β_(2)-肾上腺素能受体通过β-抑制蛋白/细胞外调节蛋白激酶通路在病毒性心肌炎中的机制研究

目的:探究β_(2)-肾上腺素能受体(β_(2)-AR)通过β-抑制蛋白(β-arrestin)/细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路在病毒性心肌炎(VMC)小鼠心肌损伤中的可能作用机制。方法:将40只小鼠随机分为:对照组、VMC组、抑制β_(2)-AR组及抑制β-arrestin组,每组10只。超声心动图检测小鼠Tie指数、射血分数(EF)及左室短轴缩短率(FS)。HE染色检测心肌组织病理结构;Tunel试剂盒检测心肌凋亡水平;免疫荧光染色检测心肌组织β_(2)-AR、β-arrestin、ERK1/2蛋白水平;ELISA试剂盒检测血清肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)含量。结果:与对照组比较,VMC组小鼠Tie指数增加,EF、FS减少(均P<0.05),小鼠心肌组织结构疏松紊乱、炎性细胞大量浸润,心肌细胞凋亡增加,心肌组织β_(2)-AR、β-arrestin及ERK1/2表达增加,血清CK与AST含量增加(均P<0.05);与VMC组比较,抑制β_(2)-AR组小鼠Tie指数减少,EF、FS增加(均P<0.05),小鼠心肌组织损伤改善,心肌细胞凋亡减少,心肌组织β_(2)-AR、β-arrestin及ERK1/2表达减少。与VMC组比较,抑制β-arrestin组小鼠心肌组织β-arrestin及ERK1/2表达减少,血清CK与AST含量减少(均P<0.05)。结论:抑制β_(2)-AR可通过下调β-arrestin/ERK1/2通路改善VMC小鼠心功能异常及心肌损伤。

敲低RIP3对缺氧/复氧诱导人肾小管上皮HK2细胞自噬、细胞焦亡和铁死亡的影响

目的:探讨敲低受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)对缺氧复氧(H/R)诱导下人肾小管上皮HK2细胞自噬、焦亡和铁死亡的影响。方法:将慢病毒干扰载体质粒shRIP3和阴性对照慢病毒干扰载体质粒shNC分别转染至HK2细胞中,分为shRIP3组和shNC组,另以正常培养未转染的HK2细胞作为空白组,转染48 h后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法验证慢病毒转染效果。将HK2细胞分为对照组、H/R组、shNC+H/R组和shRIP3+H/R组。CCK-8法检测各组HK2细胞存活率,免疫荧光染色法检测各组细胞中微管结合蛋白1轻链(LC)3B和含核苷酸结合结构域富亮氨酸重复序列(NLR)家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)蛋白荧光强度,Western blotting法检测各组HK2细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1、膜穿孔蛋白D(GSDMD)、白细胞介素(IL)-1β和IL^(-1)8蛋白表达水平,试剂盒检测各组细胞中铁离子(Fe^(2+))水平。结果:与空白组和shNC组比较,shRIP3组HK2细胞中RIP3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。CCK-8法检测,与对照组比较,H/R组HK2细胞存活率明显降低(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞存活率明显升高(P<0.05)。免疫荧光染色法检测,与对照组比较,H/R组HK2细胞中LC3B蛋白荧光强度明显降低(P<0.05),NLRP3蛋白荧光强度明显升高(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中LC3B蛋白荧光强度明显升高(P<0.05),NLRP3蛋白荧光强度明显降低(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,H/R组HK2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与对照组比较,H/R组HK2细胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL^(-1)8蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL^(-1)8蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与对照组比较,H/R组HK2细胞中GPX4和SLC7A11蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中GPX4和SLC7A11蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与对照组比较,H/R组HK2中细胞Fe^(2+)水平明显升高(P<0.05);与H/R组比较,shRIP3+H/R组HK2细胞中Fe^(2+)水平明显降低(P<0.05)。结论:靶向敲低RIP3可诱导H/R诱导人肾小管上皮HK2细胞自噬,抑制细胞焦亡和减轻铁死亡。

