金复康口服液对吉非替尼耐药肺腺癌H1975细胞有氧糖酵解的影响

目的 探讨金复康口服液联合吉非替尼对肺腺癌H1975细胞有氧糖酵解的影响。方法 首先采用CCK-8法检测不同浓度金复康口服液和吉非替尼对H1975细胞增殖的影响;然后实验分为空白组、吉非替尼组、金复康口服液组和联合用药组,采用2-NBDG荧光探针和乳酸测试盒分别检测各组细胞葡萄糖摄取能力及乳酸生成量,酶活性试剂盒检测细胞中糖酵解关键限速酶[己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)]的活性,Western blot法检测细胞中己糖激酶2(HK2)、P型磷酸果糖激酶(PFKP)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)蛋白表达情况,JC-1、DCFH-DA荧光探针分别检测细胞线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平。结果 金复康口服液对H1975细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性增强,差异均有统计学意义(P均<0.05);与不同浓度吉非替尼单独作用48 h比较,相应浓度吉非替尼联合金复康口服液作用后的H1975细胞增殖抑制率均更高(P均<0.05)。各给药组细胞葡萄糖相对摄取量与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);各给药组细胞乳酸生成量均明显低于空白组(P均<0.05),且联合用药组明显低于吉非替尼组和金复康口服液组(P均<0.05);吉非替尼组PFK、PK活性,金复康口服液组HK、PFK活性,联合用药组HK、PFK、PK活性均明显低于空白组(P均<0.05),且金复康口服液组与联合用药组HK、PFK活性均明显低于吉非替尼组(P均<0.05)。金复康口服液组和联合用药组HK2、PFKP、PKM2蛋白相对表达量及吉非替尼组PFKP蛋白相对表达量均明显低于空白组(P均<0.05),且金复康口服液组和联合用药组HK2、PFKP、PKM2蛋白相对表达量均明显低于吉非替尼组(P均<0.05)。与空白组比较,各给药组细胞线粒体膜电位明显下降,ROS明显增加,且联合用药组细胞线粒体膜电位下降和ROS增加更明显。结论 金复康口服液能通过抑制有氧糖酵解途径,降低细胞线粒体膜电位,促进ROS产生,增加H1975细胞对吉非替尼的敏感性。

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及其诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究

通过RT-PCR的方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并构建了真核表达载体pCMV-Myc/NS1。将此真核表达质粒转染肺腺癌细胞A549,48 h后,经Western印迹检测,NS1基因能在细胞中正确表达。经荧光显微镜、透射电镜观察和流式细胞仪检测,发现该株流感病毒的NS1蛋白可诱导肺腺癌细胞A549凋亡。

瑞香狼毒提取液逆转EGFR-TKI耐药肺腺癌H1975细胞的作用及其机制

目的:探讨瑞香狼毒(stellera chamaejasme L,SCL)乙醇提取液逆转表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)耐药肺腺癌H1975细胞的作用及其机制。方法:用MTT法检测SCL、吉非替尼(gefitinib)及两药联用对H1975细胞的抑制率,细胞划痕实验检测药物对H1975细胞迁移的影响,流式细胞术测定药物对细胞凋亡的影响,Western blotting检测不同药物处理后各组肿瘤细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及细胞通路关键分子p-EGFR的表达。观察SCL联用gefitinib后裸鼠移植瘤的体积和总生存期(OS),ELISA检测荷瘤裸鼠血清中Bcl-2、p-EGFR含量。结果 :SCL对H1975细胞IC50为(21.35±2.11)mg/ml,gefitinib的IC50为(11.21±1.68)μmol/L。SCL联用gefitinib后H1975细胞抑制率明显高于gefitinib(1μmol/L)和SCL(5 mg/ml)两组单独应用[(49.78±7.09)%vs(8.45±2.57%)、(12.88±3.64)%,均P<0.01],两药联用H1975细胞迁移指数明显低于gefitinib和SCL两组单独应用[(22.4±6.5)%vs(70.3±4.9)%、(67.1±10.5),均P<0.01],流式细胞仪检测显示两药联用细胞凋亡率明显高于两者单用[(51.68±6.56)%vs(9.88±2.71)%、(9.48±2.45)%,均P<0.01],Western blotting检测H1975细胞凋亡相关蛋白发现,联用组可明显降低Bcl-2和p-EGFR的表达(P<0.01)。抑制移植瘤实验显示,联用药组荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢,OS明显延长(P<0.01)。结论:SCL可逆转肺腺癌H1975细胞对EGFR-TKI的耐药,其机制可能与降低EGFR的磷酸化、下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关,从而为EGFR-TKI耐药肺腺癌治疗提供了新思路。

