HDAC1在肺腺癌细胞株A549中的表达及TSA对细胞增殖、凋亡的影响

背景与目的:研究表明组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)在多种肿瘤细胞中高表达,组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)抑制剂制滴菌素A(trichostatinA,TSA)能抑制肿瘤细胞的生长。而缺氧是恶性肿瘤的重要特征,本实验拟研究HDAC1在低氧肺腺癌细胞株A549中的表达及TSA对细胞增殖、凋亡的影响。方法:实验设常氧组(对照组)及低氧组(实验组),实验组设A～F组,即低氧6h组(A组),低氧6h加TSA组(B组),低氧12h组(C组),低氧24h组(D组),低氧24h加TSA组(E组),低氧48h组(F组)。用蛋白印迹法(Westernblot)检测A549细胞在不同时间低氧条件下HDAC1的表达,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色、免疫组化和流式细胞仪、原位凋亡(Tunel)法检测A549细胞在不同时间低氧条件下的增殖和凋亡率以及TSA对其的影响,用RT-PCR检测A549细胞在不同时间低氧条件下HDAC1mRNA的表达及TSA对其的作用。结果:对照组HDAC1蛋白质表达的A值为138±11,实验A、C、D、F组A值分别为78±4.0、86±5.0、124±3.0、120±9.0。对照组HDAC1mRNA的A值与β-actinmRNAA值的比值0.68±0.03,A、B、D、E组HDAC1mRNA的A值与β-actinmRNAA值的比值分别为0.46±0.03、0.45±0.02、0.70±0.03、0.33±0.02。对照组PCNA的A值0.13±0.03、A、B、D、E组PCNA的A值分别为0.10±0.02。

腺病毒介导的野生型p53基因对肺腺癌细胞株生长的抑制作用

为研究野生型p53基因对肺腺癌细胞株GLC-82细胞生长的作用,确立腺病毒介导的野生型p53基因在肿瘤治疗中的意义,应用分子克隆技术首先构建了野生型p53复制缺陷型腺病毒重组体,应用生化染色方法确定了重组体的转染效率,以免疫组化法及PCR技术分别确定了腺病毒载体介导的p53基因转染GLC-82细胞后p53蛋白和p53 cDNA的表达情况;最后应用细胞生物学方法检测了p53对GLC-82细胞扩增及细胞周期的影响.结果表明所构建的重组体可以高效、快速转染GLC82细胞,抑制GLC-82细胞扩增,使细胞合成期和分裂后期的量减少。

Bim在克唑替尼诱导EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌细胞株H2228凋亡中的作用机制

目的探讨Bim在克唑替尼诱导EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌细胞株H2228凋亡过程中的作用机制。方法在不同时间点(24、48、72h)用不同浓度克唑替尼分别处理EML4-ALK阳性肺腺癌H2228细胞株和EML4-ALK阴性肺癌A549细胞株,采用MTT法检测克唑替尼作用72h的细胞增殖抑制情况;PI单染流式细胞仪检测经300nmol/L克唑替尼作用24、48和72h的细胞凋亡率;采用Western blotting法检测克唑替尼诱导前后Bim蛋白(Bim-EL、Bim-L和Bim-S)的表达水平,同时对促凋亡分子Bid和抗凋亡分子Bcl-2、Bcl-xL的蛋白水平进行联合检测;采用siRNA技术"沉默"Bim基因的表达,用流式细胞仪检测siRNA"沉默"Bim基因后克唑替尼诱导H2228细胞株的凋亡率。结果克唑替尼作用72h后,肺腺癌H2228细胞株和A549细胞株的细胞增殖抑制率均随着克唑替尼药物浓度的增加而逐渐升高,呈剂量依赖性。克唑替尼作用于H2228细胞72h的IC50值为335nmol/L。300nmol/L克唑替尼作用H2228细胞株24、48、72h后的凋亡率分别为(19.19±0.61)%、(35.47±1.17)%、(43.58±4.84)%,作用A549细胞株的凋亡率分别为(12.71±0.1)%、(18.22±0.13)%、(19.36±0.45)%。随着克唑替尼(300nmol/L)作用时间的延长,细胞凋亡率亦随之增加,并呈时间依赖性(P<0.05)。在凋亡细胞中发现Bim蛋白水平升高,以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达降低,但促凋亡蛋白Bid在不同药物浓度及时间点的表达水平无明显变化。此外,经siRNA技术"沉默"Bim基因后,克唑替尼诱导的H2228细胞株凋亡率明显降低。结论克唑替尼通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL及上调Bim的表达水平来发挥其诱导细胞凋亡作用,该过程可被Bim siRNA抑制。