鮟鱇鱼皮活性肽的分离纯化及其对HK-2细胞损伤保护的作用

【目的】为探讨鮟鱇(Lophius litulon)鱼皮活性肽(Monkfish skin peptides,MSP)对棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤保护的作用。【方法】以新鲜鮟鱇鱼皮为材料,选取加酶量、提取时间、pH、温度和料液比为因子,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除率为响应值,分别进行单因素实验和响应面实验,优化鮟鱇鱼皮肽的提取工艺;对得到的鮟鱇鱼皮肽经过超滤、葡聚糖凝胶过滤层析和全自动高压制备分离纯化得到MSP;利用液相二级质谱和多肽从头(de novo)测序技术对其进行结构分析,筛选抗氧化活性较强的肽段;通过构建PA诱导的HK-2细胞损伤模型,测定MSP对HK-2细胞中氧化应激指标、脂质代谢指标和炎症因子水平的影响。【结果】确定酸性蛋白酶与胃蛋白酶质量比2∶1的复配比例,加酶量3 800 U/g、pH 3、酶解时间4 h、温度50℃和料液比1 g∶10 mL为鮟鱇鱼皮活性肽的最佳酶解条件,此条件下制备的鮟鱇鱼皮肽对DPPH·的清除率为78.84%;经超滤,酶解多肽中<3 ku组分抗氧化活性最强,收集该组分进行凝胶色谱分离后,得到F1、F2和F3共3个峰,其中F1组分DPPH·清除率最高。F1组分经高效液相色谱法(HPLC)分离纯化后得到6个吸收峰,其中H2组分吸收峰强度最高,经氨基酸序列鉴定,从中筛选出3种寡肽,分别为Phe-Glu-Ala-Thr-Ser-Gln-Glu-Leu(FEATSQEL,FL-8)、Leu-Val-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu(LVSCSSL,LL-7)和Pro-Leu-Glu-Asn-Tyr(PLENY,PY-5)。3条多肽在HK-2细胞脂质损伤模型中的修复作用各不相同:FL-8和PY-5能提高HK-2细胞模型的抗氧化能力,使细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC)显著升高,降低细胞中活性氧的荧光强度,并显著降低丙二醛(MDA)水平,而LL-7能降低GSH-Px活性与T-AOC能力,能显著降低MDA的含量;在调节细胞的脂质代谢方面,FL-8与PY-5分别在不同程度上降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白-胆固醇含量,并显著增加高密度脂蛋白-胆固醇含量,而LL-7则会加剧细胞内的脂质蓄积;FL-8与PY-5显著降低炎症因子白细胞介素-18(IL-18)的水平,而LL-7则相反(α=0.05)。【结论】制备的MSP对PA诱导的HK-2具有保护作用,可为鮟鱇鱼皮活性肽的利用和缓解脂质肾毒性产品的开发提供理论基础和实验依据。

PKM2通过调控活性氧依赖的PI3K/Akt信号通路影响膀胱尿路上皮细胞癌细胞的侵袭能力

目的 探讨PKM2通过调控活性氧(ROS)依赖的PI3K/Akt信号通路对膀胱尿路上皮细胞癌细胞侵袭能力的影响。方法 将人膀胱癌T24细胞随机分为Control组、si-NC组、si-PKM2组和si-PKM2+IGF-1组。实时PCR检测细胞中PKM2 mRNA表达;CCK-8检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞侵袭和转移;Hoechst 33342荧光染色和流式细胞术检测细胞凋亡;ROS荧光探针法检测细胞中ROS水平;Western blotting检测细胞中PI3K、Akt、mTOR、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 与人正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞相比,人膀胱癌T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量明显增加(P <0.05)。与Control组相比,si-PKM2组T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量、细胞增殖能力、侵袭细胞数以及细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P <0.05),细胞凋亡率、细胞中ROS相对水平以及细胞中Bax、caspase-3蛋白表达水平明显升高(P <0.05);与siPKM2组相比,si-PKM2+IGF-1组T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量、细胞增殖能力、侵袭细胞数以及细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P <0.05),细胞凋亡率、细胞中ROS相对水平以及细胞中Bax、caspase-3蛋白表达水平明显降低(P <0.05)。结论 敲减PKM2可促进膀胱尿路上皮细胞癌细胞中ROS水平升高,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活,进而发挥抑制细胞侵袭和促进细胞凋亡作用。

