参芪地黄汤含药血清对脂多糖诱导人肾小球内皮细胞损伤的保护作用及机制研究

目的:观察参芪地黄汤含药血清对脂多糖(LPS)诱导的人肾小球内皮细胞(HRGEC)的保护作用并探讨其可能的作用机制。方法:LPS诱导体外肾小球内皮细胞损伤模型。实验分为5组:①正常组:完全培养基培养;②模型组:终浓度为10 mg/L LPS的完全培养基培养;③10%参芪地黄汤含药血清+终浓度为10 mg/L LPS的完全培养基培养;④大鼠空白血清+终浓度为10 mg/L LPS的完全培养基培养;⑤阳性对照组:终浓度为10μmol/L GS-5829+终浓度为10 mg/L LPS的完全培养基培养。采用CCK-8法测定细胞增殖率;ANNEXIN V-FITC/PI法检测细胞凋亡;硝酸还原酶法测定NO含量;ELISA法检测TNF-α含量。结果:与正常组相比,模型组细胞增殖率显著降低(P<0.01),细胞早凋率显著增加(P<0.01),细胞NO含量升高,TNF-α的释放增加;与模型组相比,参芪地黄汤含药血清可显著提升细胞增殖率(P<0.01),降低细胞早凋率,减少NO含量及TNF-α的释放。结论:参芪地黄汤可减少LPS诱导的HRGEC凋亡,其机制可能为:维持NO含量稳定,保护血管内皮;减少TNF-α释放,改善炎症反应。

槲皮素减轻高糖条件下人肾小球内皮细胞损伤的实验研究

目的研究槲皮素减轻高糖条件下人肾小球内皮细胞(HRGEC)损伤的作用及其机制。方法培养HRGEC并分为对照组、高糖组、10μmol/L槲皮素组、100μmol/L槲皮素组,后3组进行高糖处理,10μmol/L及100μmol/L槲皮素组分别给予10μmol/L及100μmol/L槲皮素处理。检测细胞活力、细胞凋亡、凋亡基因mRNA表达量、氧化应激指标含量、PI3K/AKT通路分子蛋白表达量。结果与对照组比较,高糖组的细胞活力、Bcl-2的mRNA表达量、SOD及GPx的含量、p-PI3K及p-AKT的蛋白表达量降低,细胞凋亡率、Bax及Caspase-3的mRNA表达量、MDA的含量增加(P<0.05);与高糖组比较,10μmol/L及100μmol/L槲皮素组的细胞活力、Bcl-2的mRNA表达量、SOD及GPx的含量、p-PI3K及p-AKT的蛋白表达量增加,细胞凋亡率、Bax及Caspase-3的mRNA表达量、MDA的含量降低(P<0.05)且100μmol/L槲皮素组的上述变化较10μmol/L槲皮素组更为显著(P<0.05)。结论槲皮素能够减轻高糖条件下HRGEC的损伤,且这一作用与激活PI3K/AKT通路有关。

血管紧张素1-7通过Mas受体减轻血管紧张素Ⅱ所致人肾小球内皮细胞损伤

目的:研究血管紧张素1-7(Ang1-7)对血管紧张素II(Ang II)所致人肾小球内皮细胞(HGECs)损伤的作用及可能机制。方法:体外培养HGECs,随机分为6组:对照组,Ang Ⅱ组,Ang1-7组,Ang II+Ang1-7组,Ang Ⅱ+Ang1-7+Mas受体阻断剂(A779)组及A779组,分别给予相应处理后,采用流式细胞术检测细胞凋亡率和活性氧簇(ROS)含量,荧光显微镜观察ROS的变化;同时检测HGECs培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量。结果:与对照组比较,Ang II组的细胞凋亡率及ROS平均荧光强度增加(P<0.05),上清液中IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1及ICAM-1的含量增加(P<0.05);与Ang Ⅱ组比较,Ang Ⅱ+Ang1-7组的细胞凋亡率及ROS水平降低,上清液中上述炎症因子含量减少(P<0.05);与Ang Ⅱ+Ang1-7组比较,A779的加入增加了细胞凋亡率、ROS生成和上清液中炎症因子的含量(P<0.05);与Ang Ⅱ组比较,加入Ang1-7可呈剂量依赖性抑制LDH漏出和ET-1分泌、并促进NO的释放(P<0.05)。结论:Ang1-7可能通过抑制Mas受体减轻Ang II所致HGECs的损伤。

