澳洲茄碱诱导肺癌细胞株H446凋亡及其机制探讨

背景与目的肺癌的发病率和病死率都急剧上升,小细胞肺癌首选化疗而不能手术,而中医药副作用小,有研究表明中药澳洲茄碱具有抗肿瘤活性作用。本研究旨在探讨澳洲茄碱对肺癌细胞株H446凋亡作用的影响。方法用CCK8试剂盒筛选药物作用的合适浓度和时间,以药物浓度为0μmol/L、3.4μmol/L、6.8μmol/L、13.6μmol/L分4组,作用于H446细胞24 h后,倒置显微镜观察细胞形态的变化,DAPI核染观察细胞核变化,流式细胞术检测药物对细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL2、BAX、CASP3表达的变化。结果澳洲茄碱可降低H446细胞的存活率,抑制其增殖,具有剂量相关性,存活率可降低至16.77%(P<0.001),最高凋亡率为44.62%(P<0.001);H446有明显的细胞凋亡形态学变化;Western blot显示凋亡相关蛋白BAX、CASP3表达上调(P<0.05),凋亡抑制基因蛋白BCL2表达下调(P<0.05)。结论澳洲茄碱可抑制H446细胞的增殖,上调促凋亡相关蛋白表达,下调抑凋亡蛋白表达,从而促进细胞的凋亡。

千金苇茎汤调控人肺小细胞癌H446细胞凋亡的分子机制研究

目的:研究千金苇茎汤对人肺小细胞癌H446增殖与凋亡的影响。方法:将千金苇茎汤通过化学分离法制得水提部位;分为不同药物浓度,与H446共同培养,流式细胞仪细胞周期检测以及荧光显微镜线检测凋亡结果;AgNOR染色观察以及免疫组织化学检测PCNA、caspase-3蛋白的变化。结果:不同浓度的千金苇茎汤水提部位与H446培养后,细胞凋亡率明显升高、AgNOR数目减少以及PCNA、caspase-3蛋白明显的改变(P<0.01),并有一定的浓度依赖性。结论:千金苇茎汤水提部位可以有效抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

葛根粗提物、葛根素对肺癌H446细胞增殖的抑制作用及其机制

目的观察葛根粗提物(CP)和葛根素纯品(SP)对小细胞肺癌H446细胞增殖的影响,并探讨其机制。方法用含不同浓度的SP和CP培养H446细胞,用MTT法检测细胞生长抑制率。用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率、细胞免疫化学技术检测Bcl-2和Bax蛋白。另设空白对照组和溶剂对照组。结果CP作用72h的半数抑制浓度(IC50)为435μg/ml,SP为1403μg/ml。此浓度作用72h,细胞凋亡率分别为14.71%和2.61%,两组相比P<0.05;G0/G1期细胞构成比分别为79.20%和72.20%,G2/M期细胞构成比分别为8.94%和10.50%,与对照组相比P均<0.05;CP作用于H446细胞后,细胞内Bcl-2蛋白表达量降低,Bax的蛋白表达量增加,与对照组相比P均<0.05。结论SP和CP对小细胞肺癌H446细胞具有增殖抑制作用,呈浓度相关性;SP和CP可诱导细胞凋亡且CP强于SP,其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期、上调Bax表达、下调Bcl-2表达有关。

刺五加多糖诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡

研究刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide,ASPS)诱导H446细胞凋亡及其可能的作用机制。采用MTT法检测ASPS对小细胞肺癌H446细胞增殖的抑制作用;Hoechst33258染色和流式细胞技术检测经ASPS处理后H446细胞凋亡的形态特征及凋亡率的变化;Western印迹方法检测凋亡相关基因bax、bcl-2、p53表达的变化。MTT分析表明,ASPS作用48h后可明显抑制H446细胞的增殖,半数抑制浓度(IC50值)为476.36μg/ml;Hoechst染色结果:H446细胞在ASPS诱导下出现典型的凋亡形态;流式细胞术检测结果显示:对照组及浓度为240、480、960μg/ml药物处理组凋亡率分别是(5.02±0.4)%、(11.12±1.8)%、(19.89±2.5)%、(22.54±1.8)%;Western印迹显示:在ASPS的诱导下bax、p53的表达量提高,而bcl-2的表达量下降。研究表明,ASPS对H446细胞增殖有抑制作用,并能促进其凋亡;ASPS通过上调bax、p53表达,下调bcl-2表达促进H446细胞凋亡。