山奈酚对高糖诱导的人肾上皮细胞增殖与凋亡的影响

目的 探究山奈酚对高糖诱导人肾上皮细胞(Hkb20)增殖及凋亡的影响。方法 分组培养人肾上皮细胞分为正常糖浓度组(对照组)、高糖组、氯沙坦组(阳性对照)和不同浓度山奈酚组(10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L山奈酚与高糖共同作用)。采用CCK-8法和AV/PI法应用流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况,qRT-PCR检测TGF-β1和Smad3 mRNA水平的表达,Western blot法检测细胞因子TGF-β1和Smad3蛋白含量。结果 高糖能诱导人肾上皮细胞增殖降低,使细胞凋亡率升高,增加TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。不同浓度山奈酚处理后,山奈酚能显著增强细胞增殖和降低细胞凋亡率。同时TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平下降,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 山奈酚可逆转高糖诱导的人肾上皮细胞增殖降低和凋亡增加。这说明山奈酚可能是通过TGF-β1/Smad3信号通路抑制高糖环境下人肾上皮细胞的增殖降低和凋亡增加,从而最终导致肾脏纤维化。

肾上腺皮质系统在应激反应中对大鼠巨噬细胞释放H_2O_2功能的抑制作用

大鼠经20h电刺激应激反应后,腹腔巨噬细胞释放H_2O_2量明显减少(P<0.001),双侧肾上腺摘除术可以对抗应激对巨噬细胞释放H_2O_2功能的抑制作用(P<0.001),而单纯摘除大鼠双侧肾上腺对巨噬细胞无明显影响。将与肾上腺有关的激素与巨噬细胞体外孵育20h后发现,去甲肾上腺素和肾上腺素对巨噬细胞无明影响;氢化可的松可以明显促进巨噬细胞释放H_2O_2功能;促肾上腺皮质激素可以明显抑制巨噬细胞释放H_2O_2功能(P<0.01)。大鼠在应激反应后血浆皮质酮含量明显升高(P<0.05)进一步观察氢化可的松任体内对巨噬细胞功能的影响发现,皮下注射氢化可的松可以明显抑制巨噬细胞释放H_2O_2功能(P<0.01)。以上结果提示应激对巨噬细胞释放H_2O_2具有抑制作用,这种抑制作用的产生与垂体-肾上腺皮质系统的凋节作用有关。

ERK1/2介导去甲肾上腺素对内皮祖细胞的功能调节

目的探讨去甲肾上腺素(NE)对内皮祖细胞(EPCs)增殖和迁移能力的调节作用及其分子机制。方法将培养的健康成人外周血EPCs用不同浓度的NE、肾上腺素能受体拮抗剂或MAPK信号通道阻滞剂干预,检测EPCs的增殖和迁移能力,以及ERK1/2信号通路的激活情况。结果 NE浓度依赖性地(0.01、0.1、1、10μmol/L)促进EPCs增殖,与对照组比较EPCs分别增加(48.3±23.3)%、(70.5±35.6)%、(82.4±14.9)%和(100.3±48.1)%。α受体拮抗剂酚妥拉明、选择性β2肾上腺能受体拮抗剂I127、JNK抑制剂SP600125和ERK1/2抑制剂A6355能够阻断NE的促增殖作用;而β1受体拮抗剂美托洛尔和p38抑制剂PD169318不能阻断NE的刺激效应。10μmol/L NE促进EPCs的迁移(P<0.05),10μmol/L酚妥拉明和10μmol/L I127能够阻断这种作用,但美托洛尔不能。NE能够浓度依赖性(0.1、1、10μmol/L)地激活EPCs内的ERK1/2,酚妥拉明和I127能够阻断ERK1/2激活(P<0.05),而美托洛尔不能。结论 NE可能通过α和β2肾上腺能受体激活ERK1/2促进EPCs的迁移和增殖。

低表达ACOT4促进草酸钙对HK2细胞损伤和结晶形成

目的探讨酰基辅酶A硫代酯酶4(acyl-CoA thioeaterase 4,ACOT 4)的表达对草酸钙结石形成的影响。方法以人肾小管上皮细胞HK2细胞为研究对象,使用草酸钙处理HK2细胞,并使用siRNA干扰HK2细胞中ACOT4的表达。qPCR和Western blot法检测HK2细胞中基因的表达水平;CCK-8法检测细胞活率;流式细胞术检测细胞凋亡情况;LDH实验检测细胞损伤情况;晶体黏附实验检测HK2细胞对草酸钙结晶的黏附能力。结果草酸钙可以调节HK2细胞中ACOT4的表达;干扰ACOT4可以显著抑制HK2细胞的增殖能力,并且增强草酸钙对HK2细胞的活性降低、损伤和凋亡的影响;同时,干扰ACOT4可以显著促进HK2细胞对草酸钙晶体的黏附能力。结论敲低ACOT4可以促进草酸钙对HK2细胞的损伤并促进HK2细胞对草酸钙晶体的黏附能力。