抵当汤含药血清对高糖诱导大鼠肾小球内皮细胞损伤的影响

目的观察抵当汤含药血清对高糖诱导损伤大鼠肾小球内皮细胞(RGECs)的保护作用。方法大鼠灌胃给予蒸馏水或抵当汤制备空白血清或抵当汤含药血清,CCK8法筛选葡萄糖造模浓度及含药血清给药浓度。将RGECs分为空白组、模型组、抵当汤组(10%抵当汤含药血清)、达格列净组(空白血清+2μmol/L达格列净)、抵当汤+达格列净组(10%抵当汤含药血清+2μmol/L达格列净),药物处理24 h后,RT-qPCR法和Western blot法检测细胞Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA和蛋白表达,免疫荧光法检测细胞Nrf2荧光表达,比色法检测细胞SOD活性及MDA水平。结果与空白组比较,模型组RGECs中Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA和蛋白表达以及SOD活性降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA和蛋白表达以及SOD活性升高(P<0.05,P<0.01),MDA水平降低(P<0.01)。结论抵当汤含药血清可以通过激活Nrf2信号通路从而抑制氧化应激,对高糖损伤的RGECs起到保护作用。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

毛兰素调节Slit2/Robo1信号通路对糖尿病肾病模型大鼠肾小球内皮细胞血管生成的影响

目的 探讨毛兰素对糖尿病肾病(DN)模型大鼠肾小球内皮细胞血管生成的影响及slit同源蛋白2(Slit2)/轴突导向受体蛋白1(Robo1)信号通路的作用。方法 采用高糖高脂饲料持续饲养雄性SD大鼠8周,ip给予链脲佐菌素35 mg·kg^(-1)制备DN大鼠模型。将DN模型大鼠分为模型组及模型+毛兰素10,20和40 mg·kg^(-1)组(ig给予毛兰素,持续8周),每组10只,同时设置正常对照组(ig给予0.5%羟甲基纤维素钠,持续8周)。尿蛋白定量试剂盒测定大鼠24 h尿蛋白水平,全自动生化分析仪检测血清空腹血糖(FPG)和血肌酐(Scr)水平,PAS染色观察大鼠肾组织病理变化,免疫荧光法检测肾组织血小板内皮细胞黏附分子31(CD31)和足细胞标志蛋白(PCX)表达水平,Western印迹法检测肾组织Slit2和Robo1蛋白表达。结果 与正常对照组比较,模型组大鼠FPG、Scr和24 h尿蛋白水平以及肾组织CD31、Slit2和Robo1蛋白表达显著升高(P<0.01);肾组织新增肾小球毛细血管,并出现肾小球肥大和系膜面积扩张,存在非管状CD31染色,缺少相邻PCX染色,以及部分CD31管状区域染色也缺乏相邻的PCX染色。与模型组比较,模型+毛兰素10,20和40 mg·kg^(-1)组大鼠FPG、Scr和24 h尿蛋白水平及肾组织CD31、Slit2和Robo1蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01);肾组织新增肾小球毛细血管、肾小球肥大和系膜面积扩张现象减轻,CD31管状区域染色与PCX足细胞区域染色基本相邻。结论 毛兰素可能通过抑制Slit2/Robo1信号通路而抑制DN模型大鼠肾小球内皮细胞血管生成。