薯蓣皂苷通过调控PI3K/AKT信号通路抑制人肺腺癌细胞H1299上皮间质转化

目的研究薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)对人肺腺癌细胞H1299上皮间质转化的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用不同浓度Dio(1、2、4、8μmol·L^(-1))处理H1299细胞24、48 h,CCK8法检测细胞的增殖能力。选择低于IC_(50)浓度的Dio(1、2μmol·L^(-1))作用于H1299细胞,采用细胞划痕实验和Transwell穿膜实验观察不同浓度Dio对H1299细胞迁移能力的影响;采用铺有Matrigel胶的Transwell实验检测Dio对H1299细胞侵袭能力的影响;Western Blot法检测Dio对H1299细胞中E-cadherin、Zonula occluden 1(ZO-1)、ZEB1、Cludin-1、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、PI3K、AKT、P-AKT蛋白表达的影响;免疫荧光法检测间质标志物Vimentin在细胞中的定位及表达情况。结果 Dio干预24、48 h后的IC_(50)值分别为3.50、3.21μmol·L^(-1),且呈现浓度依赖性。Dio干预后与空白对照组比较,Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组的细胞愈合率显著降低(P<0.05,P<0.001);Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组均能显著抑制H1299细胞的迁移能力(P <0.001),并显著抑制H1299细胞体外侵袭能力(P <0.001);Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组能明显上调E-cadherin、ZO-1和Cludin-1蛋白的表达(P <0.05,P <0.01,P <0.001),下调N-cadherin、Vimentin、ZEB1、β-catenin蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、AKT、P-AKT的表达(P <0.05,P <0.01,P <0.001);Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组免疫荧光定位表达结果显示Vimentin表达明显降低。结论 Dio能有效抑制人肺腺癌H1299细胞增殖,低于IC_(50)浓度的Dio(1、2μmol·L^(-1))能明显抑制H1299细胞的迁移与侵袭能力,可能与通过调控PI3K/AKT信号通路有关。

肺岩宁方联合吉非替尼对肺腺癌H1975细胞体外增殖的影响

目的观察吉非替尼耐药肺腺癌H1975细胞在肺岩宁方、吉非替尼作用下体外增殖情况,探讨肺岩宁方逆转吉非替尼耐药可能的机制。方法选取肺腺癌T790M突变耐药株H1975细胞,分为对照组、吉非替尼组、肺岩宁方组和联合干预组。CCK-8法检测各组细胞在不同时间点(0 h、24 h、48 h、72 h)的增殖率;Western blot检测EGFR-PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。结果CCK-8结果显示,肺岩宁方组对于H1975细胞在体外增殖呈剂量依赖性抑制,即随着药物浓度的提高而增加;联合干预组对于抑制细胞体外增殖效果较单药明显。Western blot显示,联合干预组可下调p-EGFR、p-Akt、pmTOR的表达。结论肺岩宁方联合吉非替尼可抑制H1975细胞的体外增殖,体外抑制效果较单药治疗明显;其延缓吉非替尼耐药机制可能与下调EGFR-PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达有关。