锁阳多糖对H_2O_2诱导非洲绿猴肾上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的研究锁阳多糖对过氧化氢(H2O2)诱导非洲绿猴肾上皮(Verda Reno,简称VERO)细胞损伤的保护作用。方法建立H2O2致VERO细胞氧化损伤模型,MTT法检测细胞存活率;通过荧光光度法检测caspase-3活性;利用荧光探针DCFH-DA对荧光染色的胞内活性氧(ROS)检测其荧光强度;化学比色法测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,以及细胞培养液中丙二醛(MDA)水平。结果锁阳多糖能明显改善H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤,与模型组相比,锁阳多糖组可使细胞存活率升高,细胞内的ROS的积累量显著降低(P<0.01),caspase-3活性下降(P<0.05),同时细胞内的SOD和GSH-Px活性明显增加(P<0.01),细胞培养液中的MDA水平明显降低(P<0.01)。结论锁阳多糖能对H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤保护提示其具有潜在的防治肾脏相关疾病的作用。

GPR120激动剂通过β-Arrestin2途径改善高糖诱导的海绵体内皮细胞功能障碍

目的探讨激活G蛋白偶联受体(GPR)120对高糖诱导的人类阴茎海绵体内皮损伤修复的影响,以期为寻找糖尿病性勃起功能障碍(DMED)新的药物开发靶点提供理论依据。方法收集海绵体植入手术患者术中废弃海绵体组织提取海绵体内皮细胞进行原代培养,用高浓度葡萄糖诱导内皮细胞损伤,再以GPR120激动剂治疗,观察对比不同处理的细胞一氧化氮(NO)释放量、细胞迁移、血管生成等功能。结果成功提取人类海绵体内皮细胞进行原代培养并鉴定;发现GPR120在人类海绵体内皮细胞中稳定表达,且与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)存在共定位;与高糖损伤组相比,GPR120激动剂治疗组NO释放量、划痕愈合率和血管生成率均显著增加(P<0.05);沉默β-Arrestin2后GPR120激动剂失去原有的治疗效果。结论高糖培养可诱导海绵体内皮细胞功能障碍,GPR120激动剂能够治疗海绵体内皮功能障碍,沉默β-Arrestin2后GPR120激动剂无法改善内皮功能。

NE激活Nrf2/HO-1信号通路调节人子宫内膜上皮细胞的氧化应激

目的明确去甲肾上腺素(NE)是否能通过核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)调控培养的人子宫内膜上皮细胞(hEECs)的氧化应激状态。方法培养hEECs,通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测α和β肾上腺素能受体在hEECs的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验确定NE处理对细胞活性的影响,根据结果将细胞分为处理组和对照组,选择合适浓度进行处理;通过Western blot实验,检测闭锁蛋白(Occludin),闭锁小带蛋白-1(ZO-1),凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),抗氧化应激蛋白Nrf2、HO-1的表达,流式细胞术检测NE处理后细胞凋亡的情况;酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA)检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平。结果在hEECs上检测到α1 a、α1 b、α2 a、α2 b、α2 c、β1、β3肾上腺素能受体的表达。NE处理后,在低浓度(5、10μmol/L)不明显影响细胞活力,而15、20μmol/L NE处理细胞6 h或24 h均明显增加细胞活性。紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在15μmol/L 24 h处理组显著升高。ZO-1在6 h处理组下降,15μmol/L处理显著下降,同时Occludin在6 h处理组升高。NE处理后与对照相比,细胞凋亡率升高,15μmol/L NE处理细胞6 h凋亡率显著升高,处理24 h后细胞凋亡率有所下降,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax>1。NE处理后,上调Nrf2及HO-1,细胞培养基上清液中的MDA水平没有明显升高,同时SOD水平明显上调。结论NE处理细胞后可通过激活Nrf2/HO-1信号,上调SOD,发挥抗氧化应激、抗凋亡的作用。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白对缺氧/复氧肾小管上皮HK-2细胞自噬作用的影响

