125mg/L、0.25mg/L针对A549/DDP细胞对DDP的耐药逆转倍数分别为3.668和11.48。RT-PCR显示在吴茱萸碱作用下检测基因的mRNA表达随着吴茱萸碱浓度的增加和时间的延长其表达逐渐下降。当吴茱萸碱与DDP联用时,可明显提高A549/DDP细胞对化疗药的敏感性,凋亡细胞显著增加(P<0.05)。Westernblot法结果提示A549/DDP细胞中pIκB-α的表达水平随着吴茱萸碱作用时间的延长逐渐下降,pIKKα表达则无显著变化。结论吴茱萸碱可以通过抑制IκB-α的磷酸化阻断NF-κB信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加耐药细胞对DDP的敏感性。

cGMP依赖性蛋白激酶抑制肺癌A549/DDP细胞株的顺铂耐药性

目的:观察Ⅰα亚型c GMP依赖性蛋白激酶(c GMP-dependent protein kinaseⅠα,PKGⅠα)和Ⅱ型c GMP依赖性蛋白激酶(PKGⅡ)对肺癌细胞顺铂耐药的影响。方法:用编码PKGⅠα和PKGⅡc DNA的腺病毒载体感染A549/DDP细胞,使其高表达PKGⅠα和PKGⅡ并以相应激活剂激活,用CCK8试剂盒检测顺铂作用后肺癌细胞的增殖活性,蛋白质印迹法检测PKGs对A549/DDP细胞多药耐药性蛋白1(multidrug resistance protein 1,MRP1)和肺耐药相关蛋白(lung resistance related protein,LRP)表达的影响。结果:PKGⅠα和PKGⅡ表达增高并被激活后,均可加强顺铂对A549/DDP细胞增殖的抑制,并明显降低A549/DDP细胞MRP1和LRP的表达。结论:PKGⅠα和PKGⅡ可通过降低耐药相关蛋白MRP1和LRP的表达,抑制A549/DDP细胞的耐药活性,发挥抗癌作用。

榄香烯对人肺癌A549细胞系耐顺铂细胞株多药耐药的改善作用及机制研究

[目的]探究榄香烯(elemene,ELE)对顺铂(cisplatin,DDP)耐药人肺癌A549/DDP细胞系多药耐药的改善作用及其作用机制。[方法]将A549/DDP细胞分为A549/DDP组和ELE组,以四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测24、48、72h时不同浓度ELE对A549/DDP细胞增殖能力的影响。采用DDP及20、40μg·mL^-1 ELE处理A549/DDP细胞,MTT法检测ELE对细胞化疗敏感性的影响,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化,逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)mRNA表达水平,Western blot检测多药耐药基因1(multidrug resistance gene1,MDR1)、肺耐药相关蛋白(lung resistancerelated protein,LRP)及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidy linositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路相关蛋白表达水平。[结果]MTT结果显示,ELE呈时间和剂量依赖性抑制A549/DDP细胞的增殖能力(均P<0.05)。与单独使用DDP比较,20和40μg·mL^-1 ELE提高A549/DDP细胞对DDP的敏感性,降低DDP对A549/DDP细胞的半数抑制浓度(50%inlibiting concentration,IC50),抑制细胞的增殖能力(均P<0.05)和侵袭能力(P<0.05,P<0.01),增加细胞Bax mRNA表达水平,减少Bcl-2 mRNA表达水平(均P<0.05),使A549/DDP细胞MDR1、LRP、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。[结论]ELE可增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性,改善多药耐药现象,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的活化有关。