丁酸、全反式维甲酸对肺腺癌细胞株A549β-连环素、c-myc表达的影响

目的:观察多种浓度丁酸、全反式维甲酸以及联合应用对肺腺癌细胞株A549β-连环素(β-catenin)及c-myc基因表达的影响。方法:用免疫组化法检测β-连环素(β-catenin)及c-myc基因表达情况。结果:经BA、ATRA处理72h后A549细胞β-cat、c-myc的AOD值降低,β-cat、c-myc蛋白阳性细胞比例减小,并呈剂量依赖性,其中BA和ATRA联合处理后较等浓度单药BA、ATRA作用更为显著。β-cat与c-myc的AOD值之间、β-cat与c-myc阳性细胞比例之间均分别呈正相关。结论:BA对肺腺癌A549细胞具有与ATRA相近的降低肺腺癌A549细胞β-cat、c-myc蛋白表达水平作用,并呈浓度依赖性,BA和ATRA联合应用具有良好的协同增效作用;BA、ATRA可能通过作用肺腺癌A549细胞Wnt信号通路影响细胞增殖。

丁酸、全反式维甲酸对肺腺癌细胞株A549体外增殖的影响

目的 观察丁酸 (BA)、全反式维甲酸 (ATRA)单用及联合应用对肺腺癌细胞株A5 4 9体外增殖的影响。方法 采用绘制细胞生长曲线法、MTT比色法。结果 经BA、ATRA处理后A5 4 9细胞生长曲线趋于平坦 ,细胞增殖速度、倍增时间降低 ,72h、1 2 0h生长抑制率显著增高 ,并呈剂量依赖性 ,其中BA和ATRA联合处理作用后 72h、1 2 0h生长抑制率分别为 (72 .77±2 .5 4 ) %、(84 .0 3± 1 .5 8) % ,较等浓度单药BA、ATRA显著增强。结论 BA对肺腺癌A5 4 9细胞具有与ATRA相近的增殖抑制作用 。

亚砷酸对人肺腺癌细胞株TNF-α、Fas、bcl-2表达的影响

目的观察亚砷酸(As2O3)对人肺腺癌细胞株(LAC)TNF-α、Fas及bcl-2表达的影响,以探讨亚砷酸诱导肺癌细胞凋亡的机制。方法以双抗体夹心ABC-ELISA法定量检测体外培养的人肺腺癌细胞株中TNF-α、Fas、bcl-2的表达情况。结果与空白对照组相比,各浓度组As2O3作用于人肺腺癌细胞株72h后,bcl-2蛋白表达无明显变化(P>0.05);但TNF-α、Fas表达增加,且各浓度组相比差别有显著意义(P<0.05)。结论不同浓度As2O3作用于人肺腺癌细胞株72h后bcl-2表达无明显变化,但TNF-α、Fas蛋白表达增加,且与浓度有相关性,表明其诱导肺癌细胞凋亡机制可能是通过上调促凋亡基因TNF-α、Fas表达来实现的。

人肺腺癌A549及A549/DDP细胞株差异蛋白质组学分析

目的比较人肺腺癌细胞株A549和耐顺铂株A549/DDP细胞的蛋白表达谱,筛选肺癌耐药相关蛋白,为阐明肿瘤细胞的耐药提供新线索。方法对两种细胞株进行比较蛋白质组学研究,利用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离细胞总蛋白,经图像分析软件分析、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,并用免疫细胞化学(ICC)对部分差异蛋白进行验证。结果获得分辨率高、重复性好的A549、A549/DDP总蛋白图谱,初步筛选出差异蛋白质点,经质谱分析及数据库检索,鉴定出13种差异表达蛋白质,这些蛋白与细胞代谢、结构、解毒和DAN修复、以及信号转导等相关。结论 A549、A549/DDP细胞株存在差异表达蛋白质点,提示这些蛋白可能与A549细胞耐顺铂相关,为研究肺癌耐药提供依据。