千金苇茎汤调控人肺小细胞癌H446中caspase-3、cox-2抗凋亡的研究

目的研究千金苇茎汤对人肺小细胞癌H446凋亡的影响。方法将千金苇茎汤通过化学分离法制得水提部位;分为不同药物浓度,与H446共同培养,流式细胞仪细胞周期检测以及荧光显微镜检测凋亡结果;免疫组织化学检测caspase-3、cox-2蛋白的变化;real time PCR检测caspase-3 mRNAc、ox-2 mRNA的表达量。结果不同浓度的千金苇茎汤水提部位与H446培养后,细胞凋亡率明显升高以及PCNAc、aspase-3 RNA水平和蛋白明显的改变(P<0.05),并有一定的浓度依赖性。结论千金苇茎汤水提部位可以有效促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞转移。

mTOR信号通路在17-DMAG克服EML4-ALK阳性肺癌细胞株H3122对alectinib耐药中的作用机制研究

目的观察m TOR信号通路在17-DMAG克服旁路信号通路激活诱导棘皮动物微管相关蛋白样4与间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因阳性肺癌细胞株H3122(以下简称"H3122细胞")对alectinib耐药中的变化,并探讨其内在的调控机制。方法加入100 ng/m L转化生长因子α(transforming growth factor-α,TGF-α)和100 ng/m L表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导H3122细胞对alectinib耐药,观察加入17-DMAG后上述耐药能否被克服。采用CCK-8法检测不同处理方式下H3122细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测不同处理方式下细胞中ALK、EGFR及其磷酸化蛋白的表达,观察其下游m TOR信号通路关键蛋白及活化水平的表达情况。结果 alectinib作用72 h后H3122细胞增殖率随药物浓度升高而下降,IC50为0.042μmol/L;联合TGF-α或EGF后H3122细胞对alectinib耐药,IC50远大于10μmol/L;单药17-DMAG处理后H3122细胞增殖率随药物浓度升高而下降,IC50为0.245μmol/L;联合TGF-α或EGF后H3122细胞增殖率亦被17-DMAG抑制,且呈剂量依赖性,IC50分别为0.251μmol/L和0.301μmol/L。经0.05μmol/L alectinib作用72 h后H3122细胞凋亡率为(30.01±0.92)%,alectinib联合TGF-α或EGF后细胞凋亡率分别为(6.36±0.14)%和(6.13±0.21)%,显著低于alectinib单药处理(P<0.001);经0.3μmol/L 17-DMAG单药或联合TGF-α、EGF作用72 h后H3122细胞凋亡率分别为(28.37±1.75)%、(26.69±1.2)%和(26.62±0.72)%,差异无统计学意义(P>0.05)。alectinib可抑制H3122细胞中p-ALK、p-m TOR的表达,也可抑制m TOR上、下游关键蛋白的活化状态;EGF可明显增加细胞中p-EGFR、p-m TOR及m TOR上、下游关键蛋白的活化水平表达;alectinib可抑制p-ALK表达,但联合EGF后不能抑制m TOR及m TOR上、下游关键蛋白活化水平的表达;即使联合EGF后,17-DMAG亦能抑制H3122细胞中ALK、EGFR、m TOR信号通路蛋白及其活化状态蛋白的表达。结论旁路信号通路激活介导EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞株H3122对alectinib耐药的方式具有可行性,m TOR信号通路在17-DMAG克服旁路信号通路激活引起alectinib的获得性耐药过程中有一定作用。

抑癌汤对人肺癌NCI-H446细胞增殖抑制作用的体外实验研究

目的通过自拟方抑制癌汤对人肺癌NCI-H446细胞株进行干扰研究,探讨其增殖抑制作用。希望从苗药中药组方中找到抑制肺癌细胞增殖的新方法。方法将NCI-H446细胞进行培养,绘制NCI-H446细胞生长曲线,取处在对数生长期的NCI-H446细胞进行实验。首先确定抑癌汤的作用浓度范围。取细胞的存活率为50%时的药物浓度范围作为抑癌汤的给药浓度参考。再将抑癌汤在该浓度范围内分为5个浓度组;实验分抑癌汤组、西药组、抑癌汤加西药组、空白组四组、每一组各4个复孔,进行对照研究。结果抑癌汤对NCI-H446细胞毒实验得到细胞存活率50%时的药物浓度范围在1～100μg/ml之间。抑癌汤加西药组优于抑癌汤组;抑癌汤加西药组优于西药组;西药组优于抑癌汤组;抑癌汤组优于空白组;抑癌汤加西药组优于空白组;西药组优于空白组。结论抑癌汤在体外对人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞具有抑制作用,具有潜在药用价值,值得进一步深入研究。

