松果菊苷对人肺癌HCC827细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的探讨松果菊苷对人肺癌HCC827细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法采用MTT法、以酶标仪分别检测松果菊苷(0,5,10,20,40,80,160μmol/L)和顺铂(0,5,10,20,40,80,160,320μmol/L)条件下HCC827细胞的生长情况,并计算细胞增殖率及半数致死浓度(LC_(50));实验分为阴性对照组(等体积培养基)、阳性对照组(顺铂80μmol/L)及松果菊苷低、中、高剂量组(实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,20,40,80μmol/L)。采用细胞划痕法检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,实时荧光定量聚合酶链式反应法及Western blot法分别检测细胞中转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ)、Smad 2和Smad 3 mRNA及蛋白表达水平。结果松果菊苷和顺铂的LC_(50)分别为(47.50±6.21)μmol/L和(76.85±14.89)μmol/L。与阴性对照组比较,阳性对照组和实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的细胞迁移距离均显著缩短,细胞凋亡率均显著升高,TβRⅠ、Smad 2和Smad 3 mRNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论松果菊苷可抑制HCC827细胞增殖及迁移,并促进细胞凋亡,机制可能与抑制TβRⅠ/Smad信号通路激活有关。

吉西他滨对人非小细胞肺癌HCC827活性和凋亡的影响

目的：研究吉西他滨对人非小细胞肺癌HCC827细胞活性以及凋亡的影响,以及与Bcl-2表达的关系。方法：采用cell counting kit-8法、细胞核Hochest33258染色法、流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法等多种方法,体外研究吉西他滨对人非小细胞肺癌HCC827的活性、凋亡和细胞周期的影响;采用Western blot法,观察药物作用后细胞中Bcl-2蛋白表达的变化。结果：吉西他滨（0.1～1 000 ng/ml）对人非小细胞肺癌HCC827活性具有抑制作用,并有促凋亡效应。此外,可以将细胞阻滞在S期。在吉西他滨诱导的细胞凋亡过程中,凋亡因子Bcl-2蛋白的表达下调。结论：吉西他滨可以抑制人非小细胞肺癌HCC827细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,S期周期阻滞,其诱导的凋亡可能是其杀死肿瘤细胞的主要机制之一,此外,凋亡与相关基因Bcl-2蛋白的表达具有一定关系。

芹菜素对非小细胞肺癌细胞HCC827增殖、凋亡的影响及机制

目的探究芹菜素(API)对非小细胞肺癌HCC827细胞增殖、凋亡的影响。方法体外常规培养HCC827细胞,取对数细胞进行实验,API的浓度分别设为0、10、20、40、80μmol/L。噻唑蓝(MTT)法测定不同浓度的API对细胞的生长抑制作用;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率; Western印迹方法检测API对环氧化酶(COX)-2蛋白表达的影响。结果 API能够有效抑制非小细胞肺癌HCC827细胞的增殖,随着芹菜素浓度的增加、作用时间的延长其作用效果更明显(均P<0. 05)。不同浓度的API作用24 h后,细胞的凋亡率逐渐增加,呈现一定浓度依赖性(均P<0. 05); API处理细胞组COX-2蛋白的表达量显著降低,且呈浓度依赖性(均P<0. 05)。结论 API能够抑制非小细胞肺癌HCC827细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与调控COX-2蛋白的表达有关。

甘草酸通过调控miR-142/ZEB1分子轴影响非小细胞肺癌HCC827和A549细胞的恶性生物学行为

目的:探讨甘草酸(GA)通过调控miR-142/锌指E盒结合的同源盒蛋白1(ZEB1)分子轴对非小细胞肺癌(NSCLC)HCC827和A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:HCC827和A549细胞培养和转染完成后,分成4组:NC组(未经转染+3mmol/L GA)、miR-142 inhibitor组(敲降miR-142+3 mmol/L GA)、pcDNA3.1-ZEB1组(过表达ZEB1+3 mmol/L GA)和pcDNA3.1-ZEB 1+miR-142mimic组(过表达ZEB1及miR-142+3 mmol/LGA)。采用qPCR检测不同浓度GA处理后HCC827和A549细胞中miR-142的表达水平,WB实验检测HCC827和A549细胞中ZEB1蛋白的表达水平,采用MTT和Transwell检测HCC827和A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力,采用双荧光素酶报告基因检测miR-142与ZEB1的靶向关系。结果:GA显著抑制HCC827和A549细胞的增殖、侵袭和迁移,且显著上调miR-142的表达水平(P<0.05或P<0.01);miR-142通过靶向结合ZEB1的3’-UTR区域下调ZEB1的表达水平(P<0.05或P<0.01);进一步实验证实,GA通过上调miR-142抑制ZEB1的表达水平,进而抑制HCC827和A549细胞增殖、侵袭和迁移(P<0.05或P<0.01)。结论:GA能够抑制NSCLC HCC827和A549细胞增殖、侵袭和迁移,其机制为GA通过上调miR-142对ZEB1的抑制作用,从而抑制HCC827和A549细胞的恶性生物学行为。