川芎嗪对肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP凋亡的影响

目的观察不同浓度川芎嗪(TMP)对肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞的凋亡作用及其分子机制。方法应用不同浓度TMP(0.10、0.20、0.40、0.80、1.00mg·mL-1)处理A549/DDP细胞;噻唑蓝(MTT)比色法检测TMP对肺癌耐药细胞A549/DDP增殖抑制的影响,绘制细胞增殖抑制率曲线图;应用细胞流式技术检测A549/DDP的凋亡率;电子显微镜下观察A549/DDP细胞形态学特征的改变;提取A549/DDP细胞蛋白,并通过免疫印迹法检测应激活化蛋白激酶(JNK)、p38蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白表达变化。结果川芎嗪对A549/DDP细胞的增殖抑制率随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增加,有时间和剂量依赖性(P<0.05)。TMP(0.20、0.40、0.80mg·mL-1)处理耐药细胞A549/DDP 72h后,细胞早期凋亡(AV+/PI-)比例分别为13.02%、26.58%、29.84%;电子显微镜下观察到TMP应用后肺癌耐药细胞A549/DDP出现凋亡特征性的凋亡小体;细胞蛋白免疫印迹实验表明,与对照组比较,TMP(0.20、0.40mg·mL-1)处理后A549/DDP细胞磷酸化(p)-p38[(72.03±5.27)、(86.63±5.09)比(47.24±3.64),P<0.05]和p-JNK的表达量[(143.79±3.88)、(163.02±6.35)比(130.18±5.37),P<0.05]增加而p-ERK表现出减少趋势[(62.33±5.61)、(24.00±4.89)比(108.52±6.24),P<0.05]。结论 TMP可能通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP凋亡。

臭椿酮对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP的增敏作用

目的探讨臭椿酮(AIL)对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞系A549/DDP的增敏作用。方法采用MTT检测AIL对A549和A549/DDP细胞活力的影响;Chou-Talalay中效法分析臭椿酮与顺铂的联合用药指数(CI);流式细胞术检测细胞周期及凋亡,Western blotting法检测凋亡相关蛋白表达水平。结果AIL(0.6μmol/L)与DDP(50μg/mL)联合用药有协同作用;细胞周期阻滞在G1期,同时细胞凋亡率升高;Caspase-3和Bcl-2蛋白表达下降,Cleaved Caspase3、Bax、CDK4和CyclinD1的蛋白表达升高。结论AIL可增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性,协同DDP抑制A549/DDP细胞的生长,促进其凋亡。

基因工程腺病毒H101逆转A549/DDP细胞对顺铂耐药性的实验研究

背景及目的:耐药性产生是化疗失败的主要原因之一,克服耐药性的方法之一是使用逆转剂。目前尚无一种理想的、可应用于临床的顺铂(DDP)耐药逆转剂。本研究探讨基因工程腺病毒H101对DDP耐药性的逆转作用及其机制。方法:体外利用人肺腺癌细胞株A549的DDP耐药模型A549/DDP,采用MTT法检测H101对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用。用流式细胞仪(FCM)测定细胞多药耐药蛋白1(multidrugresistantprotein1,MRP1)、谷胱甘肽鄄S鄄转移酶(GST)及TOPO鄄Ⅱ蛋白表达量,荧光鄄考马斯亮蓝法检测细胞内GSH含量,原子吸收法测定细胞内铂浓度。结果:A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为14.3。加入H101后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(IC50)由352.4μmol/L降至61.6μmol/L,逆转倍数为5.7倍。FCM检测结果显示,A549/DDP细胞的GST和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均较A549细胞高,而两种细胞内均未检测到MRP1的表达,经H101处理后的A549/DDP细胞胞内GST蛋白和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均明显下降。A549/DDP胞内GSH含量比A549高2倍多;H101感染A549/DDP细胞后,胞内的GSH含量下降,随着H101剂量的增加,胞内GSH含量逐渐下降,达A549细胞内GSH水平。原子吸收法测定细胞内铂含量的结果显示,A549细胞内铂含量是A549/DDP细胞内铂含量的3倍,加入H101后,A549细胞内铂的含量无明显变化,但A549/DDP细胞内铂的含量明显增加。结论:H101能逆转A549/DDP对DDP的耐药性,H101逆转DDP耐药性的机制可能是减少A549/DDP细胞内GSH和TOPOⅡ蛋白的水平,增加了A549/DDP细胞内铂的蓄积。

