基于NF-κB信号通路探讨低分子量肝素对糖尿病肾病足细胞增殖、凋亡和炎症的影响

目的基于核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的变化探讨低分子量肝素(LMH)对糖尿病肾病足细胞增殖、凋亡和炎症的影响。方法体外培养人肾小球足细胞(HGPC),将HGPC分为对照(Con)组(以含5 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养)、高D-葡萄糖(Glu-H)组(以含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养)、LMH组(以含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养,并分别给予1、5、10、15、20μmol/L的LMH进行干预)、BAY11-7082组(以含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养,并给予1μmol/L的BAY11-7082干预)、LMH+BAY11-7082组(以含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养,并给予最适剂量LMH联合1μmol/L的BAY11-7082干预)、LMH+Prostratin组(以含30 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养,并给予最适剂量LMH联合20μmol/L的Prostratin干预)。先用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)将不同浓度LMH对高糖诱导的HGPC细胞活力进行检测,以筛选出最适的LMH;采用Hoechst 33258染色法检测HGPC的凋亡情况;采用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EDU)法检测HGPC的增殖情况;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HGPC裂解液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β水平;采用蛋白免疫印迹法检测HGPC中NF-κBp65、磷酸化(p)-NF-κBp65、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达量。结果经1、5、10、15、20μmol/L LMH处理的HGPC细胞活力逐渐升高,选用20μmol/L作为LMH最适剂量。与Con组比较,Glu-H组细胞凋亡率升高(P<0.05),TNF-α、IL-1β水平及Caspase-3、p-NF-κBp65蛋白相对表达量升高(P<0.05),细胞增殖率及Cyclin D1蛋白相对表达量则下降(P<0.05);与Glu-H组比较,LMH组和BAY11-7082组细胞凋亡率降低(P<0.05),TNF-α、IL-1β水平及Caspase-3、p-NF-κBp65蛋白相对表达量下降(P<0.05),细胞增殖率及Cyclin D1蛋白相对表达量明显升高(P<0.05);与LMH组比较,LMH+BAY11-7082组细胞凋亡率降低(P<0.05),TNF-α、IL-1β水平及Caspase-3、p-NF-κBp65蛋白相对表达量下降(P<0.05),细胞增殖率及Cyclin D1蛋白相对表达量明显升高(P<0.05);与LMH组比较,LMH+Prostratin组细胞凋亡率升高(P<0.05),TNF-α、IL-1β水平及Caspase-3、p-NF-κBp65蛋白相对表达量升高(P<0.05),细胞增殖率及CyclinD1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。结论LMH可抑制高糖诱导的糖尿病肾病足细胞凋亡和炎症反应,并促进细胞增殖,这种作用可能是通过抑制NF-κB信号通路的活化来完成的。

二甲双胍介导NF-κB信号通路对糖尿病肾病细胞损伤的保护作用

为探究二甲双胍介导核因子-κB(NF-κB)信号通路对糖尿病肾病细胞损伤的保护作用,体外培养人肾小球足细胞(HGPC),利用10、20、30和40 mmol/L D-葡萄糖进行干预,筛选构建HGPC高糖炎症损伤模型的D-葡萄糖最适浓度;再利用20、40、80、160 mmol/L二甲双胍进行干预,筛选最适二甲双胍浓度;随后将细胞分为对照组(Con组)、高糖组(HG组)、二甲双胍组(Met组,30 mmol/L D-葡萄糖+80 mmol/L二甲双胍)、抑制剂组(Y组,30 mmol/L D-葡萄糖+1μmol/L NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082)、二甲双胍+抑制剂组(Met+Y组,30 mmol/L D-葡萄糖+80 mmol/L二甲双胍+1μmol/L BAY 11-7082)和二甲双胍+激动剂组(Met+A组,30 mmol/L D-葡萄糖+80 mmol/L二甲双胍+1μmol/L NF-κB通路激动剂Prostratin),干预24 h。利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子水平;Transwell小室法测定细胞侵袭和迁移能力;蛋白免疫印迹(WB)法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤连蛋白(FN)、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白的表达水平。结果显示:选择30 mmol/L D-葡萄糖干预HGPC细胞24 h以构建HGPC高糖炎症模型,80 mmol/L为二甲双胍最适浓度;HG组细胞炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平、细胞侵袭、迁移能力以及N-cadherin、vimentin、FN和p-NF-κB p65蛋白水平高于Con组,E-cadherin蛋白表达水平低于Con组(P<0.05);与HG组相比,Met组和Y组细胞炎症因子TNF-α、IL-1β水平、细胞侵袭能力、迁移能力、N-cadherin、vimentin、FN和p-NF-κB p65蛋白表达水平显著降低,E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05);与Met组相比,加入BAY 11-7082后,上述指标趋势更显著(P<0.05),Met+A组趋势与Met+Y组相反(P<0.05)。二甲双胍通过阻断NF-κB通路激活抑制D-葡萄糖诱导的HGPC炎症反应、侵袭、迁移和上皮间质转化进程,保护高糖诱导的足细胞损伤。