回生口服液调控Wnt通路CyclinD1影响人肺腺癌细胞增殖的机制

目的:研究回生口服液调控Wnt信号传导通路细胞周期蛋白D1(CyclinD1)影响人肺腺癌细胞(LAC)增殖的机制。方法:制备高、中、低剂量(11.6 g/kg,5.8 g/kg,2.9 g/kg)回生口服液含药血清,与人肺腺癌细胞系共同培养,MTT法检测含药血清对肺腺癌细胞的抑制率,流式细胞仪检测肺腺癌细胞周期相对分布;建立C57BL/6人肺腺癌荷瘤小鼠模型,予回生口服液高、中、低剂量治疗,免疫组化法检测小鼠移植瘤肺腺癌细胞Cyclin-D1阳性表达水平。结果:与阴性对照组比较,回生口服液高、中剂量组及顺铂组含药血清对肺腺癌细胞的生长抑制率明显增高,且干预的肺腺癌细胞G1期细胞比例明显增高,S期、G2期细胞比例明显减少(P<0.01,P<0.05);回生口服液中、高剂量及顺铂(DDP)治疗组小鼠肺腺癌细胞内CyclinD1阳性表达率明显低于模型组(P<0.01)。结论:回生口服液可明显抑制人肺腺癌细胞生长,使癌细胞停滞于细胞周期的G1期,并可明显降低肺腺癌细胞内CyclinD1的阳性表达。

1,25(OH)2D3联合顺铂对原代肺腺癌细胞周期及调控因子的影响

目的:探讨1,25(OH)2D3联合顺铂对原代肺腺癌细胞周期及周期相关调控因子的影响。方法:体外培养手术切除的肺腺癌组织细胞,经药物作用后CCK-8法测定细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测细胞周期调控因子Cyclin D1、CDK4转录水平。结果:不同浓度的1,25(OH)2D3、顺铂单药作用于肺腺癌细胞均有明显的抑制作用,两药联合表现为协同作用,与单药相比,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞周期分析显示,经药物联合处理后的肺癌细胞,G0/G1期细胞数增多,S期和G2/M期细胞减少。细胞周期调控因子Cyclin D1、CDK4转录水平均有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1,25(OH)2D3联合铂类抗癌药物抑制原代肺腺癌细胞的增殖能力、诱导细胞周期阻滞,与下调Cyclin D1和CDK4的表达有关。

益气解毒中药清金得生片诱导人肺腺癌细胞株HSP70表达的研究

目的探讨清金得生片治疗肺腺癌的作用机制。方法采用MTT比色及免疫组织化学染色(SABC)法检测清金得生片药物血清对人肺腺癌细胞株的抑制率及HSP70表达水平。结果清金得生片药物血清能促进人肺腺癌细胞株HSP70表达,并呈药物血清浓度依赖性地抑制人肺腺癌细胞株生长。结论清金得生片可能是通过诱导人肺腺癌细胞株HSP70表达的免疫效应而达到治疗肿瘤作用。

肺腺癌细胞株SPC-A-1细胞存活曲线参数的测定

目的:测定肺腺癌细胞株SPC-A-1细胞存活曲线参数。方法:将细胞分为单纯放射组和放射合并加热组,单纯放射组分别给予高能X线2、4、6、8Gy单剂量照射,放射合并加热组除给予相同剂量照射外,还于照射结束后立即加热,41.5℃,1h。集落形成率实验检测两组细胞在不同情况下的细胞存活分数,分别根据多靶单击模型和线形二次模型拟合绘制细胞存活曲线,求出D0、Dq及α/β比等细胞存活曲线参数,并获得照射2Gy时的存活分数SF2。结果:多靶单击模型中,单纯放射组细胞的D0、Dq值分别为1.693、2.453Gy,放射+加热组D0、Dq值分别为1.390、1.426Gy,SF2值由0.793降为0.532;线形二次模型中,细胞的α/β值由0.992Gy增至7.725Gy,SF2值则由0.743降为0.459。结论:尽管加热可以提高肺腺癌细胞株SPC鄄A鄄1的放射敏感性,但D0及SF2的值表明其对放射仍较抗拒。

