丙泊酚对高糖诱导的人肾小球系膜细胞氧化应激和炎症反应的影响

目的探讨丙泊酚对高糖诱导的人肾小球系膜细胞损伤的影响。方法该研究于2021年3月至2022年3月进行。体外培养人肾小球系膜细胞,采用30 mol/L葡萄糖诱导建立人肾小球系膜细胞细胞损伤模型,用丙泊酚浓度10、20、40μmol/L处理细胞,细胞分为对照组、高糖组、高糖+低、中、高剂量丙泊酚组。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛、活性氧、白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)IL-1β表达;蛋白质印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达。结果高糖组的丙二醛[(16.7±1.7)mmol/L比(3.8±0.4)mmol/L]、活性氧[(9.6±0.9)μg/L比(3.5±0.3)μg/L]、IL-10[(65.3±6.9)ng/L比(26.9±3.2)ng/L]、TNF-α[(105.6±10.9)ng/L比(42.8±4.8)ng/L]和IL-1β[(79.7±8.2)ng/L比(31.2±3.6)ng/L]明显高于对照组;iNOS、ICAM-1、MCP-1、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显高于对照组;SOD、GSH-Px明显低于对照组,均P<0.05。高糖+低剂量丙泊酚组、高糖+中剂量丙泊酚组、高糖+高剂量丙泊酚组的丙二醛、活性氧、IL-10、TNF-α和IL-1β明显低于高糖组;iNOS、ICAM-1、MCP-1、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显低于高糖组,均P<0.05;SOD、GSH-Px明显高于高糖组,均P<0.05。结论丙泊酚能减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞氧化应激和炎症反应,发挥保护肾脏的作用。

miR-15b-5p靶向FOXO1对缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤的调控作用及其机制

目的探讨miR-15b-5p靶向叉头框蛋白O1(FOXO1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的调控作用及其机制。方法取对数生长期HK-2细胞,设置:(1)对照组(正常培养)与H/R组(H/R诱导培养)。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测mi-15b-5p、FOXO1 mRNA的表达,Western blotting检测FOXO1蛋白的表达。(2)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+mimic对照组(转染mimic对照质粒后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-NC组(共转染mi R-15b-5p mimic和OE-NC质粒后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和FOXO1过表达质粒后H/R诱导培养)。采用qRT-PCR检测mi-15b-5p的表达,Western blotting检测FOXO1、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL染色检测细胞凋亡情况。(3)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-FOXO1后H/R诱导培养)。采用Western blotting检测LC3、p62、Beclin-1蛋白的表达,LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。双荧光素酶报告实验检测miR-15b-5p与FOXO1之间的靶向关系。结果倒置显微镜下观察显示,对照组细胞数量较多,细胞大多呈典型鹅卵石形态,铺路石状生长;H/R组大部分细胞收缩变圆,贴壁细胞数量明显减少。与对照组比较,H/R组miR-15b-5p表达水平明显降低,FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。荧光素酶报告实验结果显示miR-15b-5p直接靶向作用于FOXO1的3'-UTR。miR-15b-5p过表达抑制H/R诱导的HK-2细胞活力,降低细胞凋亡,抑制细胞自噬(P<0.05)。与H/R+miR-15b-5p mimic组相比,H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组HK-2细胞存活率降低,细胞凋亡和自噬水平增高(P<0.05)。结论miR-15b-5p通过靶向抑制FOXO1降低细胞自噬减缓H/R诱导的HK-2细胞损伤。

