应用基因工程方法制备新型重组人肿瘤坏死因子-α

目的 应用基因工程技术 ,制备一种新型的重组人肿瘤坏死因子 α (novelrecombinanthumantumornecrosisfactor α ,nrhTNF α) ,并对其生物学活性、理化性质进行鉴定 ,为进入临床前研究提供基础。方法 应用PCR技术 ,将hTNF α基因的 5′端 17个氨基酸的编码序列删除 ,基因中Pro8Ser9Asp10 的编码序列用Arg Lys Arg的编码序列取代 ,同时Leu157的密码子被Phe的密码子所取代。将hTNF α突变基因 ,插入原核高效表达载体pBV2 2 0中 ,构建高表达工程菌株。纯化表达产物 ,对连续 3批制备的新型rhTNF α,按人用《重组DNA制品质量控制要点》检定要求进行鉴定。结果DNA序列分析和蛋白质N末端、C末端部分氨基酸序列分析表明 ,nrhTNF α与天然的hTNF α相比较 ,N末端缺失了 7个氨基酸 ,13位氨基酸为Arg Lys Arg ,其后为天然hTNF α 11位以后的氨基酸。 15 7位Leu的密码子被Phe的密码子所取代。产物表达量占菌体蛋白的 6 7.4 %。经 (NH4) 2 SO4沉淀、Q SepharoseF .F .及S SepharoseF .F .柱层析分离纯化后 ,产品的纯度达 99% ,比活性达 1× 10 9IU/mg蛋白。结论成功地制备了nrhTNF ,对连续 3批制备的nrhTNF α按人用《重组DNA制品质量控制要点》检定要求进行鉴定 。

突变型人肿瘤坏死因子-α工程菌发酵培养的实验研究

目的 优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法 通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果 突变型 4 71rhTNF α工程菌在 pH值 7.5的SOC培养基中 ,30℃培养、4 2℃诱导 5h时 ,其表达量最大。而且 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,目的蛋白的表达不受影响。结论 优化了基因重组人突变型 4 71rhTNF α工程菌的发酵和表达的最适条件 ,为进一步开发人突变型 4 71rhTNF

人肿瘤坏死因子-α基因转导绒癌耐药细胞系体外耐药逆转的研究

目的 将人肿瘤坏死因子 alpha(hTNF α)基因导入已建立的绒癌耐药细胞系 ,观察hTNF α基因转导后对绒癌细胞耐药性逆转的体外作用。方法 通过阳离子脂质体将hTNF α基因转导绒癌耐药细胞系 ,用新霉素筛选含hTNF α片段的单细胞克隆 ,用RT PCR方法和细胞免疫组织化学方法 ,检测转导hTNF α基因的耐药细胞中MDR1mRNA和MDR1蛋白 (P gp)表达水平的改变。采用四甲基偶氮唑蓝比色法 ,检测转导hTNF α基因的耐药细胞对足叶乙甙 (VP 16 )的耐药指数。结果 转导hTNF α基因后 ,绒癌耐药细胞中检测出hTNF αmRNA表达 ,转导hTNF α基因在mRNA水平能一定程度的逆转绒癌耐药细胞的MDR1,而在P gp蛋白水平几乎能完全逆转绒癌耐药细胞的MDR1。转导hTNF α基因的细胞的耐药指数明显降低。结论 hTNF α基因转导后 ,可通过调节MDR1的表达 。

人肿瘤坏死因子-α基因转染与干扰素-γ联合应用对舌癌细胞生长的影响

目的 :探讨干扰素_γ(IFN_γ)与人肿瘤坏死因子_α(hTNF_α)基因转染联合应用对舌癌细胞生长的影响。方法 :将培养细胞分为 2组 ,其中一组转染hTNF_α基因 ,另一组不转染 ;再将每一组又分为 5个小组 ,每一小组分别加入IFN_γ ,使其终浓度分别为 0、1、10、10 0、10 0 0U/ml,培养 4 8h后 ,用MTT法测定Tca8113细胞的存活率 ,用免疫细胞化学染色法观察hTNF_α的表达。结果 :单纯加入IFN_γ对舌癌细胞的活性无影响 ;hTNF_α基因转染与IFN_γ联合应用时 ,不同浓度的IFN_γ均有协同hTNF_α基因转染杀伤舌癌细胞的作用 ,而且其抑瘤效应与IFN_γ的浓度呈正相关(r=0 86 7,P <0 0 1) ;与未转染组相比 ,转染组细胞hTNF_α呈明显的高表达。结论

新型基因工程人肿瘤坏死因子-α对小鼠移植性肿瘤生长的抑制作用

目的 观察新型基因工程人肿瘤坏死因子α(nrhT NF α) ,对小鼠移植性肿瘤 (肉瘤S180、肝癌H2 2、黑素瘤B16和Lewis肺癌 )生长的抑制作用。方法以 3种剂量 (37 5、75和 15 0万U/kg体重 )的nrhTNF α肌肉注射小鼠 ,每天 1次 ,连续 8d。通过称量所形成的肿瘤重量 ,观察nrhTNF α对瘤细胞株的抑制作用。结果肿瘤抑制率计算结果显示 ,nrhTNF α对 4株瘤细胞的生长均有较明显的抑制作用 ,且呈剂量依赖关系。另外 ,在剂量相同的情况下 ,nrhTNF α的抑瘤作用明显强于重组人TNF α(rhTNF α)。结论nrhTNF α对小鼠移植性肿瘤生长具有很强的抑制作用。本研究为nrhTNF