槐耳清膏对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖的影响及顺铂耐药逆转作用

目的:探讨槐耳清膏对人肺腺癌A549细胞和A549/DDP细胞增殖的抑制影响及其顺铂耐药细胞A549/DDP的逆转作用。方法:以体外培养的人肺腺癌A549及A549/DDP细胞为实验模型,采用MTT法测定不同浓度槐耳清膏对A549细胞及A549/DDP细胞的增殖抑制率,并运用流式细胞术检测顺铂联合槐耳清膏对A549/DDP细胞的变化,以及增敏作用效应。结果:槐耳清膏对A549细胞及A549/DDP细胞的增殖有明显抑制作用,随着药物浓度的增加,其抑制率逐渐增加,具有明显的量-效关系(P<0.05)。顺铂40μmol/L作用于A549及A549/DDP细胞48 h后,其凋亡率分别为(27.61±3.45)%和(17.93±1.73)%,两组间有统计学差异(P<0.01)。槐耳清膏1 mg/m L作用于人肺腺癌A549和A549/DDP细胞40 h后,再以相同浓度顺铂诱导,A549细胞凋亡率为(32.35±2.68)%,A549/DDP细胞凋亡率为(30.01±3.65)%,两组间无统计学意义,但与单独DDP作用相比,差异具有显著意义(P<0.01)。结论:槐耳清膏能显著抑制人肺腺癌A549及A549/DDP细胞的增殖,诱导细胞凋亡,还可以增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

shRNA下调BAG-1表达降低肺癌A549细胞对顺铂的耐药性

目的:通过载体介导的shRNA下调BAG-1基因(Bcl-2 associated athanogene-1)表达,探讨其对肺癌A549细胞顺铂(cisplatin,DDP)耐药性的影响。方法:构建靶向BAG-1的shRNA干扰载体pGCsi-BAG-1,稳定转染A549细胞。实验组使用稳定转染pGCsi-BAG-1的细胞株(BAG-1-shRNA),阴性对照组使用无关序列质粒转染的细胞株(SC-shRNA),对照组使用未转染的亲本A549细胞株(Control)。Western blotting检测pGCsi-BAG-1转染对A549细胞BAG-1、Bcl-2表达的影响。MTT法、流式细胞术分别检测pGCsi-BAG-1转染对DDP处理后A549细胞的增殖和凋亡的影响。结果:成功构建稳定干扰BAG-1表达的A549细胞株,BAG-1-shRNA组细胞中BAG-1和Bcl-2蛋白表达显著低于SC-shRNA组和对照组(均P<0.05)。随DDP(2.5~40μg/ml)浓度增加,各组细胞增殖抑制率也随之升高,DDP浓度为2.5μg/ml时,BAG-1-shRNA组A549细胞的增殖抑制率即显著高于SC-shRNA组和对照组[(22.26±4.89)%vs(10.07±3.82)%,(8.12±4.09)%,均P<0.05]。与SC-shRNA组和对照组相比,DDP(2.5μg/ml)处理24 h后,BAG-1-shRNA组凋亡率显著升高[(37.8 4±3.62)%vs(16.80±2.81)%、(17.10±3.11)%,P<0.05]。结论:下调BAG-1表达可抑制DDP作用下的A549细胞的增殖并促进其凋亡。

黄芪多糖降低A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药机制研究

目的:研究黄芪多糖对A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药的影响及可能机制。方法:将A549/DDP顺铂耐药肺腺癌细胞分为CON组(未行黄芪多糖及顺铂处理)、APS组(仅用黄芪多糖处理)、DDP组(仅用顺铂处理)及A+D组(黄芪多糖联合顺铂处理),比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因表达的差异。结果:A+D组细胞d 1-d 7吸光度、S期、G 2/M期和PI均显著低于CON组、APS组和DDP组细胞(均P<0.05),G 0/G 1期和凋亡率均显著高于CON组、APS组和DDP组细胞(均P<0.05);APS组和A+D组细胞MDR1和MRP基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05),且均显著低于CON组和DDP组(均P<0.05)。结论:黄芪多糖可显著改善A549/DDP肺腺癌细胞对顺铂耐药性,可能与黄芪多糖显著降低MDR1和MRP有关。