流体剪切力通过激活Piezo 1蛋白促进肾小球内皮细胞凋亡

目的探讨流体剪切力(FS)对肾小球内皮细胞(GECs)凋亡的影响及Piezo 1蛋白在其中的作用。方法对SD大鼠肾小球内皮细胞进行培养,使用Flexcell-T5000拉力仪模拟流体剪切力刺激,使用流式细胞测量技术检测细胞凋亡水平,通过免疫荧光染色试验检测Piezo 1蛋白在GECs中的表达水平。使用Ca 2+指示剂(Cal-590 AM)观察流体剪切力对Piezo 1通道的激活作用。使用化学激动剂Yoda1、抑制剂GsMtx 4及慢病毒Lv-shPiezo 1调控Piezo 1蛋白功能或表达后,观察Piezo 1对GECs凋亡的影响。结果与对照组相比,剪切力组细胞凋亡率增高(P<0.05),且随着流体剪切力强度升高,细胞凋亡率增高;Piezo 1在GECs中普遍表达,且流体剪切力可以激活Piezo 1通道并增强其表达;激动剂Yoda 1可以促进GECs的凋亡,抑制剂GsMtx 4可以抑制流体剪切力诱导的凋亡;Lv-shPiezo 1敲低GECs中Piezo 1的表达,且敲低组GECs的凋亡率较对照组及Lv-Ctrl组降低(P<0.05)。结论流体剪切力通过激活Piezo 1蛋白及增强其表达促进GECs的凋亡。

芪地糖肾方调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导高糖刺激肾小球内皮细胞焦亡的研究

目的 探究芪地糖肾方通过NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1/消皮素D蛋白(NLRP3/Caspase-1/GSDMD)通路介导高糖刺激的肾小球内皮细胞焦亡的作用。方法 将肾小球内皮细胞分为正常组、高糖组、芪地糖肾方组,分别予完全培养基、30 mmol/L高糖培养基、30 mmol/L高糖培养基+芪地糖肾方100μg/mL培养48 h,采用细胞免疫荧光染色法观察细胞中NLRP3表达情况及细胞骨架情况,采用Western blot法检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、消皮素D蛋白(GSDMD)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)表达情况。结果 与正常组比较,高糖组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号增强,细胞骨架损伤明显;与高糖组比较,芪地糖肾方组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号减弱,细胞骨架损伤状态改善。结论 芪地糖肾方可通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡相关通路激活改善高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤。

水蛭对局灶节段性肾小球硬化大鼠足细胞损伤的影响

目的:观察水蛭对局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)模型大鼠足细胞损伤的影响。方法:44只大鼠随机分为正常组、模型组、水蛭组3组,采用单侧肾切除术后尾静脉注射阿霉素法建立大鼠FSGS模型,水蛭组给予水蛭悬浊液0.9 g/(kg·d)灌胃,正常组、模型组予等量生理盐水灌胃,共8周。分别于给药后4周、8周末测定大鼠血清三酰甘油(TG),免疫荧光法、Western Blot法检测肾组织线粒体融合蛋白2(Mfn2)蛋白表达,PCR法检测Mfn2 mRNA表达。结果:水蛭组大鼠血TG水平较模型组降低(P<0.05);肾组织Mfn2蛋白和Mfn2 mRNA表达较模型组大鼠增多(P<0.05)。结论:水蛭可以降低FSGS大鼠TG水平,提高Mfn2蛋白及mRNA表达水平,减少足细胞损伤。

隐丹参酮调节Sirt1/FoxO1信号通路对高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤的影响

目的:探讨隐丹参酮(CT)调节沉默信息调节因子1(Sirt1)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对高糖诱导的肾小球内皮细胞(GEC)损伤的影响。方法:将GEC分为对照组(NR组,5mmoL/L D-葡萄糖)、高糖组(HG组,30mmoL/L D-葡萄糖)、L-CT组(1μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖处理GEC)、M-CT组(5μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖处理GEC)、H-CT组(10μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖处理GEC)和SIRT1-IN-1组(10μmoL/L CT+30mmoL/L D-葡萄糖+0.05moL/L Sirt1/FoxO1信号通路抑制剂SIRT1-IN-1处理GEC);MTT法检测CT对GEC细胞毒性和细胞活力的影响;ELISA法检测GEC炎症因子水平和氧化应激指标水平;流式细胞术检测GEC凋亡;Western blot法检测细胞中自噬、凋亡、纤维化因子和Sirt1/FoxO1通路相关蛋白表达。结果:0~40μmoL/L CT对GEC无明显毒性影响。与NR组相比,HG组OD 570值、SOD含量、Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p-Sirt1/Sirt1、p-FoxO1/FoxO1蛋白水平显著下降(P<0.05),GEC凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、Col-I、TGF-β1蛋白水平、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA含量显著上调(P<0.05);与HG组相比,L-CT组、M-CT组、H-CT组增殖活性、自噬蛋白、通路蛋白水平显著升高(P<0.05),炎性反应、氧化应激、纤维化因子蛋白水平、凋亡率显著下降(P<0.05);SIRT1-IN-1消除了CT对GEC的有利影响。结论:CT可能通过上调Sirt1/FoxO1信号通路改善高糖诱导的GEC损伤。