目的观察中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)对缺氧/复氧肾小管上皮细胞HK-2自噬水平的影响,探讨NGAL在肾小管上皮细胞缺氧/复氧过程中发挥的作用。方法构建高表达NGAL的载体pcDNA3.1(-)/myc-His B-NGAL,并转染HK-2细胞。将HK-2细胞分为未转染组和转染组,每组再分为缺氧/复氧处理组和未处理组。用western blot法检测转染后NGAL蛋白表达水平和缺氧/复氧后细胞自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)表达水平,并用CellTiter-Blue细胞活性检测系统检测细胞活力。结果成功构建高表达NGAL的载体pcDNA3.1(-)/myc-His B-NGAL,转染HK-2细胞后,细胞NGAL蛋白表达水平高于未转染组(t=8.959,P<0.05)。缺氧1 h/复氧24 h后,转染组细胞LC3-Ⅱ表达水平高于未转染组(t=21.721,P<0.05),而细胞活力低于未转染组(t=-6.238,P<0.05)。结论在HK-2细胞缺氧/复氧状态下,NGAL能增强细胞自噬水平,导致细胞损伤加重甚至死亡。

β2肾上腺素受体基因、α上皮细胞钠通道基因和G蛋白β3亚基基因联合变异与维吾尔族人群高血压的关系

目的:探索β2肾上腺素受体(ADRB2)基因G1023A,α上皮细胞钠通道(ENaC)基因G2139A和G蛋白β3亚基(GNB3)基因C825T多态性与新疆维吾尔族人群原发性高血压的关系。方法:采用人群为基础的病例对照研究,高血压组269例,正常血压组229例。用聚合酶链反应一限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)的方法检测ADRB2基因G1023A基因型、ENaC基因G2139A基因型和GNB3基因C825T基因型,分析其与与维尔族人群高血压的关系。结果:高血压组和正常血压组的ADRB2基因型分布分别为GG:0.202、0.147;AG:0.266、0.339;AA:0.532、0.513,差异无统计学意义(P=0.119)。高血压组和血压正常组的ENaC基因型分布分别为GG:0.249、0.266;AG:0.472、0.476;AA:0.281、0.260,差异无统计学意义(P=0.840);高血压组和血压正常组的GNB3基因型分布分别为CC:0.346、0.293;CT:0.394、0.437;TT:0.260、0.271,差异无统计学意义(P=0.418)。用Logistic回归模型校正年龄、性别、吸烟、体重指数、腰围、臀围、血糖、甘油三酯、总胆固醇及胆红素之后,亦未发现三个位点与原发性高血压有关。进一步分析未发现三个位点对维吾尔族高血压的发病有交互作用(P=0.080)。结论:在新疆维吾尔人群中,未发现ADRB2基因G1023A、ENaC基因和GNB3基因多态性单独或联合作用在高血压发病中起作用。

3-氯-1,2-丙二醇通过线粒体途径诱导HK2细胞凋亡

[目的]探究食品污染物3-氯-1,2-丙二醇(3-monochloropropane-1,2-diol,3-MCPD)对人肾小管上皮细胞系(HK2)的毒性作用及机制。[方法]通过MTT法、Hoechst 33342染色法、试剂盒及Western blot检测了细胞存活率、形态、线粒体功能、酶活性及凋亡相关蛋白的表达。[结果]浓度低于80 mmol/L的3-MCPD处理24 h后,细胞存活率呈浓度依赖性降低。20,30 mmol/L的3-MCPD处理不同时间后,细胞存活率呈时间依赖性降低。20,40,60 mmol/L的3-MCPD引起LDH的释放率增加,线粒体膜电位和ATP水平降低,荧光显微镜观察可见高强度的蓝色荧光,核皱缩,凋亡小体等细胞凋亡现象。同时,3-MCPD处理能降低抗凋亡蛋白Bcl2的表达,增加促凋亡蛋白Bax的表达,提高Caspase 9和Caspase 3的酶活性,且呈浓度依赖性。[结论]3-MCPD对HK2细胞具有毒性作用,并通过线粒体途径诱导其凋亡。