刺五加多糖通过ERK信号转导途径诱导H446细胞G_2/M期阻滞

目的研究刺五加多糖(ASPS)对人小细胞肺癌H446细胞G2/M期阻滞的诱导作用及对ERK信号传导途径的影响。方法流式细胞技术(FCM)检测H446细胞周期;Western blot分析检测ASPS对ERK、p-ERK蛋白的影响。结果与对照组相比,各ASPS处理组G2/M期细胞所占的比例明显增高(P<0.01),G0/G1期细胞所占的比例没有差异;加入ERK抑制剂PD98059后,G2/M期和G0/G1期细胞所占的比例与对照组没有差异;p-ERK的量显著高于对照组(P<0.01),而对ERK蛋白表达没有明显影响。结论ASPS可能通过激活ERK信号转导途径诱导H446细胞发生G2/M期阻滞。

JNK通路及HSP70在热化疗抑制人小细胞肺癌细胞生长中的作用

目的:研究热化疗对小细胞肺癌生长的影响及其可能的机制。方法:参考临床常用剂量,采用43℃加热联合120μg/L紫杉醇(热化联合组)、43℃加热联合120μg/L紫杉醇及20μmol/LJNK特异抑制剂SP600125(热化联合+SP600125组)、单纯43℃加热(单纯热疗组)、单纯使用120μg/L紫杉醇(单纯化疗组)处理H446细胞,以未处理的H446细胞作对照。应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测各处理方式下细胞增殖率的变化,通过Western印迹法检测JNK、磷酸化JNK(p-JNK)和HSP70的表达并对数据进行统计学分析。结果:热化联合组细胞增殖率低于对照组、单纯化疗、单纯热疗及热化联合+SP600125组(P<0.05);p-JNK表达水平在热化联合组中表达明显增高(P<0.05),但SP600125可抑制其表达,使热化联合+SP600125组细胞的增殖率相应增高(P<0.05);HSP70在热化联合组的表达低于单纯热疗组(P<0.05),细胞增殖率也发生了相应变化。结论:热疗可以明显增加紫杉醇对H446细胞生长的抑制作用,且这种作用可能是通过激活JNK信号转导通路或抑制HSP70的表达完成的。

葛根素和葛根粗提物对H446细胞生长及对PCNA基因表达的影响

目的:比较葛根素(standard of purepuerarin,SP)和葛根粗提物(pueraria crude extract,CP)对小细胞肺癌H446生长的影响.方法:运用MTT法、流式细胞术、细胞免疫化学方法观察SP和CP对H446细胞生长、凋亡、细胞周期分布以及对PCNA基因表达的影响.结果:CP组和SP组细胞凋亡率分别为14.71%和2.61%,差异具有统计学意义(P<0.05);G0/G1期细胞构成比分别为79.20%和72.20%,G2/M期细胞构成比分别为8.94%和10.50%,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);CP作用于H446细胞后,PCNA蛋白表达量减少,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:CP和SP均可抑制H446细胞增殖,且CP强于SP;SP和CP可诱导细胞凋亡,其机制可能与其导致细胞G0/G1期阻滞、PCNA表达下调有关.

ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究

目的 通过对ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究，为下一步研究打下基础。方法利用细胞集落形成实验研究肺癌细胞株A549、NCI—H446的放射敏感性差异，并结合免疫荧光实验和激光共聚焦扫描（LSCM）技术来探讨两细胞株中ATM蛋白的表达差异与放射敏感性之间的关系。结果集落形成实验中，在接受2、4、6、8Gy剂量照射时，A549和NCI—H446两肺癌细胞株的存活分数分别为81．0％、32．4％、12．0％、3．5％和52．4％、17．0％、3．2％、0．7％。ATM蛋白定位于细胞浆和胞核；利用LSCM分析两细胞株中ATM蛋白的表达差异，A549细胞ATM蛋白荧光强度（71．188＋13．379）较NCI-H446细胞（47．478±19．032）明显增强（P〈0．0001），有统计学意义。结论两肺癌细胞株A549和NCI-H446具有放射敏感性差异，ATM蛋白在两细胞株中的表达亦有差异显著性，表明其表达量可能与放射敏感性呈负相关。