银杏素调节NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路对高糖诱导肾小球内皮细胞焦亡的影响

目的探讨银杏素调节核转录因子кB/Nod样受体蛋白3/半胱天冬酶-1(NF-κB/NLRP3/Caspase-1)信号通路对高糖诱导肾小球内皮细胞焦亡的影响。方法将肾小球内皮细胞(HRGECs)作为研究对象,将HRGECs细胞分为正常组(正常5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、银杏素低剂量组(30 mmol/L葡萄糖+5μmol/L银杏素)、银杏素中剂量组(30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L银杏素)、银杏素高剂量组(30 mmol/L葡萄糖+20μmol/L银杏素)、BAY组[(30 mmol/L葡萄糖+20μmol/L银杏素+2.5μmol/L NF-κB的特异性抑制剂BAY 11-7085(BAY))]、MCC950组(30 mmol/L葡萄糖+20μmol/L银杏素+10μmol/L NLRP3抑制剂MCC950)、VX-765组(30 mmol/L葡萄糖+20μmol/L银杏素+20μmol/L Caspase-1抑制剂VX-765),各组细胞加入相应试剂后共培养24 h;MTT法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞焦亡情况;试剂盒法测定细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平;qRT-PCR法和Western blot法检测细胞NF-κB、NLRP3、Caspase-1、GSDMD的表达。结果与正常组比较,高糖组细胞存活率明显下降(P<0.05),PI+Caspase-1阳性细胞比例、细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平以及细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达明显升高(P<0.05);与高糖组比较,银杏素低、中、高剂量组细胞存活率明显升高(P<0.05),PI+Caspase-1阳性细胞比例、细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平以及细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达明显降低(P<0.05);分别使用NF-κB、NLRP3、Caspase-1特异性抑制剂BAY、MCC950、VX-765进一步升高细胞存活率,降低细胞PI+Caspase-1阳性细胞比例、细胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平以及细胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达。结论银杏素可通过抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路抑制高糖诱导的肾小球内皮细胞焦亡。

DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制小鼠肾小球内皮细胞转分化和肾纤维化

目的 基于分化型胚胎软骨发育基因2(DEC2)通过转化生长因子β/Rho相关激酶1(TGF-β/ROCK1)信号通路探讨对肾小球内皮细胞转分化的保护机制。方法 将小鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻(UUO)组、空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,每组6只。除假手术组外,其余组建立UUO模型。空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,于第0天(UUO后立即)在超声系统的引导下每侧肾脏注射10μL(108个嗜菌斑形成单位[PFU])空载体或DEC2载体。术后14 d处死小鼠,HE染色检测肾组织学病变情况、 Masson染色检测肾纤维化情况,Western blot法检测肾组织DEC2、 α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、 Rho相关激酶1(ROCK1)的蛋白表达。正常人肾小球内皮细胞(GEnC),采用ROCK1抑制剂Y-27632处理或转染DEC2, Western blot法检测暴露于TGF-β的GEnC中ROCK1、 α-SMA、 DEC2、 E-cadherin表达影响。通过免疫荧光细胞化学染色检测GEnC中ROCK1和DEC2定位,并通过免疫共沉淀实验验证二者的相互作用关系。结果 与假手术组相比,UUO组在第14天出现显著的肾纤维化和胶原蛋白积聚。在UUO组中,小鼠肾组织中DEC2和E-cadherin的表达显著降低,α-SMA的表达显著增加。与空载体处理的UUO组相比,过表达DEC2的UUO组小鼠肾纤维化和胶原蛋白积聚程度降低,并且小鼠肾组织中ROCK1、 α-SMA表达降低和DEC2、 E-cadherin表达增加。TGF-β以时间依赖性方式增强GEnC中ROCK1和α-SMA表达,并且DEC2、 E-cadherin水平降低。用ROCK1抑制剂Y-27632处理可部分消除TGF-β诱导的ROCK1、 α-SMA表达增加和DEC2、 E-cadherin表达降低。此外,在TGF-β刺激前,将GEnC转染DEC2降低细胞中ROCK1、 α-SMA表达,并增加DEC2、 E-cadherin表达。免疫荧光染色显示DEC2在GEnC中与ROCK1共定位,并且免疫共沉淀结果显示DEC2与ROCK1相互拉低。结论 DEC2在纤维化肾组织中下调,上调DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制GEnC的上皮肌纤维母细胞转分化及肾纤维化。