辣椒素与槲皮苷通过EGFR/PI3K/Akt信号通路调节HepG2细胞脂质代谢作用机制

为探究辣椒素与槲皮苷协同调节肝脏脂质代谢的分子机制,本实验利用油酸诱导的HepG2高脂细胞模型,研究辣椒素单独处理及辣椒素与槲皮苷联合处理对HepG2细胞存活率的影响,采用油红O染色法观察HepG2细胞脂质积累情况,同时测定细胞内总甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总胆汁酸的含量水平,采用免疫印迹法测定表面生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及法尼醇X受体1(farnesoid X receptor 1,FXR1)、胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)、成纤维细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19)的表达量。结果显示,各处理组HepG2细胞的增殖率均大于75%,表明药物对细胞没有明显毒性,可进行后续实验。油红O染色结果表明,加药处理组细胞内脂质积累减少。辣椒素与槲皮苷处理可降低细胞内总甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量,提高高密度脂蛋白胆固醇和胆汁酸含量;同时各实验组上调了EGFR、PI3K、Akt及FXR1、FGF19蛋白的表达水平。综合来看,辣椒素与槲皮苷在调节肝脏脂质代谢方面具有协同效应,二者在高剂量水平以3∶1比例混合效果最佳。

硫氢化钠对大鼠肺缺血/再灌注引发的细胞焦亡及HK2-NLRP3-GSDMD通路的影响

目的:探讨硫氢化钠(NaHS)对大鼠肺缺血/再灌注(I/R)引发的细胞焦亡及己糖激酶2(HK2)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)-消皮素D(GSDMD)通路的影响。方法:将雄性SD大鼠随机分为6组,每组6只:对照(control)组、control+NaHS组、I/R组、低剂量NaHS+I/R(L+I/R)组、中剂量NaHS+I/R(M+I/R)组和高剂量NaHS+I/R(H+I/R)组。于造模前30 min腹腔注射1.5 mL NaHS溶液。在缺血30 min、再灌注1 h时立即取左肺组织,记录并计算肺湿/干重比和总肺含水量;HE染色观察肺组织形态;试剂盒检测丙二醛、髓过氧化物酶和乳酸水平;ELISA检测白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18水平;Western blot、qRT-PCR和免疫荧光染色检测糖酵解和细胞焦亡相关指标表达变化。结果:与control组相比,control+NaHS组各项检测指标均无显著差异(P>0.05),I/R组可见明显肺损伤,氧化应激反应和乳酸含量显著增加,糖酵解和细胞焦亡相关指标上调(P<0.05或P<0.01);与I/R组相比,L+I/R组以上检测指标显著下降(P<0.01)或无显著差异(P>0.05),M+I/R组以上检测指标不同程度降低(P<0.05或P<0.01),而H+I/R组以上各项指标均无显著差异(P>0.05)。结论:中剂量(56μmol·L^(−1)·kg^(−1))NaHS通过抑制HK2-NLRP3-GSDMD通路减少细胞焦亡的发生,从而减轻大鼠肺I/R损伤。

肾上腺髓质素对兔血管内皮细胞cAMP、cGMP及Ca^(2+)水平的影响

目的观察肾上腺髓质素(ADM)对兔血管内皮细胞内信号转导途径的影响。方法用原代培养的兔血管内皮细胞,给予肾上腺髓质素、cAMP激动剂forskolin(10-7mol/L)、NO供体L-精氨酸(1 mmol/L)、NO合酶抑制剂L-NMMA(10-5mol/L)、异丙肾上腺素(10-6mol/L)、8-bromo-AMP(10-7mol/L)及cGMP抑制剂L-NAME(10-4mol/L),观察细胞内cAMP、cGMP水平及Ca2+荧光强度的变化。用酶联免疫法测定cAMP及cGMP。用Fluo-3AM荧光负载兔血管内皮细胞测定细胞内钙浓度。结果肾上腺髓质素呈浓度依赖性升高兔血管内皮细胞内cAMP,而降低cGMP水平。肾上腺髓质素可使钙离子(Ca2+)水平下降(P<0.001),L-NMMA预处理组无明显作用,当加入L-精氨酸后荧光强度急剧下降。结论肾上腺髓质素能够影响兔血管内皮细胞的cAMP、cGMP及细胞内钙水平,从而实现其对细胞的多种生物学效应。