山松醇同源物1在缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制研究

目的探究山松醇同源物1(pumilio homolog 1,PUM1)在缺氧/复氧(hypoxia/reoxy-genatio,H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)损伤中的作用及机制。方法体外建立HK-2细胞的H/R模型;通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低HK-2细胞的PUM1表达;细胞等量随机法分为对照(Control)组、H/R组、H/R+siRNA组。蛋白质印迹法用以检测PUM1蛋白表达水平;细胞计数试剂盒8用以检测细胞活力;过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)评估氧化应激水平;流式细胞术用以检测细胞凋亡水平。结果与Control组相比,H/R 3 h组(1.76±0.11比0.98±0.05)、H/R 6 h组(2.89±0.14比0.98±0.05)、H/R 12 h组(3.78±0.08比0.98±0.05)PUM1的蛋白表达水平随着缺氧时间的延长逐渐增高(均P<0.05)。与H/R组相比,H/R+si-PUM1组敲低PUM1的表达能够显著改善H/R后HK-2细胞的细胞活力(73.67±3.42比29.60±2.94)、氧化应激[H_(2)O_(2):(13.53±0.85)μmol/L比(22.43±1.12)μmol/L、MDA:(16.03±0.70)μmol/L比(31.20±1.50)μmol/L、SOD:(34670±1800)U/L比(5730±1220)U/L]及凋亡水平[(14.89±1.65)%比(39.71±1.94)%](均P<0.05)。结论PUM1在H/R诱导的HK-2细胞中上调,抑制PUM1的表达可以减少氧化应激及细胞凋亡水平,从而减轻H/R损伤。

敲低RIP3对缺氧/复氧诱导人肾小管上皮HK2细胞自噬、细胞焦亡和铁死亡的影响

目的:探讨敲低受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)对缺氧复氧(H/R)诱导下人肾小管上皮HK2细胞自噬、焦亡和铁死亡的影响。方法:将慢病毒干扰载体质粒shRIP3和阴性对照慢病毒干扰载体质粒shNC分别转染至HK2细胞中,分为shRIP3组和shNC组,另以正常培养未转染的HK2细胞作为空白组,转染48 h后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法验证慢病毒转染效果。将HK2细胞分为对照组、H/R组、shNC+H/R组和shRIP3+H/R组。CCK-8法检测各组HK2细胞存活率,免疫荧光染色法检测各组细胞中微管结合蛋白1轻链(LC)3B和含核苷酸结合结构域富亮氨酸重复序列(NLR)家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)蛋白荧光强度,Western blotting法检测各组HK2细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1、膜穿孔蛋白D(GSDMD)、白细胞介素(IL)-1β和IL^(-1)8蛋白表达水平,试剂盒检测各组细胞中铁离子(Fe^(2+))水平。结果:与空白组和shNC组比较,shRIP3组HK2细胞中RIP3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。CCK-8法检测,与对照组比较,H/R组HK2细胞存活率明显降低(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞存活率明显升高(P<0.05)。免疫荧光染色法检测,与对照组比较,H/R组HK2细胞中LC3B蛋白荧光强度明显降低(P<0.05),NLRP3蛋白荧光强度明显升高(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中LC3B蛋白荧光强度明显升高(P<0.05),NLRP3蛋白荧光强度明显降低(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,H/R组HK2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与对照组比较,H/R组HK2细胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL^(-1)8蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL^(-1)8蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与对照组比较,H/R组HK2细胞中GPX4和SLC7A11蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中GPX4和SLC7A11蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与对照组比较,H/R组HK2中细胞Fe^(2+)水平明显升高(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中Fe^(2+)水平明显降低(P<0.05)。结论:靶向敲低RIP3可诱导H/R诱导人肾小管上皮HK2细胞自噬,抑制细胞焦亡和减轻铁死亡。