褪黑素抑制狼疮性肾炎血清诱导的人肾小球内皮细胞炎症

目的探讨褪黑素对狼疮性肾炎(LN)病人血清诱导的肾小球内皮细胞(HRGEC)炎症的影响。方法将不同剂量的褪黑素(10、100、250、500、750、1000μmol/L)加入HRGEC培养体系中24 h,应用CCK-8测定细胞活力。采集抗双链DNA阳性(抗dsDNA阳性)的10例LN病人血清刺激HRGEC,应用Western blot检测HRGEC中NOD样受体热蛋白结构域蛋白3(NLRP3)炎症小体活化、ELISA测定细胞上清液中IL-1β水平、DCFH-DA和DHE检测细胞活性氧(ROS)的产生,利用免疫荧光法检测NF-κB/p65的核转位。结果CCK-8测定结果提示≥750μmol/L的褪黑素显著降低HRGEC细胞活力(P<0.05)。褪黑素抑制人LN血清诱导的HRGEC中NLRP3炎症小体激活及下游的IL-1β产生(P<0.05);褪黑素逆转人LN血清刺激的HRGEC细胞ROS产生(P<0.05);褪黑素抑制人LN血清诱导的HRGEC细胞NF-κB活性。结论褪黑素可能通过抑制炎症反应改善LN病人血清导致的肾小球内皮细胞损伤,它可作为LN的一种潜在的治疗药物。

低分子肝素和尿激酶对老年大鼠肾小球内皮细胞损伤保护作用的比较

目的探讨炎症状态下增龄对肾小球内皮损伤的影响,比较低分子肝素和尿激酶对损伤的保护作用。方法3月龄及27月龄雌性Wistar大鼠各40只,随机分为正常对照组(NC组)、脂多糖(LPS)组(L组)、LPS+氨甲环酸组(LT组)、LPS+氨甲环酸+低分子量肝素组(LTH组)及LPS+氨甲环酸+尿激酶组(LTU组)。采用直接免疫荧光检测肾小球纤维蛋白沉积,Western印迹法检测血管内皮血栓调节蛋白(TM),纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)蛋白质表达。结果(1)LPS刺激后纤维蛋白沉积增多(P<0.05),TM几乎无表达(P<0.01),PAI-1表达明显上调(P<0.05);(2)加用氨甲环酸后,PAI-1表达进一步上调(P<0.05);(3)应用低分子肝素和尿激酶后纤维蛋白沉积明显减轻(P<0.05),PAI-1表达与LT组比较明显下调(P<0.05),TM表达增多(P<0.05),两组之间无统计学差异。(4)老年大鼠各组肾小球纤维蛋白沉积均比相同干预组的青年大鼠明显,PAI-1的表达均较青年大鼠相同干预组显著增多,TM表达则显著减少,差别均有统计学意义(P<0.05)。结论增龄可加重LPS诱导的肾小球内皮损伤;低分子肝素与尿激酶均能有效保护老年大鼠肾小球血管内皮损伤,两者无明显差别,但增龄可减弱低分子肝素和尿激酶对血管内皮的保护作用。