槐耳清膏联合顺铂对人肺癌A549细胞和A549/DDP细胞Bax、Bcl-2及Survivin基因表达的影响

目的研究槐耳清膏与顺铂联合使用对人肺癌细胞A549和A549/DDP Bax、Bcl-2以及Survivin基因表达的影响。方法以体外培养的A549和A549/DDP细胞株为模型,将槐耳清膏进行梯度(将10g槐耳清膏溶解于100mL无血清PRMI-1640培养液中,分别制成0、1.0、3.0、5.0、7.0和9.0mg/mL的槐耳清膏溶液)稀释后与12μg/mL顺铂联合使用作用于A549细胞和A549/DDP细胞,并以无药物刺激作为空白对照组,分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测Bax、Bcl-2以及Survivin基因在A549细胞和A549/DDP细胞表达情况。结果槐耳清膏与顺铂联合使用下,随着槐耳清膏浓度的升高,A549细胞和A549/DDP细胞Bax基因mRNA表达逐渐升高,Bcl-2、Survivin基因mRNA表达逐渐降低,差异均有统计学意义(F=10.21、4.54、7.12,P<0.01,P=0.01,P<0.01;F=12.43、9.17、7.63,P均<0.01)。槐耳清膏与顺铂联合使用的情况下,随着槐耳清膏浓度的升高,A549细胞和A549/DDP细胞Bax蛋白表达量逐渐升高,Bcl-2、Survivin蛋白表达量逐渐降低,差异均有统计学意义(F=8.54、9.38、10.55,P均<0.01;F=15.71、17.98、14.68,P均<0.01)。结论槐耳清膏与顺铂联合使用能够显著提高人肺癌细胞A549和A549/DDP Bax基因表达,降低Bcl-2、Survivin基因表达。

白杨素通过下调Annexin A3逆转人肺腺癌A549/DDP细胞顺铂的耐药性

目的观察白杨素对肺腺癌顺铂(DDP)耐药性细胞A549/DDP耐药敏感性的影响。方法取A549和A549/DDP细胞,qRT-PCR及Western blot法检测膜联蛋白A3(Annexin A3)基因及蛋白表达,CCK-8法测不同浓度白杨素(0、5、25、50、100 mmoL/L)干预后细胞生存率;将A549/DDP细胞分为A549/DDP组、白杨素组(50 mol/L)、Annexin A3过表达组(Annexin A3mimic组)、Annexin A3阴性对照组(Annexin A3 NC)、白杨素+Annexin A3mimic组,另取A549细胞正常培养作为空白对照组;CCK-8法检测细胞对DDP的半数生存浓度(IC50)及耐药指数;qRT-PCR和Western blot法检测Annexin A3基因和蛋白表达水平,流式细胞义监测细胞凋亡率,小鼠荷瘤实验检测移植瘤体积。结果不同浓度的白杨素均能时效依赖性和剂量依赖性降低A549、A549/DDP细胞生存率(P<0.05),选取50 mol/L为实验浓度作用细胞48 h;与A549细胞比较,A549/DDP细胞Annexin A mRNA及蛋白表达、对DDP的IC50、耐药指数均升高,凋亡率降低(P<0.05);与A549/DDP组比较,白杨素组细胞IC50、耐药指数、Annexin A3 mRNA及蛋白表达降低,细胞凋亡率升高(P<0.05),Annexin A3 mimic组细胞IC50、耐药指数、Annexin A3 mRNA及蛋白表达升高,细胞凋亡率降低(P<0.05);Annexin A3基因高表达可减弱A549/DDP细胞对白杨素的敏感性,降低细胞凋亡率(P<0.05);小鼠荷瘤实验证实,与单独的DDP治疗组比较,白杨素与DDP联合治疗可显著降低小鼠A549/DDP移植瘤瘤体体积(P<0.05),Annexin A3基因高表达的小鼠逆转白杨素与DDP联合治疗效果(P<0.05)。结论白杨素可能通过下调Annexin A3表达,逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合SAHA对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其机制

目的:探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对耐顺铂(DDP)的人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其可能的机制。方法:以A549、A549/DDP细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选出5-Aza-CdR和SAHA对A549/DDP细胞的无毒浓度(即对细胞抑制率<10%的药物浓度),并检测出顺铂与无毒浓度5-Aza-CdR和(或)SAHA联合对耐药细胞株的半数抑制浓度(IC50)和耐药指数;采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测48h后各组细胞耐药相关基因MDRl、LRP mRNA的表达;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果:5-Aza-CdR和SAHA对A549/DDP细胞的无毒浓度分别为5μmol/L和1μmol/L,两者均可使A549/DDP细胞对顺铂的IC50值下降,单独或联合应用时逆转倍数分别为1.6、1.8和4.6倍;经5-Aza-CdR和SAHA处理后各组细胞MDRl、LRP mRNA表达均明显减弱,凋亡明显增强,且两者联合具有协同作用(均P<0.05)。结论:5-Aza-CdR和SAHA可以逆转A549/DDP细胞的DDP耐药,且两者联合具有协同作用,其作用机制可能与下调耐药相关基因MDR1、LRPmRNA的表达,减弱肺癌细胞对化疗药物的外排作用有关。