miR-98调节IL-6/STAT3通路对肺癌HCC827细胞吉非替尼耐药的影响

目的:探究microRNA-98(miR-98)调节白细胞介素-6/信号传导与转录激活因子3(IL-6/STAT3)通路对肺癌HCC827细胞吉非替尼耐药(GR)的影响。方法:体外培养肺癌HCC827细胞(NC组),采用肝细胞生长因子(HGF)联合吉非替尼反复诱导肺癌HCC827细胞建立吉非替尼耐药HCC827细胞(GR组),转染miR-98 mimics/NC,分别设为mimic组和mimic-NC组,另外将亲本HCC827细胞作为对照组(Con组)。采用噻唑蓝(MTT)试剂盒检测细胞活性,流式细胞仪检查细胞凋亡情况,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞miR-98、IL-6、STAT3 mRNA表达,免疫印迹(WB)检测细胞IL-6、STAT3蛋白表达。结果:随吉非替尼处理浓度增加,HCC827细胞、HCC827 GR细胞活性依次降低(P<0.05),同一浓度,HCC827 GR细胞活性高于HCC827细胞(P<0.05)。与Con组比较,NC组、mimics-NC组细胞中miR-98水平降低,而mimics组细胞中miR-98水平明显高于Con组、NC组、mimics-NC组(P<0.05);与Con组比较,NC组、mimics-NC组、mimics组细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白水平、细胞活性明显升高,而细胞凋亡率明显降低(P<0.05),且mimics组细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白水平、细胞活性明显低于NC组、mimics-NC组,而细胞凋亡率明显高于NC组、mimics-NC组(P<0.05)。结论:miR-98过表达可扭转HCC827细胞吉非替尼耐药,其作用机制可能与抑制IL-6/STAT3通路活化有关。

miR-19a通过抑制c-MET的表达逆转HCC827细胞吉非替尼耐药

目的明确miR-19a在调控HCC827细胞吉非替尼耐药中的作用及机制,探索miR-19a作为非小细胞肺癌(NSCLC)患者吉非替尼耐药新靶点的理论依据。方法收集非小细胞肺癌患者15例在吉非替尼耐药前后的外周血,通过Real-time PCR检测其中miR-19a的表达;在吉非替尼敏感的HCC827细胞中降低miR-19a表达,并加入吉非替尼,通过CCK8法检测其对细胞活力的影响;在构建成功的HCC827吉非替尼耐药细胞株(HCC827GR)中过表达miR-19a,并加入吉非替尼,通过CCK8法检测其对细胞活力的影响;在HCC827及HCC827GR细胞中分别降低或过表达miR-19a,通过Western blot检测c-MET蛋白表达水平;在HCC827细胞中同时降低miR-19a和c-MET表达,并加入不同浓度吉非替尼,通过CCK8法检测各组细胞活力。结果在吉非替尼耐药的NSCLC患者外周血中,miR-19a呈明显低表达状态;在HCC827细胞中降低miR-19a表达,吉非替尼对细胞活力的抑制效果明显下降(P<0.01);在HCC827GR细胞中过表达miR-19a,吉非替尼对细胞活力的抑制效果明显增强(P<0.01);在HCC827细胞中降低miR-19a表达,能明显促进c-MET蛋白的表达;相反,在HCC827GR细胞中过表达miR-19a,则明显抑制c-MET蛋白的表达;在HCC827细胞中同时降低miR-19a和c-MET表达,并加入不同浓度的吉非替尼,低表达c-MET能够抵消miR-19a对细胞活力的影响。结论 miR-19a在非小细胞肺癌细胞HCC827吉非替尼耐药中发挥着重要作用,其机制可能是通过抑制c-MET蛋白水平的表达。

