AT2R转染表达抑制人肾间质成纤维细胞迁移活性

目的 探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2R)基因表达对人肾间质成纤维细胞 (hRIF)迁移活性的影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制型腺病毒载体 (AdCMV -AT2R) ,转染培养的hRIF ,用流式细胞仪检测AT2R细胞表达率 ,RT -PCR方法检测AT2RmRNA表达。用改良Boyden’s趋化小室和激光共聚焦显微镜检测hRIF迁移活性。结果 构建的AdCMV -AT2R转染培养hRIF表达率为 90 6%。改良Boyden’s趋化小室检测表明 ,迁移细胞数抑制比例最高可达 62 2 % (P <0 0 1) ,激光共聚焦显微镜检测表明 ,转染组F -actin表达明显受抑制。结论 AT2R转染表达可显著抑制hRIF迁移活性 。

补体C5a及受体对人肾间质成纤维细胞增殖的影响及机制研究

目的探讨补体C5a及受体(C5aR)对人肾间质成纤维细胞(human renal interstitial fibroblasts,hRIFs)增殖及纤维化相关因子表达的影响。方法原代培养hRIFs细胞,对细胞进行鉴定后,检测C5aR表达情况;同用C5a和C5aR拮抗剂分别对hRIFs处理后检测细胞增殖、细胞外基质蛋白(fibronectin,Collagen-I)以及转化生长因子-β1(TGF-β1)的蛋白表达情况。结果hRIFs细胞vimentin蛋白表达阳性,desmin蛋白表达阴性,C5aR表达于hRIFs细胞表面。MTS实验结果显示:与对照组相比,C5a纯品(浓度分别为10,15,20nmol/L)刺激后第2h,8h的A值差异无统计学意义(P>0.05),刺激后第24h的A值(0.217±0.037 vs 0.613±0.016,0.793±0.041,0.887±0.039)显著升高,差异有统计学意义(t=4.891,4.211,8.408,均P<0.05)。与C5a纯品组相比,C5a纯品+C5aR拮抗剂组的A值明显降低(0.887±0.039 vs 0.424±0.016),差异有统计学意义(t=8.657,P<0.05)。Western-Blot结果显示,与对照组相比,补体C5a(20nmol/L)刺激后第24h,fibronectin(26091±128 vs 15400±105),Collagen-I(31229±129 vs 24823±136)以及TGF-β1(27855±161 vs 20326±152)蛋白表达水平都有明显增加,差异具有统计学意义(t=4.891,5.820,2.311,均P<0.05)。与C5a纯品组相比,C5a纯品+C5aR拮抗剂组fibronectin(22188±132 vs 26091±128),Collagen-I(27181±113 vs 31229±129)以及TGF-β1(25013±139 vs 27855±161)蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义(t=2.349,1.618,3.774,均P<0.05)。结论补体C5a-C5aR相互作用可导致hRIFs细胞增殖、促纤因子TGF-β1表达升高及细胞外基质蛋白生成增加,对肾间质纤维化具有重要意义。

miR-23b-3p调控肾间质成纤维细胞成骨样分化参与Randall斑形成的机制研究

目的探究miR-23b-3p对肾间质成纤维(hRIFs)细胞成骨样分化和Randall斑形成的影响及其可能机制。方法采用qRT-PCR技术检测草酸钙(CaOx)结石患者Randall斑组织(RP)和接受肾切除术的肾肿瘤患者正常乳头状组织(nRP)的miR-23b-3p和肌细胞特异性增强子因子2C(MEF2C)、成骨标志物人骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)的mRNA表达水平;体外分离、培养hRIFs细胞,将miR-23b-3p过表达质粒pSi-miR-23b-3p及空载质粒pSi-NC和MEF2C慢病毒过表达质粒Lv-MEF2C及空载质粒Lv-NC转染至hRIFs细胞中,并诱导细胞成骨分化14 d;ELISA法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色观察各组细胞矿化结节形成情况;qRT-PCR检测细胞中miR-23b-3p和MEF2C、OCN、OPN、Runx2 mRNA表达水平;Western blot检测细胞中MEF2C蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p与MEF2C的靶向关系。结果①与nRP组比较,RP组中miR-23b-3p低表达,而MEF2C、OCN、OPN和Runx2 mRNA高表达;②hRIFs成骨诱导14 d后,细胞中ALP活性升高,矿化结节形成能力增强,miR-23b-3p表达水平降低,而MEF2C、OCN、OPN和Runx2 mRNA表达水平及MEF2C蛋白表达水平升高;③miR-23b-3p过表达降低成骨诱导后hRIFs细胞中ALP活性,抑制细胞矿化结节形成能力,下调细胞中OCN、OPN、Runx2 mRNA表达水平;④MEF2C过表达可逆转miR-23b-3p过表达对hRIFs细胞成骨分化的抑制作用;⑤MEF2C是miR-23b-3p下游靶基因。结论miR-23b-3p在RP组织及hRIFs细胞成骨样分化过程中低表达,上调miR-23b-3p可抑制hRIFs细胞的成骨样分化,其作用机制可能与靶向沉默MEF2C有关。

转化生长因子β1对人肾间质成纤维细胞组织型转谷氨酰胺酶表达的影响

近年来组织型转谷氨酰胺酶(tTG)在组织纤维化的发生和发展中的作用受到了关注.本实验通过观察TGF-β1对体外培养的人肾间质成纤维细胞tTG表达的影响,探讨TGF-β1与tTG的相互关系及其在肾间质纤维化中可能的作用.