阿霉素对不同C-erbB-2表达水平肺腺癌细胞株生长的影响

目的:研究阿霉素对体外培养不同C-erbB-2表达水平肺腺癌细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:采用集落形成实验检测阿霉素对人肺腺癌细胞体外增殖能力的影响,采用SABC法检测阿霉素对体外培养人肺腺癌细胞系C-erbB-2表达水平的影响,采用流式细胞术检测阿霉素对体外培养肺腺癌细胞生长周期的影响。结果:阿霉素可显著抑制3株人肺腺癌细胞的生长,并可使SPC-A-1和LTEP-a-2肺腺癌细胞系C-erbB-2的表达下降,在SPC-A-1和LTEP-a-2肺腺癌细胞系,G2-M期百分率明显升高,而在A549肺腺癌细胞系则可见明显的凋亡峰。结论:阿霉素抑制肺腺癌细胞株SPC-A-1和LTEP-a-2的生长机制可能与降低C-erbB-2表达引起肺腺癌细胞G2阻滞有关,其抑制肺腺癌细胞株A549生长则可能与诱导细胞凋亡有关。

冬凌草甲素诱导人肺腺癌细胞株A549凋亡及其机制研究

目的:探讨冬凌草甲素(oridnin)对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的影响。方法:利用MTT法检测oridnin对A549细胞增殖作用的影响;Hoechst33258染色观察给药后细胞形态改变;透射电镜观察给药后细胞超微结构改变;FITC-Annexin V/PI双标记检测细胞凋亡率。结果:Hoechst33258染色和透射电镜观察,oridonin给药后A549细胞出现空泡变性,染色质高度凝集;FITC-AnnexinV/PI双标记检测oridnin(25,50,100μmol/L)作用细胞48h后凋亡率分别为1.5%,6.2%,59.7%。结论:Oridonin对A549细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用。

沙利度胺联合顺铂对A549肺腺癌细胞株的体外实验

目的观察沙利度胺与顺铂(DDP)联合应用对A549人肺腺癌细胞凋亡的影响,观察沙利度胺对肺腺癌A549细胞VEGF、BFGF蛋白表达的影响。方法采用PI单染法流式细胞检测细胞凋亡率;采用免疫细胞化学方法检测沙利度胺处理后肺腺癌A549细胞VEGF、BFGF蛋白表达的变化。结果在一定浓度范围内,沙利度胺联合DDP处理组细胞凋亡率明显高于单药组;沙利度胺(7.5mg/L)作用于人肺腺癌A549细胞后,处理组的VEGF、BFGF蛋白表达与未加药组比较差异显著。结论沙利度胺DDP联合,可增加A549人肺腺癌细胞的凋亡率;沙利度胺可抑制A549人肺腺癌细胞VEGF、BFGF的蛋白表达。

神经递质与Bcl-2、耐药P糖蛋白对肺腺癌细胞株A549作用的实验观察

目的观察肾上腺素、去甲肾上腺素对肺腺癌细胞生长及与化疗作用的影响并探讨其与凋亡相关基因Bcl-2及耐药P糖蛋白表达的相关性。方法①将不同浓度的肾上腺素、去甲肾上腺素单独或与长春新碱(VCR)联合作用于肺腺癌细胞株A-549。四唑盐(MTT)试验测定药物对肺腺癌细胞A549的抑制率,筛选出药物的IC50浓度。②免疫组化法测定IC50浓度各药物应用对Bcl-2、P糖蛋白(P-gp)表达的影响,比较两者的相关性。结果①不同浓度的肾上腺素、去甲肾上腺素对肿瘤的生长及化疗有影响,且上述药物与IC50浓度的VCR联合应用时能增加VCR的抑制率,②用药后各组Bcl-2、P-gp表达均减少(P<0.01),且两者表达呈正相关。结论肾上腺素、去甲肾上腺素对A549细胞的生长及化疗有影响,其机制可能与凋亡相关基因Bcl-2及P-gp介导的肺癌耐药机制有关。