雷公藤多苷调控miR-496表达对高糖诱导的人肾足细胞泛素化通路的影响

目的探究雷公藤多苷调控miR-496表达对高糖诱导的人肾足细胞泛素化通路的影响。方法将人肾足细胞分为NC组、HG组、TWP-L组、TWP-M组、TWP-H组、miR-496组、miR-NC组、TWP-H+anti-miR-496组。CCK-8检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白质印迹检测细胞中p53、COP1、caspase-3、nephrin、podocin蛋白表达;qRT-PCR检测细胞中miR-496表达。结果与NC组比较,HG组细胞存活率、细胞中miR-496表达(0.23±0.04)和COP1(0.43±0.05)、nephrin(0.24±0.03)、podocin(0.31±0.04)蛋白表达均明显降低,细胞凋亡率(23.94±2.46)、细胞中p53(1.26±0.15)、caspase-3(0.61±0.08)蛋白表达均明显增加(P<0.05);与HG组比较,TWP-L组、TWP-M组、TWP-H组细胞存活率、细胞中miR-496表达和COP1、neph-rin、podocin蛋白表达均明显增加,细胞凋亡率、细胞中p53、caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05);与miR-NC组相比,miR-496组细胞存活率、细胞中miR-496表达(0.87±0.10)和COP1(0.80±0.09)、nephrin(0.58±0.06)、podocin(0.75±0.08)蛋白表达明显增加,细胞凋亡率(10.61±1.17)、细胞中p53(0.32±0.04)、caspase-3(0.25±0.03)蛋白表达明显降低(P<0.05);与TWP-H组相比,TWP-H+ant-miR-496组细胞存活率、细胞中miR-496表达(0.18±0.02)和COP1(0.46±0.06)、nephrin(0.31±0.04)、podocin(0.34±0.04)蛋白表达明显降低,细胞凋亡率(20.36±2.18)、细胞中p53(1.19±0.13)、caspase-3(0.57±0.06)蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论雷公藤多苷可能通过促进miR-496表达,对高糖诱导的人足细胞泛素化蛋白酶通路的活化发挥促进作用,对足细胞的凋亡发挥抑制作用。

远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用

目的:研究远隔缺血预处理(RIPC)分离液对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及机制。方法:将HK-2细胞分为时间对照组、H/R、RIPC处理组、自噬干预组。时间对照组细胞在正常条件下培养,RIPC组细胞使用RIPC分离液预处理,自噬干预组细胞在RIPC处理基础上,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA),后三组细胞使用三气培养箱进行H/R构建损伤模型。模型成功后使用光学显微镜观察各组细胞状态,应用Western blot观察LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白的表达水平。结果:镜下示RIPC分离液可明显减轻H/R对HK-2细胞的损伤,加入自噬抑制剂,RIPC分离液对HK-2细胞H/R损伤的保护作用被阻断。Western blot结果显示,RIPC分离液可使HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达水平增高。Real-time PCR结果显示,与H/R组比,RIPC组LC3及Beclin1的mRNA表达量明显升高;加入自噬抑制剂,HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达降低,LC3及Beclin1的mRNA表达量同时也明显降低。结论:RIPC分离液对HK-2细胞H/R后损伤具有保护作用,作用机制可能与线粒体自噬相关。

二甲双胍通过抑制NF-κB/NLRP3通路改善草酸钙诱导人肾小管上皮细胞损伤研究

目的研究二甲双胍(metformin,Met)通过抑制NF-κBNLRP3通路改善草酸钙(Calcium Oxalate,CaOx)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤。方法分别随机将人肾小管上皮细胞分成对照组、实验组(CaOx+HK-2)、高浓度Met组(CaOx+HK-2+1.2 mM Met)、低浓度Met组(CaOx+HK-2+0.80 mM Met)、通路干预组(CaOx+HK-2+PDTC)五组。各组细胞培养24 h,采用酶联免疫吸附测定(Elisa)法检测细胞上清液中炎症因子(IL-6、IL-18、IL-1β),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞中NF-κB、NLRP3、骨桥蛋白(OPN)mRNA。结果各组间细胞上清液IL-6、IL-18、IL-1β含量相比差异均有统计学意义(P均<0.05);各组间细胞中NF-κBmRNA表达量、NLRP3mRNA表达量、OPNmRNA表达量相比差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论1.20 mmol/L或0.80 mmol/L Met可以通过抑制NF-κB/NLRP3通路调控下游的炎症相关蛋白及黏附蛋白表达,继而改善CaOx诱导人肾小管上皮细胞损伤及减少草酸钙肾结石形成。