NF-κB亚单位p50/p65激活促进肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药

目的探究NF-κB经典通路激活与人肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药的内在联系。方法选择肺腺癌HCC827和H1650亲代细胞株,吉非替尼连续处理60 d,检测细胞株生长情况和各细胞株595nm吸光度,确定各细胞株细胞存活率和H1650亲代细胞被诱导成H1650耐药细胞株。Western blot检测各细胞株P-IκBα、NF-κB P-p50和P-p65表达量,Image J灰度仪计算出胞浆和胞核P-p50和P-p65与内参蛋白灰度比值,比较吉非替尼和吉非替尼加吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)联合用药状态下,各细胞株细胞存活率和P-IκB、P-p50和P-p65的表达。结果在无吉非替尼和吉非替尼加PDTC药物干预下,H1650耐药细胞PIκBα表达增加,胞浆和胞核P-p50和P-p65表达,H1650耐药细胞株>H1650亲本细胞株>吉非替尼敏感HCC827细胞株(P<0.05,P<0.01);单独使用吉非替尼干预,H1650耐药细胞株细胞抑制率较H1650亲本细胞株和HCC827细胞株降低(P<0.05,P<0.01),H1650耐药细胞株P-p50和P-p65表达较其他两类细胞株升高(P<0.05);与无吉非替尼干预比较,H1650亲代和耐药细胞P-p50和P-p65均有显著降低(P<0.05,P<0.01);吉非替尼联合PDTC干预,显示H1650亲代和耐药细胞存活率、胞浆和胞核Pp50和P-p65表达均较吉非替尼组降低(P<0.01,P<0.01)。结论 NF-κB经典传导通路激活是H1650亲代细胞残存和转化为吉非替尼耐药细胞的主要因素之一,吉非替尼联合PDTC用药可抑制P-IκBα生成和P-p50、P-p65的激活,从而降低H1650残存细胞生存率和耐药细胞的产生。

Akt通路在热化疗联合诱导人小细胞肺癌细胞凋亡中的作用

背景与目的:Akt通路是细胞内一条重要的信号通路,与细胞生长、凋亡密切相关,本研究旨在探讨Akt通路在热化疗诱导人小细胞肺癌细胞凋亡中的作用,进而探讨热疗抑制肺部肿瘤细胞增殖可能的机制。方法:参考临床常用剂量,采用43℃加热联合120μg/L紫杉醇(热化联合组)、43℃加热联合120μg/L紫杉醇并加入1μmol/LAkt特异抑制剂Wortmannin(Wortmannin组)、43℃加热联合120μg/L紫杉醇并加入30μmol/L活性氧(reactive oxygen species,ROS)特异抑制剂NAC(NAC组)、单纯使用120μg/L紫杉醇(单纯化疗组)处理H446细胞,以未处理的H446细胞作为对照组,应用噻唑蓝比色法(MTT法)检测各处理方式下细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,荧光法检测细胞内ROS,通过蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测Akt磷酸化水平和caspase-3的表达,采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析。结果:热化联合组细胞增殖率(59.83±3.36)%低于对照组(100.00±0.00)%和单纯化疗组(69.16±2.95)%(P<0.05);热化联合组的细胞凋亡率最高(27.59±5.47)%(P<0.05);热化联合组的ROS表达增高(102.14±18.34)(P<0.05),NAC可抑制其表达(28.01±1.19),Wortmannin对其无影响(99.87±8.35);Akt磷酸化水平在热化联合组降低(0.69±0.03)(P<0.05),Wortmannin可抑制其磷酸化(0.00±0.00),NAC使其磷酸化水平升高(1.05±0.29)(P<0.05);热化联合组的caspase-3表达(1.07±0.08)高于其他各组(P<0.05)。结论:热化疗联合应用可以明显抑制H446细胞的生长,这种抑制作用可能是通过诱导ROS的产生,继而抑制Akt通路活化,并通过caspase途径导致细胞凋亡。

活性氧在热化疗抑制人肺肿瘤细胞生长中的作用

目的:研究热化疗抑制肺肿瘤细胞生长的可能机制及活性氧(ROS)在其中的作用。方法:采用6种不同热化疗联合方法处理H446细胞,以未处理的H446细胞作对照,用荧光法检测细胞内活性氧,蛋白免疫印记法检测JNK和Akt磷酸化水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,SPSS13.0对数据进行统计分析。结果:热化联合组ROS高于对照组和单纯化疗组,NAC可抑制其表达(P<0.05),SP600125和Wortmannin对其没影响(P>0.05);JNK磷酸化水平在热化联合组升高,NAC使其磷酸化水平降低(P<0.05);Akt磷酸化水平在热化联合组表达降低,NAC使其磷酸化水平升高(P<0.05);热化联合组细胞凋亡率升高,Wortmannin组细胞凋亡率增加,SP600125组和NAC组细胞凋亡率减少(P<0.05)。结论:热化疗联合诱导ROS产生,通过激活JNK信号转导通路和抑制Akt通路的激活,导致细胞凋亡。