ABCG2在不同微环境下肾上腺皮质癌细胞中的表达及意义

目的:探讨ABCG2在不同微环境下在肾上腺皮质癌细胞中的表达和意义。方法:利用SW-13细胞株建立体内及体外微环境模型,流式细胞技术检测ABCG2在不同微环境下肾上腺皮质癌组织及细胞中的表达情况。结果:ABCG2在裸鼠转移淋巴结中的表达率[(5.41±2.57)%]明显高于标准培养基[(1.04±1.01)%]、干细胞培养基[(2.44±2.30)%]、裸鼠皮下移植瘤[(0.89±1.43)%]及腹腔转移瘤[(3.14±2.42)%]微环境的表达率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ABCG2在不同微环境下肾上腺皮质癌细胞中的表达有差异,ABCG2为骨髓侧群细胞(side population,SP)特异表型,肾上腺皮质癌组织中可能存在SP细胞。

短链脂肪酸乙酸钠减轻低氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞系HK2损伤

目的研究短链脂肪酸乙酸钠对低氧/复氧(H/R)导致人肾小管上皮细胞系(HK2)的保护作用及作用机制。方法体外建立H/R细胞模型,经乙酸钠(SA)提前预处理HK2细胞2 h,CCK8试剂盒检测细胞存活率,试剂盒检测炎性因子、细胞活性氧和ATP产量;流式细胞术测定线粒体膜电位(MMP)和线粒体氧化应激产物(mitoSOX)浓度;电镜观察线粒体超微结构;Western blot检测炎性信号通路IκB-α/NF-κB和线粒体能量障碍信号通路AMPK/PGC-1α的表达;结果与对照组相比,H/R组细胞存活率显著降低(P<0.05),细胞内ROS、mitoSOX、炎性因子表达显著升高(P<0.05),线粒体超微结构严重受损,ATP含量和MMP显著降低(P<0.05),p-IκB-α,NF-κB-p-P65蛋白表达显著升高,p-AMPK和PGC-1α蛋白表达显著降低(P<0.05);与H/R组相比,乙酸钠显著增加HK2细胞的存活率(P<0.05),抑制细胞内ROS、mitoSOX和炎性因子的释放,抑制线粒体超微结构损伤,ATP和MMP的下降(P<0.05),同时促进p-AMPK和PGC-1α蛋白表达,抑制p-IκB-α和NF-κB-p-P65蛋白表达(P<0.05)。结论乙酸钠通过抑制IκB-α/NF-κB、激活AMPK/PGC-1α信号通路对H/R诱导的HK2细胞发挥抗炎、抗氧化应激、线粒体结构和功能的保护作用。

α_(1A)-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2稳定共表达细胞的构建

目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^(-1)压力筛选后加入α_(1A)-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10μmol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到稳定表达α_(1A)-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α_(1A)-AR mRNA和蛋白的表达水平。③将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10^(-8)~10^(-5) mol·L^(-1))或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10^^(-8.8)~10^(-5) mol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位。④将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1μmol·L^(-1))组、NE(1μmol·L^(-1))组、萘派地尔+NE(各1μmol·L^(-1)共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1μmol·L^(-1))组、DMED(0.1μmol·L^(-1))组、阿替美唑+DMED(各0.1μmol·L^(-1)共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1μmol·L^(-1)与DMED 0.1μmol·L^(-1)共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α_(1A)-AR功能的特异性。结果①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞,NE 10μmol·L^(-1)孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α_(1A)-AR和EGFPNFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞可明显表达α_(1A)-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α_(1A)-AR蛋白表达。RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5~20代内α_(1A)-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500~800倍。③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数有效浓度(EC50)分别为5.94×10^(-7)和6.15×10^(-8) mol·L^(-1)。④与溶剂对照组和萘派地尔组比较,NE组U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),而萘派地尔+NE组EGFP-NFAT2核转位较NE组明显减弱(P<0.01)。与溶剂对照组和阿替美唑组比较,DMED组EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),阿替美唑+DMED组EGFP-NFAT2核转位与DMED组比较无明显差别,而萘派地尔+DMED组EGFP-NFAT2核转位较DMED组明显减弱(P<0.01)。结论成功构建稳定共表达α_(1A)-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFPNFAT2-α_(1A)-AR细胞,可用于靶向α_(1A)-AR化合物筛选和受体分子机制研究。