CIK对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP杀伤效应及耐药逆转作用

目的探讨CIK细胞对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP体外杀伤效应及逆转作用。方法用MTT法分别检测顺铂、CIK细胞、CIK联合顺铂对人肺腺癌细胞A549及人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的杀伤活性,计算耐药倍数,逆转倍数。结果①顺铂对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP的50%杀伤浓度(IC50)分别为1.823g/mL、6.392 g/mL,差异有统计学意义(P<0.05),人肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂的耐药倍数(IR)为3.506。②CIK对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP均有杀伤作用,其IC50分别7.657×105个细胞/mL、7.955×105个细胞/mL,差异无统计学意义(P>0.05)。③不同浓度的CIK细胞(1×105,2×105and3×105个/mL)与人肺腺癌细胞共培养后,再加顺铂,其IC50值分别降至1.743g/mL、1.336g/mL、0.883g/mL,差异有统计学意义(P<0.05);计算逆转倍数(FR)分别为(2.369、3.091、4.677)。结论①人肺腺癌细胞A549/DDP较A549对顺铂有明显的耐药性。②CIK对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP均有杀伤作用,杀伤效果在两种细胞中无明显差异。③无毒剂量CIK联合顺铂作用于人肺腺癌细胞A549/DDP,可以增加顺铂对耐药细胞的杀伤活性。逆转倍数随着CIK密度的增加而增大,说明CIK细胞能部分逆转耐药细胞A549/DDP对顺铂的耐药性。

槲皮素联合顺铂调控PI3K/Akt信号通路对肺癌A549/DDP细胞增殖与凋亡的影响

目的研究槲皮素联合顺铂对肺癌A549/DDP细胞增殖与凋亡的影响,并探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路的作用机制。方法将对数生长期人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP分为槲皮素+顺铂组(给予160μmol/L浓度的槲皮素和25μmol/L浓度的顺铂)、顺铂组(给予25μmol/L浓度的顺铂)、槲皮素组(给予160μmol/L浓度的槲皮素)和对照组(不经药物干预)。CCK-8法观察细胞增殖抑制率;流式细胞术计算细胞凋亡率;Western blot检测p-PI3K、p-Akt蛋白水平的表达。结果各组A549/DDP细胞增殖抑制率和细胞凋亡率比较,差异均有统计学意义(F分别=12.26、163.10,P均<0.05)。槲皮素组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率高于对照组,差异均有统计学意义(t分别=20.58、8.54,P均<0.05);顺铂组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率高于槲皮素组,差异均有统计学意义(t分别=2.17、6.32,P均<0.05);槲皮素+顺铂组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率高于顺铂组,差异均有统计学意义(t分别=2.54、5.78,P均<0.05)。各组A549/DDP细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平比较,差异均有统计学意义(F分别=47.88、41.30,P均<0.05)。槲皮素组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平较对照组明显降低,差异均有统计学意义(t分别=4.76、4.09,P均<0.05);顺铂组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平较槲皮素组明显降低,差异均有统计学意义(t分别=2.38、4.34,P均<0.05);槲皮素+顺铂组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平低于顺铂组,差异均有统计学意义(t分别=7.05、10.28,P均<0.05)。结论槲皮素与顺铂联用能够抑制A549/DDP细胞增殖,诱导A549/DDP细胞凋亡,其机制与PI3K/Akt信号通路有关。