上调THBS1蛋白的表达对肺腺癌H1975细胞迁移能力的影响

目的:探讨上调血小板凝血酶蛋白1(THBS1)的表达对肺腺癌H1975细胞体外迁移能力的影响。方法:H1975细胞分为3组,空白对照组不处理,空载体转染组及pc DNA-THBS1转染组分别用脂质体转染空载体pc DNA3. 1和pc DNA3. 1-THBS1真核表达载体,采用划痕实验检测细胞迁移能力,用qRT-PCR、Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA、蛋白的表达情况。结果:与空白对照组和空载体转染组相比,pc DNATHBS1转染组H1975细胞迁移能力增强,细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达升高(P <0. 05)。结论:上调THBS1蛋白可以增强肺腺癌H1975细胞体外迁移能力。

H3N2亚型禽流感病毒及猪流感病毒感染人肺腺癌细胞后增殖的差异性变化

人肺腺癌细胞A549被H3N2亚型禽流感病毒和猪流感病毒感染后,探讨不同毒株跨种属感染人呼吸道组织的可能性和趋势性。通过观察病毒感染A549细胞后的细胞病变(CPE)、血凝试验(HA)和50%组织细胞感染量(TCID50)来比较不同毒株感染细胞后的复制差异和毒力改变,发现同一亚型不同来源的流感病毒对A549细胞感染和复制能力有较大差异,哺乳动物来源的病毒更有感染人呼吸道细胞的趋势,SW/GX/NS2783/2010有潜在的感染人细胞的能力。感染过程中的细胞因子变化和病毒基因组组成特点是进一步研究的方向,应重点关注具有跨种属感染趋势的流感病毒及其特殊分子决定簇的组成和特点。

罗米地辛与阿糖胞苷联合用药在肺腺癌细胞中介导组蛋白H3K14乙酰化提高CASP3转录活性

肺癌发病率和病死率均居全球恶性肿瘤首位,有效的药物是治疗肺癌的关键。罗米地辛和阿糖胞苷是已经批准上市并应用于临床治疗的癌症化疗药物。这两种药物的联合用药是否在肺腺癌的治疗中发挥作用及其相关分子机制尚不明确。本研究通过MTT和克隆形成实验证实,罗米地辛和阿糖胞苷联合用药可以显著抑制肺腺癌细胞A549的生长(P<0.05)。体外Transwell细胞侵袭实验和划痕实验表明,联合用药可有效降低肺腺癌细胞的侵袭和转移能力(P<0.05)。同时,流式细胞分析显示,联合用药可以显著诱导肺腺癌细胞的凋亡(P<0.05),并且实时PCR和Western印迹结果提示,肺腺癌细胞A549在联合用药处理后,凋亡相关蛋白质CASP3的mRNA和蛋白质表达水平均明显升高。另外,通过检测联合用药后,A549细胞的组蛋白乙酰化修饰情况发现,H3K14位点乙酰化水平被明显上调,并且ChIP分析进一步显示,CASP3启动子区域组蛋白H3K14乙酰化水平在联合用药后明显增加(P<0.05)。本研究揭示了罗米地辛与阿糖胞苷联合用药能通过增强CASP3启动子区组蛋白H3K14乙酰化水平进而促进CASP3的转录和蛋白质表达,从而抑制肺腺癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡的分子机制。在分子和细胞水平上为罗米地辛和阿糖胞苷联合用药治疗肺腺癌提供依据,并为肺腺癌的临床治疗提供切实参考。

扁柏醇联合氯喹对人肺腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨扁柏醇(Hinokitiol)联合氯喹对人肺腺癌(H1975)细胞凋亡的影响。方法选用人肺腺癌H1975细胞系,应用MTT法检测扁柏醇和(或)氯喹对H1975细胞活性的影响,Western blot法检测扁柏醇和(或)氯喹对H1975细胞凋亡通路相关蛋白(Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Bax)表达水平的影响。结果 0、2.5、5、10μmol/L扁柏醇作用H1975细胞24 h后,呈剂量依赖性地抑制H1975细胞增殖,H1975细胞凋亡相关蛋白(Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Bax)表达水平升高。当氯喹和扁柏醇联合应用时,与单用扁柏醇相比,显著降低H1975细胞存活率,并提高H1975细胞凋亡率,凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3表达水平显著增加。结论氯喹增加扁柏醇诱导人肺腺癌H1975细胞凋亡。