花生四烯酸在诱导人肾小球足细胞凋亡中的作用

目的研究花生四烯酸(AA)在诱导人肾小球足细胞凋亡中的作用及可能机制。方法以体外培养的人肾小球足细胞为研究对象,使用无血清培养基同步化12h。分别以不同浓度(10^(-8)、10^(-7)、10^(-6)、10^(-5 )mol/L)的AA刺激培养的人肾小球足细胞2h和以相同浓度(10^(-5 )mol/L)的AA在不同时间(0.5、1.0、2.0h)刺激人肾小球足细胞。流式细胞术及Hoechst-33342染色检测人肾小球足细胞凋亡,Western-blot检测p-p38及p53蛋白变化情况。结果不同浓度的AA刺激人肾小球足细胞2h,与浓度0mol/L(对照)刺激比较,浓度10^(-8)、10^(-7 )mol/L时人肾小球足细胞凋亡率和p53蛋白差异无统计学意义(P>0.05);浓度10^(-6)、10^(-5 )mol/L时,人肾小球足细胞凋亡率[流式细胞术检测:(11.57±1.10)%、(12.67±0.92)%比(4.80±0.17)%]、p-p38及p53蛋白水平明显增加(均P<0.05)。相同浓度(10^(-5 )mol/L)的AA在不同时间刺激人肾小球足细胞,与刺激0h(对照)比较,刺激0.5h人肾小球足细胞凋亡率和p53差异无统计学意义(P>0.05);刺激1.0、2.0h时,人肾小球足细胞凋亡率[流式细胞术检测:(12.60±1.15)%、(14.83±1.39)%比(4.80±0.97)%]、p-p38及p53蛋白水平明显增加(均P<0.05)。结论AA浓度为10^(-6)和10^(-5 )mol/L时在体外能诱导培养的人肾小球足细胞凋亡,且与p-p38及p53蛋白水平相关。

低分子量肝素对糖尿病肾病足细胞损伤的影响及机制

目的探讨低分子量肝素(LMH)对糖尿病肾病(DN)足细胞损伤的影响及机制。方法将人肾小球足细胞(HGPC)分为对照(NC)组、高浓度葡萄糖(HG)组、1、5、10、15、20μmol/L LMH组,NC组细胞以含5 mmol/L葡萄糖的培养基培养;HG组细胞以含30 mmol/L的葡萄糖培养基培养;1、5、10、15、20μmol/L LMH组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+不同浓度(1、5、10、15、20μmol/L)LMH的培养基共同培养,筛选出最佳浓度15μmol/L LMH后,又将细胞分为NC组、HG组、LMH组、BAY11-7082组、LMH+BAY11-7082组、LMH+Prostratin组。LMH组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15μmol/L LMH的培养基共同培养;BAY11-7082组细胞以含30 mmol/L的葡萄糖+1μmol/L BAY11-7082的培养基培养;LMH+BAY11-7082组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15μmol/L LMH+1μmol/L BAY11-7082的培养基培养;LMH+Prostratin组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15μmol/L LMH+20μmol/L Prostratin的培养基培养。采用活细胞计数法(CCK-8)检测HGPC细胞的细胞活力;Hoechst 33258染色法检测HGPC细胞的凋亡状况;Transwell小室实验检测HGPC细胞的侵袭能力;酶联免疫吸附实验检测HGPC裂解液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6表达;蛋白免疫印迹法检测HGPC细胞中核转录因子kappa-B(NF-κB)p65、磷酸化(p)-NF-κBp65、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(FN)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达。结果CCK-8结果显示,LMH的最适浓度为15μmol/L。药物处理24 h后,与NC组相比,HG组细胞凋亡率、侵袭细胞数升高(P均<0.05);与HG组相比,LMH组和BAY11-7082组细胞凋亡率、侵袭细胞数下降(P均<0.05);与LMH组相比,LMH+BAY11-7082组细胞凋亡率、侵袭细胞数下降(P均<0.05),LMH+Prostratin组细胞凋亡率、侵袭细胞数升高(P均<0.05)。与NC组相比,HG组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低(P均<0.05);与HG组相比,LMH组和BAY11-7082组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达下降,而E-cadherin蛋白表达上调(P均<0.05);与LMH组相比,LMH+BAY11-7082组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达下降(P均<0.05),而E-cadherin蛋白表达上调(P均<0.05);LMH+Prostratin组TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低(P均<0.05)。结论LMH可抑制HG诱导的DN足细胞损伤,其机制可能是抑制NF-κB信号通路的活性和EMT进程。