螺内酯抑制VEGF对高糖及醛固酮诱导的人肾足细胞损伤的保护作用机制

目的研究螺内酯(SPI)对高糖和醛固酮(ALD)对足细胞增殖、凋亡和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨SPI的肾脏保护机制。方法使用高糖和不同浓度醛固酮处理人肾足细胞,并在此基础上加用SPI干预,分为正常葡萄糖浓度5.6 mmol/L对照组(NG组),高糖组(HG组,30 mmol/L),ALD处理组(高糖+10-11 mol/L、10-9 mol/L、10-7 mol/L ALD),ALD+SPI干预组(高糖+10-7 mol/LALD+10-7 mol/L SPI)CCK-8和流式细胞术检测足细胞的增殖和凋亡,qPCR和Western blot检测VEGF的表达。结果与NG组比较,HG组显著抑制足细胞增殖并增加其凋亡(P<0.05)。不同浓度的ALD对足细胞的增殖有抑制作用,且浓度越高,抑制作用越明显(P<0.05)。高糖和ALD显著促进足细胞VEGF的mRNA和蛋白表达(P<0.05);SPI干预显著削弱了醛固酮对足细胞增殖和凋亡的作用,并逆转高糖和ALD对VEGF表达的促进作用(P<0.05)。结论SPI可能通过抑制VEGF的表达来逆转高糖和ALD对足细胞增殖的抑制和凋亡的促进作用,从而对肾脏产生保护作用。

微小RNA-22-3p抑制人肾小管上皮细胞NLRP3活化

目的:探讨微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对人肾小管上皮细胞NLRP3活化的影响。方法:将包含NLRP3基因3’-非编码区(3’-UTR)序列的野生型及突变型双荧光素酶报告基因质粒(psiCHECK2)分别与miR-22-3p mimic(模拟物)、miR-22-3p inhibitor(抑制物)共转染人肾小管上皮细胞株(HK-2),检测细胞荧光素酶活性;HK-2细胞随机分组如下:(1)正常对照组;(2)miR-22-3p mimic+LPS+ATP组;(3)miR-22-3p control+LPS+ATP组;(4)miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组;(5)miR-22-3p mimic+LPS组;(6)miR-22-3p control+LPS组;(7)miR-22-3p inhibitor+LPS组,采用定量PCR(RT-PCR)、免疫印迹(WB)分别检测NLRP3 mRNA和蛋白的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测白介素-1β(IL-1β)水平及半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)活性。结果:NLRP3-3’UTR野生型分别与miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor共转染HK-2细胞后,与对照组比较,荧光素酶活性分别出现降低与升高(P<0.05)。此外,与miR-22-3p control+LPS组比较,miR-22-3p mimic+LPS组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均下降(P<0.05),miR-22-3p inhibitor+LPS组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均升高(P<0.05);与miR-22-3p control+LPS+ATP组比较,miR-22-3p mimic+LPS+ATP组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均下降(P<0.05),miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组NLRP3 mRNA和蛋白表达、IL-1β水平及Caspase-1活性均升高(P<0.05)。结论:miR-22-3p可抑制人肾小管上皮细胞NLRP3活化。

微小RNA-138/NGAL对缺血再灌注诱导人肾小管上皮细胞的影响

目的探究微小RNA-138(microRNA-138,miR-138)调控中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)对缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导人肾小管上皮(HK-2)细胞损伤的影响。方法HK-2细胞构建I/R模型,分别转染miR-138模拟物、miR-138抑制剂、NGAL、NGAL+miR-138模拟质粒,qRT-PCR测定不同细胞miR-138或NGAL mRNA表达鉴定转染结果,细胞活力检测(cell counting kit-8,CCK-8)法和流式细胞术测定细胞活性和凋亡。ELISA、Western blot法分别测定miR-138模拟物、miR-138抑制剂对I/R细胞白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,以及Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor-NF-κB,IκBα)、磷酸IκBα(p-IκBα)、NGAL蛋白表达的影响。结果I/R细胞miR-138 mRNA表达、细胞活力降低,凋亡增加(P<0.01)。质粒转染成功,miR-138模拟物促进IR细胞活力,降低凋亡和NGAL mRNA表达(P<0.01);miR-138抑制剂、NGAL模拟降低IR细胞活力,增加凋亡和NGAL mRNA表达(P<0.01);NGAL模拟对IR细胞的损伤作用可被miR-138模拟逆转。miR-138抑制剂可增加I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡,上调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达,下调IκBα蛋白表达(P<0.05);miR-138模拟物可降低I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡,下调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达,上调IκBα蛋白表达(P<0.05)。结论miR-138通过调节NGAL和TLR4/NF-κB途径降低细胞凋亡和炎症因子水平,对I/R诱导的HK-2细胞发挥保护作用。

