人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究

目的 :对已构建的人肽抗生素hPAB β 1～ 8拷贝串联基因工程菌进行筛选 ,并对其优势菌株进行发酵研究 ,为hPAB β的规模生产奠定基础。 方法 :对 1～ 8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后 ,选择 2～ 5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较 ,确定最佳多拷贝菌 ;对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。 结果 :在相同条件下 ,3拷贝菌产量(3.15 3g/L)最高 ,目标蛋白表达率 (2 7.8% )接近最高水平 ,包涵体能溶解完全 ;利用亲和层析能成功捕获融合蛋白 ,后者经羟胺裂解 ,可获得相对分子质量与合成hPAB β成熟肽大小相符的小肽 ,筛选出的优势菌传代稳定 ,其最佳摇瓶发酵条件为 37℃ ,16 0r/min条件下 ,在改良M 9 CAA培养液中培养至吸光值 (A60 0 )≈ 2 .5时 ,以终浓度为10 0 μmol/L的IPTG诱导表达 5h。 结论 :确定了 3拷贝菌为最佳多拷贝菌 ,并确定了其最佳摇瓶发酵参数。

重组人肽抗生素hPAB-β的初步纯化

目的 探索重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,为制备高纯度、高活性的重组hPAB β奠定基础。方法 将构建的含pQE32 CP hPAB β重组质粒的基因工程菌扩大培养 ,诱导表达后所得菌体经溶菌酶法裂解 ,鉴定融合蛋白表达形式 ;以含融合蛋白的溶液作为纯化的初始样品 ,采用Ni NTAresin亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,用CNBr裂解 ,利用SephadexG 5 0、Bio gelP6DG凝胶进行分子筛层析 ,利用Macro PrepHighS进行阳离子交换层析 ,对层析峰行Tris Tricine电泳分析。结果 融合蛋白以包涵体形式存在 ;亲和层析获得了纯度为 82 .6 %的融合蛋白 ,CNBr作用 2 0h可完成融合蛋白的裂解 ;目的肽经纯化后 ,纯度达 95 %以上。结论 已初步建立了重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,并获得了高纯度的肽抗生素hPAB β。

重组人肽抗生素hPAB-β及其突变体的活性测定与筛选

目的 测定重组人肽抗生素 h PAB- β及其突变体的抗菌活性 ,筛选理想的活性分子。方法 应用平板法和 MIC测定法检测重组表达的 h PAB- β及突变体 h PAB- β38、h PAB- β34对 8株实验室保存菌株及 10株临床分离菌株的杀菌能力 ,并以化学合成的肽抗生素 h PAB- β作对照 ;根据各目的分子抗菌能力的强弱 ,筛选理想的目标分子 ,并分析突变体结构的变化对其功能的影响。结果 重组 h PAB- β及突变体 h PAB- β38与化学合成的天然分子抗菌活性相当 ,对革兰氏阳性菌的 MIC在 12 5～ 2 5 0 μg/ml之间 ,对革兰氏阴性菌的MIC在 31～ 12 5 μg/ml范围内 ;突变体 h PAB- β34活性下降 4倍左右 ;结构分析表明 h PAB- β38与 h PAB- β参与二级结构中 α螺旋和 β片层构成的氨基酸残基完全相同 ,而 h PAB- β34则有显著不同 ,α螺旋少了 2个残基 ,3个 β片层中除 β2与 h PAB- β相同外 ,β1和 β3的构成均多 2个残基 ,推测 h PAB- β34二级结构的改变是其活性降低的主要原因。结论 重组肽抗生素 h PAB- β具有抗菌活性 ,删除 3个端残基的突变体 h PAB- β38活性不变 ,可作为 h PAB- β走向临床应用的一个新侯选者。