泽兰通过保护糖萼核心蛋白缓解高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤

目的:观察泽兰对肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cells,GECs)糖萼核心蛋白的影响,揭示泽兰缓解高糖诱导GECs损伤的机制。方法:高糖环境下培养大鼠GECs,予泽兰及厄贝沙坦含药血清处理2 d,收集处理后的细胞,Western blot检测大鼠GECs糖萼核心蛋白Syndecan-1、Glypican-1和CD31、α-SMA表达,RT-PCR法检测mRNA水平。结果:高糖环境培养下,大鼠GECs糖萼核心蛋白Syndecan-1、Glypican-1、CD31及其mRNA表达下降,α-SMA及其mRNA表达增加(P<0.05);而泽兰及厄贝沙坦含药血清则可上调Syndecan-1、Glypican-1、CD31及其mRNA表达(P<0.05),抑制α-SMA及其mRNA表达(P<0.05);泽兰对Syndecan-1、Glypican-1的保护作用优于厄贝沙坦且呈剂量依赖性(P<0.05),厄贝沙坦对α-SMA的抑制作用更显著(P<0.05)。结论:泽兰通过保护糖萼核心蛋白缓解高糖诱导的GECs损伤,为泽兰治疗DN提供了又一重要理论依据。

肾小球内皮细胞培养及MAC亚溶破损伤模型制作

为探讨ＭＡＣ亚溶破效应在移植肾慢性排斥反应发病机制中的作用和ＣＤ５９的保护作用，建立了肾小球血管内皮细胞培养方法，并用酵母多糖（Ｚ）激活血清（ＮＨＳ）补体，诱生ＭＡＣ损伤肾小球血管内皮细胞，以上清中ＬＤＨ释放量及脱落细胞活力确定ＮＨＳ的亚溶破损伤剂量。结果显示：用肾小球外植法培养肾小球血管内皮细胞较易成功，当ＮＨＳ为０．０５ｍｌ（５％）时，上清中的ＬＤＨ和脱落细胞活力，与正常组比较相差显著（Ｐ＜０．０５）。

用MTT法测定内毒素对培养人肾小球内皮细胞的损伤作用

目的：研究内毒素对人肾小球内皮细胞（ＨＧＶＥＣ）活力的影响，探讨内毒素在烧伤早期损害中的作用。方法：分离培养人肾小球内皮细胞，把细胞分为正常培养组，内毒素浓度梯度组，内毒素时间梯度组，无血清内毒素作用ＨＧＶＥＣ１２ｈ组，另设烧伤血清时间梯度组为阳性对照。用ＭＴＴ法测定经内毒素和烧伤血清刺激后ＨＧＶＥＣ活力变化。结果：１μｇ／ｍｌ以上内毒素即可引起ＨＧＶＥＣ活力降低（Ｐ＜０．０１），１μｇ／ｍｌＬＰＳ时间梯度组细胞活力呈进行性下降，并在１２ｈ差异非常显著（与对照组比较）。在有血清和无血清条件下１μｇ／ｍｌＬＰＳ分别作用ＨＧＶＥＣ１２ｈ，细胞活力下降差别不显著。烧伤血清刺激组细胞活力６ｈ即出现明显降低，时间早于内毒素组，１μｇ／ｍｌ内毒素１２ｈ才显著降低，烧伤血清组降低程度大于内毒素组，两组间在３ｈ和６ｈ差异均显著。形态学观察，ＬＰＳ和烧伤血清作用ＨＧＶＥＣ可使其细胞核脱失。结论：内毒素和烧伤血清均可损伤ＨＧＶＥＣ，使其活力降低。ＬＰＳ对ＨＧＶＥＣ的损伤程度与ＬＰＳ浓度和作用时间呈正相关。内毒素对ＨＧＶＥＣ的损伤不依赖于血清参与。