复方积雪草对人肾系膜细胞清道夫受体表达的影响

目的:探讨复方积雪草对人肾小球系膜细胞(HMC)表达清道夫受体(SR)水平的影响。方法:应用流式细胞仪和逆转录—聚合酶链反应(RT -PCR)检测体外培养人肾系膜细胞在佛波酯(PMA)刺激后复方积雪草对HMCSR的mRNA的表达。结果:体外培养的人肾系膜细胞在PMA刺激下能大量表达SR及其mRNA ,且随着剂量的增加而增强,其基因序列测定结果与巨噬细胞所表达的SR完全相同。复方积雪草能抑制PMA诱导的人肾小球系膜细胞SR表达,且随着浓度和时间的增加而增强。结论:人肾系膜细胞具有表达SR的潜力,复方积雪草能明显抑制人肾系膜细胞SR在PMA诱导下的表达,这可能是其发挥治疗作用的机理之一。

大黄酸对人肾小球系膜细胞功能的影响

目的 探讨大黄酸防治糖尿病肾病的作用机制。方法 用细胞培养、ELISA、明胶酶谱及免疫沉淀、Westernblot等技术 ,研究了大黄酸对肾小球系膜细胞转化生长因子 (TGFβ1 )、基质金属蛋白酶 2 , 9(MMP 2和MMP 9)及p38活化丝裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK)活性的作用。结果 大黄酸可显著抑制肾小球系膜细胞的增殖 ,对抗高糖诱导肾小球系膜细胞TGFβ1 活性升高的作用 ;对高糖诱导肾小球系膜细胞MMP 2 ,MMP 9,pro MMP 2及pro MMP 9的活性增加无明显影响 ,但可明显对抗高糖引起的肾小球系膜细胞p38MAPK活性增加。结论 大黄酸减少FN的分泌可能与其降低p38MAPK及TGFβ1 活性有关。

高糖通过SGK_1通路促进人肾小球系膜细胞合成结缔组织生长因子

目的研究血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)在高糖诱导人肾小球系膜细胞(HMC)产生结缔组织生长因子(CTGF)中的作用,探讨SGK1在糖尿病肾病(DN)肾小球硬化中的作用机制。方法HMC分为低糖组(5·5mmol·L-1D-葡萄糖)、高糖组(25mmol·L-1D-葡萄糖)和甘露醇对照组(19·5mmol·L-1甘露醇和5·5mmol·L-1D-葡萄糖),刺激24、72h后,采用RT-PCR方法和West-ernblot方法检测CTGFmRNA及蛋白的表达;将带有SGK1显性激活型突变体质粒(pIRES2-EGFP-S422DhSGK1,SD)和带有SGK1显性失活型突变体质粒(pIRES2-EGFP-K127NhSGK1,KN)分别瞬时转染HMC;同时,设空质粒(PIRES2-EGFP,FP)转染组和未转染组(NT)为对照。分别用低糖(LG,5·5mmol·L-1D-葡萄糖)和高糖(HG,25mmol·L-1D-葡萄糖)刺激24、72h后,采用RT-PCR方法和Western blot方法检测CT-GF的mRNA及蛋白的表达。结果与低糖组和甘露醇组相比较,在高糖刺激下,HMC中CTGF mRNA及蛋白的表达明显上调;低糖环境下,转染SD的HMC与转染FP、NT组比较,其CTGFmRNA和蛋白的表达明显增加。转染KN的HMC与转染FP、NT组比较,其CTGF mRNA和蛋白的表达差异无显著性;高糖环境下转染SD的HMC与转染KN、转染FP、NT组比较,其CTGF mRNA和蛋白的表达明显增加。转染KN的HMC与转染FP、NT组比较,其CTGF mRNA和蛋白的表达明显减少。结论在DN中,高糖能促进HMC的CTGF mRNA及蛋白的表达,并且可以通过SGK1介导的信号通路来诱导人肾小球系膜细胞增加合成CTGF,这种新发现的信号通路,表明SGK1可能通过促进CTGF的合成来参与糖尿病肾病肾小球纤维化的发生。