热化疗联合作用抑制人小细胞肺癌细胞增殖的机制

目的研究热化疗联合作用对肺部肿瘤细胞生长的抑制及其可能的机制。方法参考临床常用剂量,采用43℃加热联合120μg/L紫杉醇、43℃加热联合120μg/L紫杉醇及20μmol/LJNK特异抑制剂SP600125以及单纯使用120μg/L紫杉醇处理H446细胞,以未处理的H446细胞作对照。应用噻唑蓝比色法检测各处理方式下细胞增殖率的变化,通过蛋白免疫印迹法检测JNK磷酸化水平和Caspase-3表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,运用SPSS13.0对数据进行统计分析。结果热化联合组细胞增殖率最低(P<0.05);JNK磷酸化水平在热化联合组中表达明显增高(P<0.05),SP600125可抑制其磷酸化(P<0.05);热化联合组的Caspase-3增高(P<0.05),SP600125使其表达减少(P<0.05);热化联合组细胞凋亡率增加(P<0.05),SP600125组细胞凋亡率减少(P<0.05)。结论热化疗联合应用可以明显增加紫杉醇对H446细胞生长的抑制作用,且这种抑制作用可能是通过激活JNK信号转导通路,继而通过Caspase-3途径激活细胞凋亡来实现的。

突变型K-ras siRNA抑制肺癌A549细胞的增殖和迁移并诱导细胞凋亡

目的：构建靶向K-ras的siRNA，研究K—rassiRNA对K-ras基因突变型肺癌细胞A549及K-ras野生型小细胞肺癌细胞NCI—H446生长和迁移的抑制作用。方法：设计并人工合成4条K．rassiRNA（针对野生型K-ras基因的K—rassiRNA1-K—rassiRNA3；针对突变型K-ras基因的K—rassiRNA4），并分别转入A549和NCI—H446细胞。RT—PCR和Westernblotting检测不同K—rassiRNA对K—rasmRNA和蛋白表达的影响，MTr法检测不同K—rassiRNA对A549和NCI—H446细胞增殖的抑制作用。Transwell实验和Hoechst33258染色检测K—rassiRNA对细胞迁移和凋亡的影响。结果：靶向突变型K-ras的K．rassiR—NA4能特异性抑制A549细胞中K-ras的表达，但对N-ras和H-ras的表达没有影响。K—rassiRNA4抑制A549细胞的增殖，但不影响含野生型K-ras基因的NCI—H446细胞的增殖。K—rassiRNA4还能诱导A549细胞凋亡、抑制A549细胞迁移。结论：针对突变型K-ras基因的siRNA可特异性抑制K-ras突变型肺癌细胞的增殖和迁移，并诱导该细胞凋亡，K—rassiRNA可望用于K-ras突变型肿瘤特别是肺癌的个体化治疗。

肺炎克雷伯杆菌分泌因子及活菌诱导人肺上皮细胞表达分泌IL-8的研究

目的 :探讨肺炎克雷伯杆菌 (Klebsiellapneumoniae ,Kp)分泌因子及活菌诱导肺上皮细胞株表达和分泌IL 8的状况。方法 :用临床分离株Kp0 3 1 1 6、Kp0 3 1 83的细菌培养上清或活菌刺激肺上皮细胞株A5 49和SPC A 1 ,酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测细胞IL 8表达量。结果 :①两株Kp培养上清分别刺激A5 49或SPC A 1后 ,IL 8表达量均有显著增高 (P <0 .0 1 ) ,且随上清刺激浓度增加而上升。②两株Kp及DH5 (活菌分别与SPC A 1共孵育 2h ,用庆大霉素杀死胞外菌 ,继续孵育 2 4h后两株Kp诱导细胞IL 8表达量均显著高于DH5α(P <0 .0 1 ) ,且随细菌数 /细胞数比例增大而上升。结论 :Kp分泌因子及活菌都能够诱导肺上皮细胞IL 8表达 ,而活菌上调IL 8的效应较培育上清分泌因子更显著 ,提示肺上皮细胞在Kp感染刺激的肺部炎症反应中起重要作用。