肺腺癌细胞株培养方法改进

目的 :探讨培养条件及冻存方法对肺腺癌细胞株的影响。方法 :在培养基中放弃使用抗生素 ,控制细胞传代、消化条件 ,采用快速冻存法保存细胞。结果 :37℃ ,5 % CO2 孵箱培养 2 h左右开始贴壁 ,8h左右完全贴壁 ,48～6 0 h可形成单层。结论 :(1)只要切实注意无菌操作规程 ,培养基中无需常规使用抗生素 ;(2 )控制胰酶条件、离心速度可减少细胞培养过程中的损伤 ;(3)细胞快速冻存法优于传统的慢速冻存法。

反应停对肺腺癌细胞株诱导的血管内皮细胞增殖的影响

目的探讨反应停对肺腺癌细胞株诱导的血管内皮细胞增殖的影响。方法用噻唑兰法检测不同浓度反应停对血管内皮细胞株ECV304(ECV304细胞)、肺腺癌细胞株SPC-A1(SPC-A1细胞)及其诱导的血管内皮细胞ECV304增殖的影响。结果反应停浓度为8.0和80.0μg/ml时对ECV304细胞增殖有抑制作用(P<0.05);不同浓度反应停对SPC-A1细胞增殖无影响;经8.0和80.0μg/ml反应停作用后SPC-A1细胞条件培养液对ECV304细胞增殖有抑制作用(P均<0.05),其细胞生长抑制率分别为5.19%、12.49%。结论反应停对SPC-A1细胞诱导的ECV304细胞增殖有抑制作用。

ABCE1基因稳定过表达肺腺癌细胞株的建立

目的构建能够携带绿色荧光蛋白ABCE1基因的表达载体p EGFP-C1-ABCE1,转染肺腺癌细胞株LTEP-a-2,筛选并建立过表达ABCE1基因的细胞株。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增ABCE1全长m RNA,通过酶切、连接ABCE1及表达载体p EGFP-C1,构建重组质粒p EGFP-C1-ABCE1。采用脂质体转染将重组质粒转染至LTEP-a-2细胞,并以G418筛选阳性克隆,建立起能稳定过表达ABCE1基因的细胞株。结果成功构建重组质粒载体p EGFP-C1-ABCE1,并通过酶切及基因测序验证。将重组质粒成功转染入LTEP-a-2细胞,通过G418筛选后(600μg/m L),获得的细胞株能够稳定持续地表达绿色荧光,其ABCE1基因表达明显高于野生型肺腺癌细胞。结论成功构建了ABCE1表达载体p EGFP-C1-ABCE1,建立稳定过表达ABCE1基因的肺腺癌细胞株LTEP-a-2,为进一步研究ABCE1在肺腺癌中的功能及机制打下了基础。

肺腺癌细胞株在不同浓度化疗药物连续刺激下erbB-2与c-myc基因的动态变化

目的:观察肺腺癌细胞株在连续化疗过程中erbB-2与c-myc基因的动态变化。方法:人肺癌细胞株经阿霉素、足叶乙甙、顺铂单药及联合用药连续刺激,每种药物分高、低个剂量梯度组,同时设对照组。记录细胞每次刺2激间隔的时间。应用流式细胞术分别检测erbB-2,c-myc的阳性细胞数及平均荧光强度,以此推算出不同药物在不同浓度下连续两三次作用细胞株后以上各蛋白表达的细胞数、平均表达量、总表达量。结果:随着培养时间的延长各项检测指标其阳性细胞的百分数、平均荧光强度及总荧光强度均呈下降趋势。erbB-2在高剂量各组基本上均随刺激次数的增加呈下降趋势,总表达量由94.8～1708.3下降到5.3～81.3;而低剂量的顺铂单药及联合用药组则上升。c-myc则无一定规律。结论:第次化疗后,erbB-2表达增高,随化疗次数增加表达大幅度下1降;化疗剂量大小与c-myc的表达无关。