地龙成分对高糖刺激下人肾小球系膜细胞转化生长因子β_1和结缔组织生长因子表达的研究

目的:研究地龙成分含药血清对高糖刺激下人肾小球系膜细胞(HMC)增殖、分泌转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的影响,并探讨其对糖尿病肾脏疾病的可能防治机制。方法:以HMC为研究对象,将培养的HMC分为空白对照组、高糖刺激组、地龙成分低、中、高剂量组和福辛普利组,用家兔的含药血清给药,分别给予相应处理24h、48 h和72 h后,采用4-甲偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,48 h的上清液采用ELISA法检测TGF-β1和CTGF的表达。结果:在同一时间点内,地龙低、中、高剂量组对HMC增殖的抑制作用不断增加,福辛普利组对HMC增殖的抑制作用和地龙中剂量组相当,在24 h、48 h和72 h内,各药物干预组对HMC增殖的抑制作用也不断增大,以地龙高剂量组最佳;与空白对照组比较,高糖刺激组上清液中TGF-β1和CTGF的含量明显增多;与高糖刺激组比较,地龙成分低、中、高剂量组随着药物浓度的增加,TGF-β1和CTGF的含量减少,福辛普利组上清液中TGF-β1和CTGF的含量与地龙成分中剂量组相当,但高于高剂量组,都具有统计学意义。结论:地龙成分对HMC增殖的抑制作用在一定范围内呈浓度、时间依赖关系,能够降低TGF-β1和CTGF的含量,以高剂量组最佳,优于福辛普利组,提示地龙成分可能通过抑制HMC的异常增殖和下调TGF-β1和CTGF的表达而发挥对糖尿病肾病的保护作用。

TGF-β_1激活smad信号通路影响人肾小管上皮细胞增殖与凋亡

目的观察TGF-β1通过smad信号通路影响人肾小管上皮细胞凋亡与细胞增殖的变化。方法以人肾小管上皮细胞为对象,应用TGF-β1刺激,通过Western blot及RT-PCR的方法来观察p-smad2/3蛋白和smad2/3蛋白及其mRNA的表达。同时通过流式细胞学观察细胞凋亡与周期的变化。MTT法检测细胞增殖水平。结果人肾小管上皮细胞在TGF-β1刺激后,较对照组、p-smad2/3蛋白和smad2/3蛋白及其mRNA的表达有着显著的升高。细胞凋亡百分率同时明显升高,细胞周期G0/G1比例显著升高,S期、G2/M期比例显著降低。细胞增殖水平明显受到抑制。结论人肾小管上皮细胞smad信号通路能够被TGF-β1特异性的激活,并且介导细胞的凋亡,抑制细胞增殖。

高糖对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的影响

目的观察不同浓度的葡萄糖对人肾小球系膜细胞增殖的影响及对细胞外基质纤维连接蛋白(Fn),Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响。方法体外培养人肾小球系膜细胞株,分别加入葡萄糖终浓度为5.5、10、20、30、40 mmol/L进行处理,于不同时间段(12、24、48、72 h)用MTT法检测肾小球系膜细胞的增殖情况,ELISA法检测培养48 h后条件培养基中Fn及ColⅣ的含量。结果高糖作用12、24、48、72 h均能促进细胞的增殖,且随着葡萄糖浓度升高作用时间的延长促进作用增强。检测细胞上清液的Fn和ColⅣ。与对照组相比,30 mmol/L D-葡萄糖作用48 h后,Fn和ColⅣ表达增高。结论高浓度葡萄糖对系膜细胞增殖作用具有量效及时效关系,我们选择30 mmol/L浓度的葡萄糖作用48 h为最合适的细胞刺激条件。高浓度葡萄糖可促进系膜细胞细胞外基质的产生,而系膜细胞细胞外基质过度表达,可以直接导致细胞外基质的积聚,从而导致肾小球硬化的发生。