人肽抗生素hPAB-β分子的同源模建及其突变体设计

目的 :获得肽抗生素hPAB β的分子结构 ,设计其突变体。 方法 :在序列比较的基础上 ,利用同源分子对hPAB β进行同源模建 ,并以此为基础设计其突变体 ,通过PCR引入突变法获得突变体基因序列 ,将其克隆到原核融合蛋白表达质粒 pQE CP4中 ,转化JM 10 9大肠杆菌进行表达。 结果 :模建结果表明 ,hPAB β由一个α螺旋和3个 β片层构成 ,二级结构保守 ,具有两亲性结构 ;其α螺旋推测与活性寡聚体形成有关 ;Asp4带负电 ,可能通过削弱寡聚体中央微孔口处阳电荷富集区而降低目的分子的生物学活性。利用PCR成功克隆了所设计的突变体基因 ,通过构建融合蛋白表达质粒 ,实现了突变体融合蛋白在大肠杆菌中的表达。 结论 :基于分子同源模建的肽抗生素hPAB β突变体的设计、克隆和成功表达 ,为筛选肽链更短。

低能离子注入诱变法选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

目的为进一步提高产量,以小单孢菌Micromonospora sp.TMD166-MU1为出发菌株,采用低能离子注入技术,研究不同离子注入参数对菌株存活率、正负突变率的影响,通过突变株抑菌活性变势参数分析,初步探讨N+离子注入对166A生产菌所产生的诱变效果,并结合卡那霉素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选,获得高产菌株。方法利用低能N+离子注入技术对出发菌株TMD166-MU1的孢子进行辐照诱变,以卡那霉素耐受性为选择压力,不同诱变条件处理的菌悬液涂布在含有卡那霉素培养基平板上培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法进行高产菌株初筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用高效液相法检测突变株摇瓶发酵的化学效价。结果通过研究30和60 keV能量下不同注入剂量与小单孢菌正突变率的生物学效应关系,确定了在注入能量为30 keV、注入剂量4×10^(13)ions/cm^(2)、卡那霉素抗性筛选浓度为6 mg/L条件下,可获得最高达36.33%的正突变率。复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有4株,其中突变株IK-3的166A产量是菌株TMD166-MU1的1.8倍。结论采用低能N+离子注入诱变方式,再结合抗生素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选的集成方法能简单、高效地获得166A高产突变菌株。

杂合抗菌肽KL-21与抗生素体外协同抗菌效果研究

为了进一步研究杂合抗菌肽KL-21的抗菌活性和探索其应用潜力,试验测定了KL-21和抗生素对4种常见致病菌的抑菌活性,同时评估了KL-21与4种常见抗生素联用的协同效果。试验采用微量倍比稀释法测定KL-21和4种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC),利用棋盘试验法测得部分抑菌浓度指数(FIC)评估联用后的协同效果。结果表明,KL-21对4种致病菌均有良好的抑菌活性,与卡那霉素、庆大霉素、链霉素及氯霉素联合使用时具有协同或部分协同作用,可以将抗生素体外抑菌试验的MIC减少至1/16~1/2,为人工设计杂合抗菌肽KL-21的实际应用提供了参考,为畜牧生产以及动物疫病治疗提供更多选择。

一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达

目的 通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。 方法 根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表达载体 ,进一步将肽抗生素hPAB β基因插入上述表达载体 ,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列 3’ 端 ,两者构成融合基因。将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,并用阳性重组子表达融合蛋白。结果 设计的承载蛋白为 163个氨基酸 ,分子量 17668.80 ,等电点 5 .62 1。用承载分子与肽抗生素hPAB β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后 ,筛选到 4个阳性重组子 ,均能高效表达肽抗生素融合蛋白 ,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的 40 %～ 45 %。结论 设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达。

肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础。方法用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定。重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子。结果构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性。结论本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备。

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法。方法采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-Ⅱ过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析。最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定。结果在培养至工程菌菌体湿重约200～250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L。发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的(体积浓缩约2/3)。再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的产物的纯度达98%以上,得率达32.5%。且纯化的目的蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。结论酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的蛋白、酵母色素及脱盐的目的,为规模化制备hPAB-β创造了前提。