下调HOTAIR通过提高PTEN表达逆转HCC827细胞吉非替尼耐药

背景与目的肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中80%以上为非小细胞肺癌。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)异常表达于多种肿瘤组织,并参与调控肺癌的发生与发展,本研究旨在探讨下调HOTAIR对肺腺癌HCC827细胞对吉非替尼药物耐药的影响及其机制。方法应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)法检测HCC827细胞及HCC827吉非替尼耐药细胞(HCC827GR)中HOTAIR的表达情况,利用生物信息学分析预测HOTAIR靶基因,应用脂质体转染法将体外合成的针对HOTAIR的siRNA转染入HCC827GR细胞中,采用RT-qPCR及Western blot方法检测其HOTAIR及PTEN、PI3K、AKT的表达水平,同时采用MTT法检测各组细胞的吉非替尼半数抑制浓度(50%inhibitory concentration, IC_(50)),运用流式细胞术分析各组细胞凋亡率的变化。结果 RT-qPCR结果显示HOTAIR在HCC827GR耐药细胞及吉非替尼耐药患者血清中表达增高,利用生物信息学分析预测到PTEN的为HOTAIR潜在靶基因。RT-qPCR及Western blot结果显示HCC827GR细胞经转染HOTAIR siRNA后,HOTAIR表达降低(P<0.05),而PTEN表达升高,PI3K及AKT表达下降(P<0.05);与对照组比较,下调HOTAIR的HCC827GR细胞对吉非替尼的IC_(50)值下降(P<0.05),细胞增殖能力下降、凋亡率升高(P<0.05)。结论下调HOTAIR表达可抑制HCC827GR细胞增殖,促进其凋亡,并可降低HCC827GR细胞的吉非替尼IC_(50),下调HOTAIR后PTEN表达升高,而PI3K及AKT表达下降提示下调HOTAIR可通过靶向调控PTEN/PI3K/AKT通路逆转HCC827GR细胞对吉非替尼的耐药。

培美曲塞对人肺腺癌HCC827细胞株PD-L1表达的影响及作用机制

目的探讨培美曲塞(Pem)通过PI3K/AKT通路对人肺腺癌HCC827细胞株PD-L1表达的影响及其可能的作用机制。方法分别采用不同浓度的Pem(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)在不同时间下(12、24、48h)处理HCC827细胞,CCK-8法检测细胞的增殖抑制作用及确定半数抑制浓度(IC50)作为后续实验的药物浓度,选最佳作用时间作为后续实验的干预时间;流式细胞术检测最佳时间下不同浓度的Pem对PD-L1的表达影响;试验分组:对照组(加入培养液)和试验组(IC50pem与PI3K/AKT通路激活剂740-YP分别单用或联用),Western Blotting检测各组AKT、P-AKT蛋白表达情况;流式细胞术检测最佳时间下各组对HCC827细胞株PD-L1表达的影响。结果与对照组比较,Pem呈浓度依赖性抑制HCC827细胞增殖(P<0.05),各组差异均有统计学意义(均P<0.05),培养曲塞48h组抑制作用强于12 h组(P<0.05),与24h组抑制率无明显差别(P>0.05)。随着药物浓度增加,各实验组细胞PD-L1表达逐渐下降,显著低于对照组(P<0.05);与对照组比较,Pem组可明显下调P-AKT/GAPDH值以及PD-L1的表达(P<0.05),该作用可被740-YP显著逆转(P<0.05),各组AKT/GAPDH值差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,PD-L1表达量在740-YP组上调(P<0.05),在IC50pem组、IC50pem+740-YP组中表达量降低P<0.05),且IC50pem组的PD-L1表达量低于IC50pem+740-YP组(P<0.05)。结论Pem可下调HCC827细胞PD-L1的表达,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。

上调miR-34b表达可增强HCC827细胞对埃克替尼的敏感性

目的:探讨上调miR-34b的表达对HCC827细胞对埃克替尼敏感性的影响及其机制。方法:应用细胞转染技术获得miR-34b高表达的HCC827细胞,并将HCC827细胞分为空白对照组、转染组、埃克替尼组及埃克替尼与转染联合组,采用MTT法测定各组细胞增殖的情况,运用流式细胞术分析各组细胞凋亡率及生长周期的变化,同时应用Real-time PCR及Western Blot方法检测各组c-MET基因mRNA及蛋白的表达水平。结果:miR-34b转染后,HCC827细胞的增殖能力下降,凋亡率升高(P<0.05);miR-34b转染后,埃克替尼对HCC827细胞的抑制率较埃克替尼组明显上升,半数抑制浓度(IC50)明显下降(P<0.05);转染组及埃克替尼与转染联合组的c-MET水平较对照组有所下降(P<0.05)。结论:上调miR-34b表达可以抑制HCC827细胞增殖,促进其凋亡,并可以增强HCC827细胞对盐酸埃克替尼的敏感性;其机制可能与miR-34b反馈抑制c-MET有关。