aaptamine与顺铂联合用药对人肺腺癌顺铂耐药A549/DDP细胞的协同抑制作用

目的:探讨aaptamine与顺铂(DDP)联合用药对肺癌DDP耐药A549/DDP细胞的协同抑制作用,并阐明其可能的分子机制。方法:取对数生长期A549/DDP细胞,加入不同浓度aaptamine和(或)DDP培养48 h,采用CCK-8法检测aaptamine和DDP的半数抑制浓度(IC50),利用Chou-Talalay中效分析法计算aaptamine和DDP的联合指数(CI),确定最佳联合用药浓度。将细胞分为对照组、aaptamine组(5 mg·L^-1)、DDP组(1 mg·L^-1)和联合用药组(5 mg·L^-1aaptamine+1 mg·L^-1DDP),采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,克隆形成实验检测各组细胞克隆数,划痕实验观察各组细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中耐药和凋亡相关蛋白表达水平。结果:aaptamine和DDP对A549/DDP细胞的IC50分别为19.45和12.86 mg·L^-1。所选择的不同浓度aaptamine和DDP对A549/DDP细胞均有协同抑制作用。细胞增殖实验,与对照组、aaptamine组和DDP组比较,联合用药组细胞增殖活性明显降低(P<0.01)。克隆形成实验,与对照组、aaptamine组和DDP组比较,联合用药组克隆数明显减少(P<0.05或P<0.01)。细胞划痕实验,与对照组、aaptamine组和DDP组比较,联合用药组细胞迁移率明显降低(P<0.01)。流式细胞术检测,与对照组、aaptamine组和DDP组比较,联合用药组细胞凋亡率明显升高(P<0.05或P<0.01)。Western blotting法检测,与对照组、aaptamine组和DDP组比较,联合用药组细胞中三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),B细胞淋巴瘤2原癌基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)/Bcl-2比值明显升高(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,联合用药组切除修复交叉互补基因1(ERCC1)蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:aaptamine和DDP联合用药对A549/DDP细胞具有协同抑制作用,其机制可能与抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调耐药蛋白ABCG2和ERCC1表达水平有关。

鸦胆子油乳注射液体外抑制肺腺癌耐药株A549/DDP增殖作用的研究

目的探讨鸦胆子油乳注射液对肺腺癌顺铂(cisplatin,DDP)耐药株(A549/DDP)体外增殖作用的影响。方法体外培养A549/DDP细胞,MTT法检测鸦胆子油乳注射液对人A549/DDP细胞的抑制作用。流式细胞仪检测鸦胆子油乳注射液对A549/DDP细胞周期和凋亡率的影响。结果 MTT法表明鸦胆子油乳注射液对A549/DDP的细胞抑制率呈剂量依赖性。流式细胞仪证明鸦胆子油乳对其增殖,细胞周期及凋亡率有明显抑制效果。结论鸦胆子油乳注射液能抑制A549/DDP耐药细胞株的增殖,引起细胞周期阻滞,诱导凋亡。

CTR1和ATP7B在人肺腺癌细胞A549的表达及其与顺铂耐药的关系

目的探讨人肺腺癌细胞株A549和肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP对顺铂的耐药机制。方法利用噻唑蓝法检测顺铂对A549/DDP及其亲代细胞株的细胞毒作用和生长曲线的影响,探讨A549/DDP细胞株凋亡敏感性的变化规律。采用Western blot检测该细胞株铜离子转运蛋白1(CTR1)、铜离子转运磷酸化ATP酶(ATP7B)及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)剪切蛋白表达,分析A549细胞对顺铂耐药与CTR1、ATP7B及PARP剪切蛋白表达量的相关性。结果 A549/DDP较其亲代细胞株对顺铂引起的细胞毒性和凋亡敏感性下降;较其亲代细胞株A549/DDP中ATP7B表达增加,CTR1表达降低。结论人肺腺癌细胞株A549对顺铂耐药的产生与细胞凋亡敏感性降低有关,且细胞内ATP7B表达增加,CTR1表达降低,或可作为细胞对顺铂的增敏靶点。