肽抗生素hPAB-β的化学合成及其杀菌活性的初步证实

目的 化学合成、纯化并初步测定肽抗生素hPAB β的活性 ,为后续研究奠定基础。 方法 采用固相合成法合成肽抗生素hPAB β ,经RP HPLC纯化 ,用质谱进行分子量鉴定 ,谷胱甘肽氧化 还原法复性合成产物 ,进一步用阳离子交换柱纯化复性产物 ,收集主峰 ,药敏法初步测定合成肽的抗菌活性。结果 合成肽抗生素hPAB β的纯度为 86 5 2 % ,经质谱分析 ,合成肽的分子量测定值与理论值相符。用谷胱甘肽氧化 还原法复性合成肽取得了较好的效果。复性产物对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌具有杀灭作用。结论 化学合成的肽抗生素hPAB β具有良好的杀菌活性。

重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β及其抑菌活性初步鉴定

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h甲醇诱导后结束发酵。对发酵上清进行反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,通过抑菌实验对纯化产物进行活性鉴定。结果3次高密度发酵在菌体湿重分别达到235.0 g/L、210 g/L和264.8g/L时进行诱导表达,发酵上清中目标肽的表达量分别达73.7 mg/L、76.6 mg/L和74.3 mg/L。发酵上清通过反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,获得重组肽抗生素hPAB-β,该重组蛋白经抑菌实验显示了较好的抑菌活性。结论成功实现了酵母工程菌的高密度发酵,为下一步规模化制备hPAB-β奠定了基础。

肽抗生素hPAB-β基因串联体的构建及原核细胞表达初探

目的 : 构建肽抗生素hPAB β基因多拷贝串联体重组质粒 ,实现目的基因串联产物在大肠杆菌中的高效表达。 方法 :以表达质粒pQE 32为载体 ,利用同裂酶PstⅠ与AvaⅢ能产生相同粘端的特性 ,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等操作 ,构建含不同数目hPAB β基因的串联体。对获得的重组菌用异丙基巯基半乳糖 (IPTG)诱导表达 ,Tricine SDS PAGE观察串联体融合蛋白的表达情况。 结果 :构建了一至八拷贝的串联体重组质粒 ,经酶切、DNA测序分析表明 ,各串联体的DNA序列及阅读框完全正确。Tricine蛋白电泳显示 ,各串联体的阳性转化菌株经IPTG诱导后均能表达出目的融合蛋白 ,相对分子质量与预期结果相符 ,表达量占细菌总蛋白的 1 0 %～2 2 %。但八拷贝较其他串联体表达率有所降低。 结论 :hPAB β基因串联体重组表达质粒的成功构建 ,为大量制备目的肽抗生素奠定了基础 ,并为其他小分子生物活性肽的制备提供了参考。

肽抗生素hPAB-β制备工艺中基因工程菌的改建

目的通过重新构建新的3拷贝串联体基因工程菌phPAB-β(3)/M15,在原有肽抗生素hPAB-β制备工艺路线基础上,使发酵后目的肽的最终产量得到提高。方法重新构建含有重组质粒pQE31-hPAB-β(3)的基因工程菌M15,然后筛选出能够稳定而且高效表达目标蛋白的最佳工程菌株,进行传代稳定性分析,并明确新建工程菌中目标融合蛋白的表达形式和亲和层析的效果,最后通过相同条件下,在逐步放大的发酵规模(1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐),与以往的3拷贝串联体工程菌phPAB-β(3)/JM109进行对比研究(湿菌产量、目标蛋白表达率),同时观察新建工程菌在10L发酵中目标蛋白的表达和遗传稳定性。结果筛选出的最佳工程菌株的目标蛋白的表达效率为34.8%,经LB培养传代10次后,点种LB(AMP、KAN)平板,生长率为100%,质粒保存率达100%。在1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐的发酵规模下,phPAB-β(3)/M15与phPAB-β(3)/JM109一样,目标融合蛋白都以包涵体形式表达,亲和层析效果相近,目标蛋白表达率无显著性差异(P>0·05),但发酵产量大于后者,有非常显著性差异(P<0·01)。且新建工程菌在10L发酵中发酵产量达到55.15g/L,诱导表达后的第5小时,蛋白表达达到高峰,蛋白表达率为30.2%,重组质粒保存率为100%。结论新构建工程菌phPAB-β(3)/M15比起原来基因工程菌phPAB-β(3)/JM109,是更为理想且利于肽抗生素hPAB-β工业生产的基因工程菌。