贫铀对人肾小管上皮细胞的毒性作用

目的 阐明贫铀 (depleteduranium ,DU)对人肾小管上皮细胞 (humankidneycell,HKC)的急性毒性作用及损伤部位 ,为救治提供依据。方法 将 0 0 63～ 0 5 0 0mg ml的DU溶液作用于HKC ,研究细胞超微结构、存活率的变化 ,多种酶含量的改变及HGPRT基因突变的频率。结果 0 0 63～ 0 5 0 0mg ml浓度的DU可引起HKC细胞结构改变 ,存活率显著下降 ;溶酶体酶NAG含量随DU浓度的增加而增加 ;其他酶含量也发生变化 ;HGPRT基因突变的发生率显著高于正常对照组 ,并呈二项式相关关系。加入苯乙酸、亚硒酸钠使上述指标变化不大。结论 DU可引起细胞活力降低 ,损伤细胞膜、线粒体、溶酶体等 ,使细胞抗氧化能力下降 ;HGPRT基因突变率与DU浓度之间呈相关关系 ;加入恶性转化的抑制剂亚硒酸钠和苯乙酸 。

鳖甲煎丸对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响

目的:探讨鳖甲煎丸对人肾小球系膜细胞(HMC)增殖及细胞外基质(ECM)不同成分的抑制作用。方法:应用细胞培养技术,进行人HMC培养,采取血清药理学方法,制备鳖甲煎丸药物血清,利用脂多糖(LPS)为刺激因子,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组系膜细胞的增殖情况,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测ECM中层黏连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的含量。结果:LPS刺激后MC增殖和系膜基质中LN及Col-Ⅳ的分泌增多,与空白组比较有明显差异(P<0.01)。鳖甲煎丸能抑制正常条件及LPS刺激条件下MC增殖,并对ECM中LN、Col-Ⅳ的表达有抑制作用。结论:鳖甲煎丸能够抑制系膜细胞的增殖,抑制肾小球系膜基质中LN及Col-Ⅳ的表达,减少ECM的积聚,这可能是其防治肾小球疾病,延缓肾小球硬化的部分作用机制。

靶向抑制人SREBP-1基因对高糖刺激下人肾小管上皮细胞脂滴形成的影响

目的构建人SREBP-1基因的shRNA载体并转染人肾小管上皮细胞(HKC)明确是否沉默SREBP-1基因的表达可减轻高糖环境引起的细胞内脂滴形成。方法设计两对针对人SREBP-1基因的干扰靶序列及短链寡核苷酸和线性化的pGenesil-1质粒进行连接,筛选鉴定并最终命名为pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2。体外培养人肾小管上皮细胞并随机分组,采用阳离子脂质体法转染细胞后给予高糖刺激48h,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,半定量RT-PCR和Westernblot分析目标基因表达丰度的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果经酶切及测序鉴定证明构建的重组载体pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2序列正确;转染HKC细胞后均可表达绿色荧光;RT-PCR和Westernblot显示pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2能够有效抑制高糖环境下HKC细胞SREBP-1的表达,与阴性质粒对照组相比,差异有统计学意义。进一步研究发现在HKC细胞内,SREBP-1基因表达沉默明显抑制了脂肪酸合成酶(FAS)的转录,细胞内脂滴明显减少。结论有效沉默高糖刺激下HKC细胞SREBP-1的基因表达可通过抑制FAS转录而减少细胞内脂滴形成。

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧产生的影响

目的 :探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧产生的影响以及茶多酚对其的干预作用。方法 :应用比色法检测高糖作用后培养系膜细胞上清液中超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH PX)的活力和丙二醛 (MDA)、超氧阴离子自由基 (O2-· )的水平 ,以及加入茶多酚后各指标的改变。结果 :高糖可降低系膜细胞培养上清液中SOD、GSH PX的活力 ,增加MDA和O2 -· 的含量 ;茶多酚可提高上清液中SOD和GSH PX的活力 ,降低MDA和O2 -· 的含量。结论 :高糖可导致人肾小球系膜细胞活性氧产生增多 。