miR-138-5p通过PDK1对人肺癌细胞系H23生物学行为的影响

目的探讨微小RNA-138-5p(miR-138-5p)通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)对人肺腺癌细胞系H23生物学行为的影响。方法以肺腺癌细胞系H23作为研究对象,分别转染miR-NC(对照组)或miR-138-5p(实验组);qRT-PCR与Western blot法检测miR-138-5p、PDK1 mRNA在转染后人肺腺癌细胞系H23中表达水平;双荧光素酶报告基因检测miR-138-5p及基因PDK1之间的靶向关系;MTT法、划痕实验、Transwell实验检测增殖、迁移与侵袭能力。结果qRT-PCR检测H23细胞转染后miR-138-5p mRNA表达水平升高,PDK1 mRNA与蛋白表达下调,荧光素酶报告基因实验提示miR-138-5p可与PDK1的3’-UTR直接结合,与PDK1存在靶向关系。miR-138-5p可抑制H23细胞增殖、迁移和侵袭能力。结论miR-138-5p可通过靶向干扰PDK1抑制人肺腺癌细胞系H23细胞的增殖、迁移与侵袭能力,提示miR-138-5p与PDK1可能是治疗肺癌的潜在靶点。

奥希替尼联合贝伐珠单抗对EGFR-TKIs耐药H1975细胞增殖的抑制作用及机制研究

目的:探讨奥希替尼(AZD)联合贝伐珠单抗(BEV)对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)耐药H1975细胞增殖的作用及可能的机制。方法:体外培养人肺腺癌细胞株H1975(E21 L858R/E20 T790M),并通过低浓度加量递增方法诱导建立EGFR-TKIs奥希替尼耐药株H1975/OR。将H1975和H1975/OR细胞分为空白组(不做任何药物处理)、AZD组(不同浓度AZD处理)、BEV组(不同浓度BEV处理)和AZD+BEV组(先加入不同浓度BEV,6 h后加入不同浓度AZD)。分别利用MTT法和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡活性,并计算半数抑制浓度(IC50)和联合应用指数(CI)。Western blotting检测各组细胞EGFR、蛋白激酶B(Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6蛋白激酶(p70s6k)、5-磷酸腺苷激酶(AMPK)蛋白及相应磷酸化蛋白表达量。结果:成功建立AZD耐药细胞株H1975/OR细胞,对AZD的耐药指数为90.57。AZD+BEV抑制H1975细胞增殖的CI分别为0.749、0.790、0.409、0.508、0.298、0.009,CI均<1;抑制H1975/OR细胞增殖的CI分别为0.375、0.111、0.068、0.229、0.592、0.105,CI均<1。AZD+BEV组H1975细胞和H1975/OR细胞凋亡率均高于空白组、AZD组和BEV组(P<0.05)。与空白组、AZD组和BEV组比较,AZD+BEV组H1975细胞和H1975/OR细胞p-EGFR、p-Akt、p-ERK、p-mTOR、p-p70s6k蛋白表达量降低,同时p-AMPK蛋白表达量升高。结论:AZD联合BEV可协同抑制H1975细胞和H1975/OR细胞的增殖活力,其作用机制可能是通过下调VEGF表达进而抑制EGFR及其下游PI3K/AKT/mTOR通路和AMPK/ERK/mTOR通路的磷酸化激活。

