普罗布考对肾小管上皮细胞氧糖剥夺/复氧损伤的影响及其机制研究

背景肾缺血-再灌注损伤的主要病理生理基础是肾小管上皮细胞发生脂质过氧化损伤,而肾小管上皮细胞损伤直接影响尿液的形成。普罗布考是具有很强抗氧化作用的降血脂药,其可以通过提高细胞内抗氧化酶活性降低脂质过氧化水平,具有较好的组织或细胞保护作用。但目前尚未见关于普罗布考对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)引起的人肾小管上皮细胞株(HK-2)损伤影响的报道。目的探讨普罗布考对HK-2 OGD/R损伤的影响及其机制,为老药新用开辟新思路。方法 2017年12月-2018年9月,取HK-2,常规培养至完全贴壁后将其分为正常对照组、OGD/R组、OGD/R+25μmol/L普罗布考组、OGD/R+50μmol/L普罗布考组、OGD/R+100μmol/L普罗布考组。正常对照组不予处理,OGD/R组、OGD/R+25μmol/L普罗布考组、OGD/R+50μmol/L普罗布考组、OGD/R+100μmol/L普罗布考组进行OGD/R模型的建立,之后OGD/R组不予处理,OGD/R+25μmol/L普罗布考组、OGD/R+50μmol/L普罗布考组、OGD/R+100μmol/L普罗布考组分别加入25、50、100μmol/L普罗布考;分别于12、24、48 h时,计算各组细胞增殖活性,确定普罗布考最佳作用时间与浓度,用于后续实验。取HK-2,常规培养至完全贴壁后将其分为正常对照组(不予处理)、OGD/R组(建立OGD/R模型)、普罗布考组(给予最佳作用浓度的普罗布考)、OGD/R+普罗布考组(建立OGD/R模型后给予最佳作用浓度的普罗布考);于普罗布考最佳作用时间,观察各组细胞形态,检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性、谷胱甘肽(GSH)水平、GPX4水平。结果 OGD/R组、OGD/R+25μmol/L普罗布考组、OGD/R+50μmol/L普罗布考组、OGD/R+100μmol/L普罗布考组12、24、48 h时细胞增殖活性低于正常对照组(P<0.05);OGD/R+50μmol/L普罗布考组、OGD/R+100μmol/L普罗布考组24、48 h时细胞增殖活性高于OGD/R组、OGD/R+25μmol/L普罗布考组(P<0.05)。OGD/R+50μmol/L普罗布考组、OGD/R+100μmol/L普罗布考组24、48 h时细胞增殖活性高于本组12 h时(P<0.05)。由于用药原则为在相似的作用下,一般选择较低浓度及较短作用时间,因此采用50μmol/L普罗布考作用24 h进行后续实验。OGD/R组悬浮细胞增多,细胞皱缩体积减小,失去正常形态,折光性减弱;普罗布考组细胞形态结构正常,贴壁完整;OGD/R+普罗布考组悬浮细胞减少,细胞折光性较好。OGD/R组、OGD/R+普罗布考组LDH活性高于正常对照组(P<0.05);普罗布考组、OGD/R+普罗布考组LDH活性低于OGD/R组(P<0.05);OGD/R+普罗布考组LDH活性高于普罗布考组(P<0.05)。OGD/R组、OGD/R+普罗布考组MDA水平高于正常对照组(P<0.05);普罗布考组、OGD/R+普罗布考组MDA水平低于OGD/R组(P<0.05);OGD/R+普罗布考组MDA水平高于普罗布考组(P<0.05);OGD/R组GPX活性低于正常对照组(P<0.05);普罗布考组、OGD/R+普罗布考组GPX活性高于OGD/R组(P<0.05);OGD/R+普罗布考组GPX活性低于普罗布考组(P<0.05)。OGD/R组GSH水平低于正常对照组(P<0.05);普罗布考组、OGD/R+普罗布考组GSH水平高于OGD/R组(P<0.05)。OGD/R组GPX4水平低于正常对照组(P<0.05);普罗布考组、OGD/R+普罗布考组GPX4水平高于OGD/R组(P<0.05)。结论普罗布考对OGD/R引起的HK-2损伤具有保护作用,可能机制是通过激活GPX,尤其是提高GPX4水平,直接或间接抑制脂质过氧化物的过度产生。

微小RNA-612抑制低氧诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转化作用及其分子机制

目的探讨微小RNA（miR）-612对低氧诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响及其分子机制。方法分别以100μmol／L的氯化钴（CoCl2·6H2O，Co）处理体外培养的HK2人肾小管上皮细胞株6h、12h和24h，检测低氧对细胞miR-612表达的影响。将HK2细胞分为对照组、单纯低氧组（100txmol／LCo处理24h）、低氧＋10nmol／LmiR-612转染组和低氧＋30nmol／LmiR、612转染组，检测各组miR-612的表达，采用Westernblot检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）和上皮钙黏素（E—cad）的表达。预测、验证miR-612的靶基因，并检测miR-612表达水平变化对靶基因蛋白及其下游蛋白表达的影响。结果co造成的低氧处理导致细胞中miR-612表达显著降低（P〈0．05）；Co处理24h，miR-612表达水平下降约80％以上（P〈0．05）。10nmol／LmiR-612转染导致低氧诱导的α-SMA表达水平下降约50％，E-cad的表达水平显著上升，30nmol／LmiR-612转染产生的上述效果更明显。miR-612可靶定WNTl0AmRNA，并抑制WNT10A蛋白及β连环蛋白（β-catenin）的表达。结论MiR-612抑制低氧诱导的肾小管上皮细胞转分化，该作用可能通过抑制WNT10A介导的WNT／β-eatenin通路实现。