利用CRISPRi技术沉默MRP1基因增强A549/DDP细胞对顺铂的敏感性

目的:采用CRISPRi技术沉默人肺癌A549/DDP细胞MRP1基因表达,观察细胞对顺铂敏感性的变化。方法:采用生物信息学软件分析MRP1启动子序列,设计合成3对sgRNA干扰片段,定向克隆到pSPgRNA载体中,构建靶向MRP1的干扰表达载体,分别与dCas9表达载体共转染A549/DDP细胞。实验共分为5组,分别为A549/DDP细胞组,Scrambled组,sgRNA-MRP1-1组,sgRNA-MRP1-2组和sgRNA-MRP1-3组,每组设置3个复孔,处理48 h后进行后续实验。通过qRT-PCR和Western blot检测MRP1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞对药物的敏感性,激光共聚焦显微镜下观察细胞的形态变化。结果:成功构建了sgRNA-MRP1-1、sgRNA-MRP1-2和sgRNA-MRP1-33种干扰载体,分别与dCas9表达载体共转染A549/DDP细胞后,均能显著降低细胞MRP1基因表达(P<0.01),其中sgRNA-MRP1-2干扰效果最好,MRP1 mRNA水平降低了72%,蛋白水平降低了53%。将sgRNA-MRP1-2转染细胞后,细胞对顺铂的敏感性显著增加,IC值由74.26±3.71降低至34.29±2.51,细胞形态由梭形变为椭圆形,染色质高度凝聚、边缘化,产生凋亡小体。结论:成功构建3种靶向MRP1的干扰表达载体,均能有效沉默A549/DDP细胞中MRP1基因表达,可增强细胞对顺铂的敏感性。

miR-184对顺铂耐药肺癌细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白表达的影响

目的:探讨miR-184对顺铂耐药的肺癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。方法:选择人肺腺癌A549和鳞癌SKMES1细胞系分别建立顺铂耐药细胞模型。构建miR-184过表达和低表达质粒载体并成功转染耐药A549和SKMES1细胞,构建过表达和低表达miR-184的耐药细胞。实验分为对照组(未处理的肺癌细胞)、耐药组、过表达组和低表达组,各组细胞培养24、48和72 h后采用MTT法检测细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,培养72 h后Western blot法检测细胞中PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达。结果:耐药组A549和SKMES1细胞中miR-184表达水平高于对照组(P<0.05)。与对照组比较,耐药组A549和SKMES1细胞增殖率升高;与耐药组比较,过表达组A549和SKMES1细胞增殖率升高,而低表达组降低(P<0.05)。与对照组比较,耐药组A549和SKMES1细胞凋亡率降低;与耐药组比较,过表达组A549和SKMES1细胞凋亡率降低,而低表达组升高(P<0.05)。与对照组比较,耐药组A549和SKMES1细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达水平升高;与耐药组比较,过表达组A549和SKMES1细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达水平升高,而低表达组降低(P<0.05)。结论:miR-184可能通过激活PI3K/AKT/mTOR细胞信号通路,促进顺铂耐药肺癌细胞增殖、抑制细胞凋亡。

转录因子SP1通过调控ABCC1影响小细胞肺癌H446/DDP细胞耐药的机制

目的:探讨敲减转录因子特异蛋白1(SP1)对小细胞肺癌(SCLC)H466/DDP细胞顺铂(DDP)耐药的影响及其分子机制。方法:构建敲减SP1同时过表达ATP结合盒亚家族C成员1(ABCC1)的SCLC H466/DDP细胞,采用IHC法检测SP1、ABCC1在非耐药和耐药SCLC组织中的表达,用Spearman r法分析SP1与ABCC1在SCLC组织中表达的相关性;WB法检测SP1、ABCC1、CD44在转染后H446/DDP细胞中的表达;CCK-8法、FCM术、微球实验检测转染后H446/DDP细胞的增殖、凋亡及自我复制能力的变化;染色质免疫共沉淀(CHIP)实验检测SP1是否是ABCC1的转录因子。结果:耐药细胞H446/DDP和耐药SCLC组织中的SP1、ABCC1蛋白水平均高于H446细胞和非耐药SCLC组织(均P<0.05),SCLC组织中的SP1、ABCC1蛋白表达呈正相关;敲减SP1抑制H446/DDP细胞的增殖活力,降低CD44、ABCC1蛋白表达水平、减少细胞微球形成数(均P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05);SP1是ABCC1的转录因子。结论:转录因子SP1通过调控ABBC1的表达影响SCLC H446/DDP细胞的耐药,SP1是SCLC对DDP耐药的潜在治疗靶点。