肺金生方抗非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药性的分子机制研究

目的探讨肺金生方抗非小细胞肺癌(NSCLC)酪氨酸磷酸酶抑制剂(TKIs)靶向药物耐药的作用及分子机制。方法选用NSCLC细胞系HCC827,按0.01、0.05、0.10、0.50和1.0μM浓度梯度诱导构建吉非替尼耐药细胞株,采用CCK8法检测耐药株是否构建成功,采用荧光定量PCR(q-PCR)检测耐药株c-MET扩增水平。20只BALB/c裸鼠按随机数字表法分成空白对照组、吉非替尼组、肺金生方组和肺金生方+吉非替尼组,每组5只。按每只4×10~7/200μL将吉非替尼耐药细胞株注射于裸鼠后肢皮下,构建皮下移植瘤模型。四组均腹腔注射生理盐水,吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg灌胃;肺金生方组给予肺金生方剂量53.6g/kg灌胃;肺金生方+吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg+肺金生方剂量53.6g/kg联合灌胃给药。给药频次每2天1次,连续给药4周。CCK8法检测耐药HCC827 GR细胞增殖率,流式细胞技术检测耐药HCC827 GR细胞凋亡率,Western blot检测耐药HCC827 GR细胞p-EGFR、p-MET、p-AKT、p-ERK1/2表达水平。结果与空白对照组比较,吉非替尼组裸鼠皮下移植瘤瘤重无差异[(1.34±0.16)g比(1.41±0.13)g,P>0.05],肺金生方组裸鼠皮下移植瘤瘤重明显减轻[(0.77±0.28)g比(1.41±0.13)g,P<0.01],吉非替尼+肺金生方组裸鼠皮下移植瘤明显小于肺金生方组和吉非替尼组[(0.34±0.16)g比(0.77±0.28)g、(1.34±0.16)g,P均<0.01];肺金生方单用或与吉非替尼联用能够明显抑制耐药HCC827 GR细胞的增殖能力[(43.45±4.47)%、(24.25±5.21)%比(100.00±2.14)%,P均<0.01];肺金生方组、吉非替尼+肺金生方组细胞凋亡率显著高于空白对照组[(7.40±0.56)%、(12.80±0.72)%比(3.05±0.54)%,P均<0.01];肺金生方组、吉非替尼+肺金生方组c-MET和p-c-MET表达水平明显降低,并明显抑制下游AKT/ERK1/2磷酸化水平。结论肺金生方或和吉非替尼联用能有效抑制吉非替尼耐药皮下移植瘤的生长,抑制耐药细胞的增殖并促进凋亡,其作用机制可能与下调c-MET蛋白表达以及下游AKT/ERK1/2磷酸化水平有关。

阿托伐他汀对肺癌HCC827细胞增殖和凋亡的作用

目的研究阿托伐他汀对人肺癌HCC827细胞增殖和凋亡的影响并探究其机制。方法台盼蓝染色计数法检测阿托伐他汀对HCC827细胞的增殖抑制作用;Hoechst 33342和TUNEL法检测细胞凋亡;DCFH-DA焚光探针检测活性氧(ROS)水平;比色法检测丙二醛(MDA)含量变化;Western blot法检测P-H2A.X、CIeaved-caspase 3、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果阿托伐他汀可抑制HCC827细胞生长并诱导细胞凋亡;阿托伐他汀作用后,细胞核形态发生了改变,细胞核染色质浓缩、呈新月状等凋亡特征;随着阿托伐他汀浓度的增加细胞内R0S和MDA含量不断增加;阿托伐他汀可上调细胞中P-H2A.X、Cleaved-caspase 3和Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,Bax/Bcl-2比值上调。结论阿托伐他汀抑制HCC827细胞的增殖并诱导细胞凋亡,产生凋亡的机制可能与氧化应激和线粒体介导途径有关。