双氢青蒿素抑制TLR4/NF-κB信号通路对高糖刺激的足细胞功能障碍的改善作用

目的探究双氢青蒿素通过调控Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路对D-葡萄糖诱导的人肾小球足细胞(HGPC)炎症、增殖、迁移和侵袭的影响。方法体外培养HGPC细胞,将HGPC细胞分为对照组(5 mmol·L^(-1)D-葡萄糖)、高糖组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖)和不同浓度双氢青蒿素组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+5、10、20、40μmol·L^(-1)双氢青蒿素),筛选出合适的双氢青蒿素作用浓度;随后将细胞分为对照组、高糖组、双氢青蒿素组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素)、抑制剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+5μmol·L^(-1)NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082)、双氢青蒿素+抑制剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素+5μmol·L^(-1)BAY 11-7082)和双氢青蒿素+激活剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素+1μmol·L^(-1)NF-κB通路激活剂Prostratin),干预24 h。细胞计数试剂盒细胞8(CCK-8)法检测细胞活力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子白细胞介素(IL)-1β和IL-8的表达水平;5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测细胞的增殖能力;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平。结果CCK-8法检测结果显示20μmol·L^(-1)双氢青蒿素对D-葡萄糖HGPC细胞活力恢复效果最好,因此选择20μmol·L^(-1)双氢青蒿素用于后续实验。与对照组比较,高糖组细胞增殖率和CyclinD1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),炎症因子(IL-1β和IL-8)、迁移数、侵袭数、MMP-9、TLR4和磷酸化(p)-NF-κB p65蛋白相对表达量明显升高(P<0.05);双氢青蒿素组、抑制剂组、双氢青蒿素+抑制剂组及双氢青蒿素+激活剂组中双氢青蒿素和BAY11-7082明显抑制了D-葡萄糖对HGPC细胞的上述作用(P<0.05);与双氢青蒿素组比较,双氢青蒿素+抑制剂组中BAY11-7082增强了双氢青蒿素对D-葡萄糖诱导的HGPC细胞的作用(P<0.05),双氢青蒿素+激活剂组中Prostratin则削弱了双氢青蒿素对D-葡萄糖诱导的HGPC细胞的作用(P<0.05)。结论双氢青蒿素能抑制D-葡萄糖诱导的HGPC细胞迁移和侵袭,并促进其增殖,能有效改善D-葡萄糖刺激对HGPC细胞的炎症损伤,其作用机制可能与阻滞TLR4/NF-κB信号通路信号转导有关。

达格列净调控p38丝裂原活化蛋白激酶通路对高糖诱导足细胞增殖、凋亡及炎症反应影响的研究

目的 探讨达格列净通过p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路对高糖诱导的足细胞增殖及凋亡的影响。方法 将人肾小球足细胞(HGPC)分为正常对照(Con)组、低、中、高D-葡萄糖组(Glu 10、Glu 20、Glu 30)、高糖组(HG)、HG+低、中、高浓度达格列净组(HG+Dap 12.5、HG+Dap 25、HG+Dap 50)、HG+达格列净组(HG+Dap)、HG+抑制剂组(HG+SB 203580)、HG+达格列净+抑制剂组(HG+Dap+SB 203580)、达格列净+激活剂组(HG+Dap+C16-PAF),干预24 h,检测各组细胞活力、增殖率、凋亡率和相关因子水平。结果 与Con组比较,HG组IL-1β、TNF-α、细胞凋亡率、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA和蛋白表达、p53、p-p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05),细胞增殖率、细胞周期素D1(Cyclin D1)mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与HG组比较,HG+Dap、HG+SB 203580组增殖率、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α、细胞凋亡率、Caspase-3 mRNA和蛋白表达、p53、p-p38 MAPK蛋白表达降低(P<0.05)。与HG+Dap组比较,HG+Dap+SB 203580组细胞增殖率、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α、细胞凋亡率、Caspase-3 mRNA和蛋白表达、p53、p-p38 MAPK蛋白表达降低(P<0.05),HG+Dap+C16-PAF组IL-1β、TNF-α、细胞凋亡率、Caspase-3 mRNA和蛋白表达、p53、p-p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05),细胞增殖率、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。结论 达格列净可促进高D-葡萄糖环境下HGPC增殖,抑制细胞凋亡及炎症反应,其作用机制可能与抑制p38 MAPK通路信号转导相关。

来氟米特抑制高糖环境smad通路所致足细胞凋亡

目的 体外培养足细胞,探讨高糖刺激下足细胞凋亡与smad通路的关系,并研究来氟米特是否可以通过该通路来抑制足细胞凋亡.方法 传代培养人肾小球足细胞后分组实验,用western blotting法检测smad2/3蛋白及p-smad2/3蛋白的表达,并用流式细胞仪检测足细胞的凋亡.结果 高糖刺激下足细胞表达p-smad2/3蛋白及足细胞凋亡均增加;加入抑制剂及来氟米特后,二者均显著减少.其中来氟米特组较高糖组足细胞凋亡率下降了（24.0±2.3）%,P＜0.05.结论 来氟米特能部分阻断高糖环境下smad通路所致的足细胞凋亡.