灵芝多糖、水飞蓟素改善不同程度肾小球内皮细胞氧化应激损伤的Sirt1调节机制研究

目的对照Sirt1激动剂白藜芦醇(Res),研究灵芝多糖(GLPs)、水飞蓟素(Silymarin)对肾小球内皮细胞不同程度氧化损伤的保护作用及Sirt1影响。方法 80μmol/L过氧化氢(H2O2)损伤时,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定各组细胞Sirt1基因水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定各组蛋白表达水平;95μmol/L H2O2损伤时,慢病毒颗粒转导Sirt1 SHRNA后MTT法测定各组细胞活力。结果 80μmol/L H2O2损伤下,各组Sirt1mRNA水平为水飞蓟素组=白藜芦醇组=模型对照组>灵芝多糖组=正常对照组,Sirt1蛋白表达为模型对照组>白藜芦醇组>灵芝多糖组=水飞蓟素组=正常对照组;H2O2浓度95μmol/L时,各组细胞活力依次为:灵芝多糖组>水飞蓟素组>白藜芦醇组=模型对照组。结论一定程度氧化损伤下,机体自我修复作用可能与主动上调Sirt1表达有关;氧化损伤时细胞存活率与Sirt1表达非线性关系,Sirt1mRNA和蛋白表达水平也不尽一致;灵芝多糖、水飞蓟素、白藜芦醇对Sirt1的影响不同。

中介素对大鼠肾小球内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的研究中介素(IMD)对大鼠肾小球内皮细胞(r RGEC)缺氧损伤的作用。方法 r RGEC传代培养后,随机分为正常组(N组),缺氧组(H组)及IMD组,根据培养液中IMD的终浓度将缺氧处理组分为10-8mol/L(IMD1)、10-7 mol/L(IMD2)、10-6 mol/L(IMD3)组。流式细胞仪分析细胞凋亡;检测内皮单层底顶室异硫氰酸荧光素(FITC)-BSA荧光强度,以底顶室荧光强度比值的变化来表示细胞通透性的变化;酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清液中4-羟壬烯醛(4-HNE)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)变化;实时荧光定量PCR(RTPCR)检测细胞细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)m RNA的表达;免疫细胞化学法检测HIF-1α及VEGF蛋白表达并进行半定量分析。结果与N组相比,IMD1、IMD2、IMD3组细胞凋亡率均降低(P<0.05);H、IMD1、IMD2、IMD3组细胞通透性均增加(P<0.05),H组上清中4-HNE、ROS升高,SOD降低(P<0.05);IMD2组HIF-1αm RNA相对表达量及蛋白含量增高(P<0.05),VEGFm RNA相对表达量及蛋白含量增高(P<0.05);与H组相比,IMD1、IMD2、IMD3组细胞凋亡率均降低(P<0.05),细胞通透性降低(P<0.05),4-HNE、ROS降低,SOD升高(P<0.05),IMD2组HIF-1αm RNA相对表达量及蛋白含量增高(P<0.05),VEGF m RNA相对表达量及蛋白含量增高(P<0.05)。相关分析发现HIF-1αm RNA、VEGF m RNA相对表达量与细胞凋亡率呈较强负相关(r=-0.919、-0.911,P<0.05)。结论 IMD可减轻肾小球内皮细胞缺氧损伤,保护肾小球内皮细胞,与其上调VEGF与HIF-1α生成有关。

灵芝多糖、水飞蓟素对不同程度肾小球内皮细胞氧化损伤的保护作用研究

目的对照白藜芦醇(Res),研究不同浓度灵芝多糖(GLPs)、水飞蓟素(Silymarin)对不同程度氧化损伤下肾小球内皮细胞的保护作用。方法以80μmol/L及95μmol/L两种浓度过氧化氢(H2O2)造成肾小球内皮细胞不同程度氧化损伤,灵芝多糖、水飞蓟素、白藜芦醇分别设立多种浓度,进行先损伤再行药物保护和先药物预保护再行损伤两种实验,MTT法测定各组细胞活力。结果在80μmol/L H2O2损伤时,高纯度灵芝多糖高浓度组细胞活力最高;95μmol/L H2O2损伤,灵芝多糖仍以高纯度高浓度保护作用较强,水飞蓟素趋向10μmol/L浓度组细胞活力反低于5μmol/L浓度,而白藜芦醇明确表现出低浓度作用强于高浓组;两种浓度H2O2损伤前给予灵芝多糖、水飞蓟素或白藜芦醇行预保护均无法提高细胞存活率。结论三种药物对损伤细胞都有明确的保护作用,但其对正常细胞无预保护作用;氧化损伤程度不同,各药物的保护作用迥异,浓度与药效非单纯线性关系。