多效蛋白基因沉默对小细胞肺癌H446细胞中部分肿瘤生长相关基因表达的影响

目的 观察多效蛋白（PTN）基因沉默后,人小细胞肺癌H446细胞中与血管新生、肿瘤生长、侵袭过程相关的血管内皮细胞生长因子（VEGF）、angiomotin（Amot）、schlafen5（Slfn5）和金属蛋白酶9（MMP-9）4种基因的表达变化.方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法 检测PTN在H446细胞中的表达.构建干扰PTN表达的慢病毒载体,在293T细胞中包装成病毒后感染H446细胞.RT-PCR检测未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组和PTN抑制加化疗组细胞中Amot、Slfn5、MMP-9和VEGF的表达.结果 RT-PCR和Western blot检测结果 均表明,PTN基因在H446细胞中高表达.所构建的shRNA序列（GCAGCTGTGGATACTGCTGAA）对H446细胞PTN mRNA表达的抑制效率达72.1%,对PTN蛋白表达的抑制效率为59.2%.FIN基因沉默后,H446细胞中Slfn5和MMP-9的表达分别较阴性对照组上调了165.1%和47.3%,而Amot和VEGF的表达分别较阴性对照组下调了33.1%和26.6%.协同化疗后,上述趋势更为明显.结论 通过构建PTN小干扰RNA（siRNA）慢病毒表达载体沉默PTN基因,可以影响H446细胞增殖和转移相关基因的表达变化.

结核分支杆菌培养上清诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达

目的 :观察呼吸道上皮细胞对结核杆菌产物产生的炎症反应 ,探讨炎症反应信号传递的机制。方法 :制备结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清 ,用培养上清刺激肺上皮细胞株SPC A 1和A5 49,酶联免疫吸附实验检测细胞IL 8表达量。用突变MyD88表达重组质粒转染SPC A 1细胞 ,观察MyD88与结核杆菌培养上清诱导上皮细胞炎症反应信号传递的关系。结果 :结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清明显增加SPC A 1和A5 49细胞IL 8的表达。用突变MyD88表达重组质粒 pcDNA3 .1 mMyD88转染SPC A 1 ,结果显著抑制了结核杆菌培养上清对SPC A 1细胞的炎症刺激作用。结论 :结核杆菌培养上清能够诱导呼吸道上皮细胞IL 8表达 ,Toll/IL 1受体信号通路及MyD88分子与细胞炎症反应的信号传递相关 ,提示在肺结核病发病过程中 ,结核杆菌的代谢产物可能刺激肺上皮细胞产生炎症细胞因子 。

RNA干扰下调拓扑异构酶Ⅰ在小细胞肺癌细胞株的表达及其与拓扑替康敏感性的关系

目的检测拓扑异构酶Ⅰ（TopⅠ）在小细胞肺癌（SCLC）细胞株中的表达，并探讨其表达水平对拓扑替康（TPT）敏感性的影响。方法采用Western blot检测TopⅠ在SCLC细胞株H446蛋自水平的表达；应用人工合成并荧光标记的小干扰RNA（siRNA），通过脂质体瞬时转染H446细胞，流式细胞仪检测转染效率；应用定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot检测各干扰序列对TopⅠ在mRNA及蛋白水平的干扰效果，筛选最佳干扰序列；对转染后的细胞株进行药物敏感性实验，观察TopⅠ的表达对TPT敏感性的影响。结果TopⅠ基因在H446中有较高表达；siRNA干扰效果满意，转染效率可达86．7％左右；siRNA oligo TopⅠ-892、siRNA oligo TopⅠ-1152、siRNA oligo TopⅠ-2084和siRNA oligo TopⅠ-2397等4个于扰序列均抑制H446细胞TopⅠ mRNA的表达，抑制率分别为（95．7±1．6）％、（90．8±1．6）％、（96．1±2．7）％和（96．3±1．8）％。序列siRNA oligo TopⅠ-2084和siRNA oligo TopⅠ-2397干扰后，H446细胞TopⅠ蛋白表达明显降低。药物敏感性实验结果显示，相同浓度的TPT对实验组H446细胞的抑制率明显低于转染前及阴性对照的H446细胞（P〈0．01）。结论脂质体介导的人工合成siRNA瞬时转染可有效抑制H446细胞的TopⅠ表达，明显降低细胞对TPT的敏感性。