非小细胞肺癌患者血浆miR-451表达及对HCC827细胞生物学性质和放疗敏感性的影响

目的探讨miR-451在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者血浆中的表达及其对NSCLC细胞生物学性质及放疗敏感性的影响。方法 NSCLC患者69例为观察组,同期体检健康者53例为对照组,采用实时荧光定量PCR法检测2组血浆miR-451 mRNA相对表达量。将人NSCLC细胞株HCC827随机分为空白对照组、miR-451组和慢病毒组,空白对照组不作处理,miR-451组和慢病毒组分别转染包含miR-451、无意义核苷酸序列慢病毒;转染24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖;转染72 h,采用Transwell小室试验检测细胞侵袭,采用划痕试验检测细胞迁移距离。再将3组细胞分为0、3、6、9 Gy 4个亚组,分别接受相应剂量的X线照射,采用MTT法检测细胞增殖和细胞存活。结果观察组血浆miR-451相对表达量(1.72±0.39)低于对照组(2.16±0.31)(P<0.05)。miR-451组细胞miR-451相对表达量(4.17±0.82)高于空白对照组(1.32±0.37)和慢病毒组(1.26±0.33)(P<0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染24、48、72 h,miR-451组细胞增殖率均低于空白对照组和慢病毒组(P<0.05);转染72 h,miR-451组侵袭细胞数[(123.7±26.4)个]较空白对照组[(247.6±39.7)个]和慢病毒组[(254.5±38.2)个]少,细胞迁移距离[(45.2±8.8)μm]较空白对照组[(73.2±11.7)μm]和慢病毒组[(68.9±10.4)μm]近(P<0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-451组细胞在0、3、6、9 Gy剂量X线照射后的细胞增殖率和细胞存活率均低于空白对照组和慢病毒组(P<0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-451在NSCLC患者血浆呈低表达;miR-451可抑制HCC827细胞增殖、侵袭与迁移,上调HCC927细胞对放疗的敏感性。

塞来昔布联合吉非替尼对HCC827细胞凋亡影响机制探讨

目的探讨Cox-2抑制剂塞来昔布联合吉非替尼对肺癌EGFR 19号外显子E746-A750缺失细胞株HCC827细胞凋亡的影响及其可能机制。方法 RPMI1640培养HCC827细胞,分为正常对照组、塞来昔布组、吉非替尼组、塞来昔布加吉非替尼组。塞来昔布与吉非替尼药物浓度均为5、10、20、40、80μmol/L。药物干预细胞48h后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞中Cox-2和p-EGFR蛋白表达。结果 MTT结果显示,塞来昔布和吉非替尼单独用药时HCC827细胞的增殖受到明显的抑制,且随着药物浓度的增加,抑制作用逐步增强,药物剂量与细胞增殖抑制率呈正相关;塞来昔布与吉非替尼联合用药时对HCC827细胞呈现出更强的抑制作用,与单独用药相比差异有统计学意义,P<0.001;对照组细胞凋亡率为(0.26±0.09)%,塞来昔布组为(4.86±0.37)%,吉非替尼组为(8.53±0.78)%,塞来昔布+吉非替尼组为(23.28±1.63)%,组间比较差异有统计学意义,F=111.291,P<0.001,且两药联合时具有交互效应,F=90.440,P<0.001;蛋白质印记法结果显示,用药组较对照组Cox-2(F=185.351,P<0.001)和p-EGFR(F=61.328,P<0.001)蛋白水平均有不同程度的下调,其中两药联合组下调最为明显。结论塞来昔布与吉非替尼具有良好的协同作用,其机制可能与诱导凋亡、抑制EGFR的活化和下调Cox-2蛋白的表达有关,在治疗非小细胞肺癌中联合用药可能会具有较大的应用潜力。

正电子发射型计算机断层显像剂^(18)F-FEA-Erlotinib与^(11)C-Erlotinib在HCC827荷瘤小鼠中的显像效果对比研究

目的通过对比[~18F]氟乙基-埃罗替尼与[~11C]埃罗替尼在HCC827荷瘤鼠中的正电子发射型计算机断层(PET)显像,评价新PET显像剂~18F-FEAErlotinib的应用潜力。方法经一步亲核取代反应制得~18F-FEA-Erlotinib,而~11C-Erlotinib经[~11C]碘代甲烷(~11CH_3I)甲基化反应合成;先由~18F-FEAErlotinib在HCC827荷瘤鼠中进行1 h Micro-PET动态显像,探索其体内生物分布并确定最佳显像时间;然后分别进行~18F-FEA-Erlotinib与~11C-Erlotinib的1h静态显像,并勾画感兴趣区域(ROI),测定每克组织百分注射剂量率(%ID/g),进行半定量分析。结果经动态显像结果确定1 h为最佳显像时间。1 h静态显像中,~18F-FEA-Erlotinib图像中,肿瘤边界清晰,分辨率、对比度高。1 h静态显像半定量研究发现,~18F-FEA-Erlotinib显像中,肿瘤/脑、肿瘤/肺、肿瘤/骨骼、肿瘤/肌肉的比值分别为5.87±1.21,2.97±0.58,3.33±0.60,3.80±0.72;~11C-Erlotinib显像中,肿瘤/脑、肿瘤/肺、肿瘤/骨骼、肿瘤/肌肉的比值分别为5.48±1.45,1.10±0.34,2.63±0.54,2.10±0.63。结论~18F-FEA-Erlotinib显像肿瘤摄取高,靶/非靶比值较~11C-Erlotinib显像更高,显像清晰,具有较好应用潜力。