肽抗生素hPAB-β抗金黄色葡萄球菌L型活性分析

目的观察毕赤酵母高密度发酵表达的肽抗生素hPAB-β对L型细菌的抗菌活性。方法采用新青Ⅱ纸片扩散法诱导金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923L型,通过形态学观察、滤过实验、回复实验以及电镜观察鉴定L型菌;采用酵母高密度发酵制备肽抗生素hPAB-β,通过稀释法检测hPAB-β对L型细菌的抗菌活性并测定其最小抑菌浓度(MIC)。结果用新青Ⅱ可成功诱导金黄色葡萄球菌L型;所得L型菌能通过0.45μm的滤膜;撤去抗生素后,L型能回复为野生菌;电镜下见多数金葡菌L型的细胞壁部分缺失,少数完全缺失;稀释法检测显示hPAB-β对金葡菌L型具有良好的抗菌活性,其MIC值为32μmol/L。结论肽抗生素hPAB-β对金葡菌L型有良好的抗菌活性。

分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的多肽类抗生素

试验基于分散固相萃取净化结合超高效液相色谱-串联质谱法,建立一种同时测定饲料中16种多肽类抗生素(PPTs)的定量分析方法。样品经1%三氯乙酸(aq)-甲醇溶液提取,十八烷基硅胶(C18)分散固相萃取净化后上机测定。在电喷雾正电离模式下,使用多反应监测(MRM)模式,基质匹配校正曲线定量。结果显示,PPTs在相应的浓度范围内线性关系良好,相关系数(R2)大于0.99,检出限为0.4~12.1μg/kg,定量限为1.4~40.4μg/kg。PPTs在饲料中的平均回收率(n=6)为80.0%~114.4%,相对标准偏差(RSD)为2.33%~9.51%。研究表明,该方法操作简单、准确可靠、灵敏度高、分析时间短且重现性高,可广泛应用于饲料中16种PPTs的快速筛查和常规监测。

两种方法测试抗菌肽与抗生素的联合抑菌效果

为了解抗菌肽泰立停与抗生素的联合抑菌作用,本研究通过倍比稀释法和纸片法测试了泰立停和抗生素在单用和联用时对大肠杆菌和沙门菌的抑菌活性。结果表明:抗菌肽泰立停和抗生素安普霉素、恩诺沙星、多西环素在单用时对大肠杆菌和沙门菌均有不同程度的抑菌活性,在联合使用时,倍比稀释法观察到泰立停与恩诺沙星联合可以提高对大肠杆菌CVCC1568的抑菌活性;纸片法观察到仅泰立停与多西环素以8∶2的比例进行联合时对大肠杆菌AE1具有联合抑菌作用,同时观察到泰立停与某些抗生素联合时,抑菌效果与该抗生素单用的效果相当。说明抗菌肽泰立停与某种抗生素联合可针对某种菌的某些菌株有很好的抑菌活性,同时可以降低抗生素的使用剂量。这将减少抗生素在临床中的应用,进而避免或减少耐药菌的形成,维护人与动物的健康,保护生态环境。

多肽类抗生素检测方法与标准物质的研究进展

多肽类抗生素不规范使用可引起细菌耐药性,影响畜禽养殖发展及公共卫生安全。为提升多肽类抗生素的检出效率,前期工作已开发出多种检测方法。但由于多肽类抗生素标准物质的缺乏,导致不同测量方法结果的一致性难以保证。文章讨论了多肽类抗生素检测方法的特性和应用研究进展,并分析了多肽类抗生素标准物质研制的必要性,以期进一步提升多肽类抗生素的检测能力。