低氧诱导因子-1α mRNA在克唑替尼诱导H2228细胞凋亡中的作用

目的探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在克唑替尼诱导EML4-ALK阳性肺腺癌细胞株H2228凋亡中的作用。方法 (1)用10、30、90、270、810 nmol/L浓度梯度的克唑替尼处理H2228细胞48 h,MTT比色法测定细胞增殖能力。(2)用100、200、300 nmol/L克唑替尼处理H2228细胞48 h,Annexin V流式细胞仪检测凋亡细胞。(3)RT-PCR实验:1采用50、100、200、400、800μmol/L浓度的低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)作用H2228细胞24 h,观察HIF-1α的mRNA表达水平变化。2常氧对照组(0.5%DMSO培养基48 h)、常氧+克唑替尼组(0.5%DMSO培养基24 h+500 nmol/L克唑替尼24 h)、低氧对照组(200μm/L CoCl224 h+0.5%DMSO培养基24 h)、低氧+克唑替尼组(200μm/L CoCl224 h+500 nmol/L克唑替尼24 h),采用RT-PCR方法检测各组细胞HIF-1α、Akt、VEGF mRNA的表达水平。结果 (1)MTT实验结果示:随着克唑替尼药物浓度升高,H2228细胞增殖抑制率逐渐升高,呈剂量依赖性,半增殖抑制浓度(IC50)为335 nmol/L。(2)凋亡实验结果示:H2228细胞凋亡率随克唑替尼浓度增加而升高,呈剂量依赖性。(3)RT-PCR实验结果示:1随着CoCl2浓度的增加,HIF-1α的mRNA表达水平逐渐下降,呈剂量及时间依赖性,于200μm/L浓度时下降最明显。2与对照组相比,无论是在常氧还是低氧,克唑替尼组H2228细胞HIF-1α、Akt的mRNA表达均上调,VEGF的表达下调。与常氧+克唑替尼组比较,低氧+克唑替尼组HIF-1αmRNA上调更明显(P<0.05)。结论克唑替尼对肺腺癌细胞株H2228的增殖抑制和诱导凋亡作用呈剂量依赖性,HIF-1αmRNA的上调在克唑替尼诱导肺癌细胞凋亡过程中发挥重要作用。

姜黄素对人肺腺癌NCI—H1975细胞放射的增敏作用

目的研究姜黄素对人肺腺癌NCI—H1975细胞放射增敏的作用。方法选取人肺腺癌NCI-H1975细胞作为研究对象，将细胞分为对照组、单独姜黄素处理组、单独放射处理组、姜黄素联合放射处理组。采用CCK-8实验检测细胞增殖的变化；流式细胞仪检测细胞周期的改变；细胞核Hochest33258染色技术和AnnexinV—FITC／PI双染技术检测细胞凋亡的情况。结果CCK-8实验结果发现姜黄素与X射线联合处理能显著抑制肺腺癌细胞增殖，且具有浓度依赖性。流式细胞仪检测发现姜黄素与X射线联合作用可以将细胞大部分阻滞在S期。细胞核染色及AnnexinV—FITC／PI双染技术结果发现姜黄素联合x射线可以增强姜黄素诱导的细胞凋亡作用。结论姜黄素联合X射线对人肺腺癌NCI-H1975细胞有很好的增殖抑制效果，其机制可能与细胞的S期阻滞有关，并且可以诱导细胞凋亡。

H7N9流感病毒在4种细胞中培养情况的研究

目的了解H7N9流感病毒在不同细胞中增殖的感染动力学差异。方法将H7N9流感病毒分别接种于鸡成纤维细胞(DF-1)、狗肾细胞(MDCK)、人支气管上皮细胞(BEAS-2B)、人肺腺癌细胞(A549),观察病毒在各细胞内增殖后细胞病变效应(CPE)、血凝实验滴度及50%组织培养细胞感染剂量。结果 H7N9流感病毒在A549细胞中培养36 h可达到血凝效价最高,同时可见明显CPE,在DF-1及MDCK细胞中培养72 h后血凝效价达到最高;在BEAS-2B细胞中增殖不明显,培养液对豚鼠血无明显凝集,且培养超过96 h尚无明显CPE。DF-1细胞、MDCK细胞、A549细胞对病毒的TCID50实验结果分别为10^(-4.34)、10^(-5.13)、10^(-3.84)。结论本实验使用的H7N9流感病毒不能有效感染BEAS-2B细胞并在其中增殖,但是可以在DF-1、MDCK及A549细胞中有效增殖。增殖能力以MDCK细胞最强,DF-1细胞略弱,A549细胞次之。A549细胞对病毒的吸附能力较强,可快速达到增殖的高峰。