新型基因工程人肿瘤坏死因子-α的临床前研究

目的 研究一种新型基因工程人肿瘤坏死因子－α（ｎｒｈＴＮＦ－α）的临床前药理、毒理和药代动力学特性。方法观察ｎｒｈＴＮＦ－α对动物移植性肿瘤的抑制作用、毒副作用（如急性中毒反应和死亡情况，过敏反应，以及对神经系统、呼吸系统、心血管系统、造血系统和免疫系统的影响）及药代动力学变化。结果ｎｒｈＴＮＦ－α具有明显的抑瘤作用且呈剂量依赖性。对动物的急性中毒表现及病理变化与ｒｈＴＮＦ－α相似，未见其他不良反应。结论ｎｒｈＴＮＦ－α的抑瘤作用明显，毒副反应低，具有良好的临床应用前景。

人肿瘤坏死因子-α基因转染对舌癌细胞的抑制作用

目的 :探讨人肿瘤坏死因子_α(hTNF_α)基因转染对舌癌细胞生长的影响。方法 :制备和纯化含hTNF_α基因的穿梭质粒 ,用DOSPER阳离子脂质体介导转染Tca8113舌癌细胞 ,对照组只给予等量的脂质体 ,不加入质粒 ;转染基因 2 4、4 8、72、92h后用ELISA法检测细胞培养上清液中hTNF_α的浓度 ,并用MTT法检测细胞的存活率。结果 :基因转染 2 4、4 8、72、96h后转染组与对照组细胞培养上清液中hTNF_α浓度之间的差异均有显著性 (P <0 0 5 ) ,转染组各个时期浓度均高于对照组 ;MTT法检测相应各时期转染组与对照组平均OD值之间的差异均有显著性 (P <0 0 5 ) ,转染组各个时期平均OD值均低于对照组 ,转染细胞的存活率降低 ,生长受抑制。结论

重组人肿瘤坏死因子-α诱导黏液表皮样癌细胞凋亡

目的 :探讨重组人肿瘤坏死因子 α(rhTNF α)作用于人黏液表皮样癌细胞 (MEC 1 )的效应与机制 .方法 :应用细胞记数、DNA降解片段琼脂糖凝胶电泳观察、电镜观察和细胞周期测定rhTNF α作用后MEC 1细胞的凋亡状况 .结果 :rhTNF α作用于MEC 1细胞后 ,导致细胞存活数目减少 ,大量细胞发生凋亡 ;基因组DNA分解成寡聚核苷酸片段 ,DNA琼脂糖凝胶电泳有梯形条带 ;细胞周期发生改变 ,形态学观察细胞核皱缩 ,染色质边集 .结论 :rhTNF α是通过MEC

人肿瘤坏死因子-α基因转染人胚成肌细胞的表达和分泌研究

目的应用人肿瘤坏死因子_α(hTNF_α)基因转染人胚成肌细胞,观察转染hTNF_α基因后人胚成肌细胞表达和分泌hTNF_α的水平。方法用阳离子脂质体DOSPER介导含hTNF_α基因的穿梭质粒pSV23SHTNF转染人胚成肌细胞;对照组只给予等量的脂质体,不加入质粒。转染基因后24、48、72、96h用免疫组织化学染色观察hTNF_α基因在人胚成肌细胞细胞浆和细胞膜的表达水平,并用ELISA法检测人胚成肌细胞培养上清液中hTNF_α的浓度。结果免疫组织化学染色发现实验组人胚成肌细胞在转染hTNF_α基因后24、48、72、96h均见细胞浆和细胞膜hT NF_α呈强阳性表达,而对照组均呈弱阳性;ELISA检测发现实验组人胚成肌细胞培养上清液中hTNF_α平均浓度在各时期均高于对照组(P<0.05),尤以转染72h后最高,达401.0pg/ml。结论hTNF_α基因转染成肌细胞,可使成肌细胞持续高表达和高浓度分泌hTNF_α,提示可以用hTNF_α基因转染舌癌周围肌细胞,使癌周微环境肌细胞持续表达和分泌高浓度hTNF_α来抑制舌癌向肌深层浸润。

死亡相关蛋白3参与重组人肿瘤坏死因子-α抑制裸鼠胃癌移植瘤的生长

目的观察重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)对荷人胃癌细胞株BGC-823和HGC-27裸鼠移植瘤的生长抑制作用,并检测作用前、后移植瘤中死亡相关蛋白3(DAP3)的表达情况,探讨DAP3在rhTNF-α抑制裸鼠胃癌移植瘤生长中的作用。方法建立荷人胃癌细胞株BGC-823和HGC-27裸鼠移植瘤模型;观察腹腔注射不同剂量的rhTNF-α(0、1、5、10 mg／kg)对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,分别采用Western印迹法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组裸鼠移植瘤中DAP3蛋白和DAP3 mRNA表达情况。结果①腹腔注射5和10 mg／kg的rhTNF-α,裸鼠荷BGC-823和HGC-27移植瘤的瘤重显著低于对照组(P值均<0．05),而1 mg／kg rhTNF-α组与对照组瘤重的差异无显著性(P>0．05)。②腹腔注射5和10 mg／kg的rhTNF-α4周后,荷人胃癌细胞株BGC-823和HGC-27移植瘤中DAP3蛋白表达显著高于1 mg／kg组和对照组;5和10 mg／kg rhTNF-α可使移植瘤中DAP3 mRNA的表达显著升高。结论DAP3参与rhTNF-α抑制荷人胃癌细胞株BGC-823和HGC- 27裸鼠移植瘤的生长作用,推测DAP3为一新的肿瘤治疗位点。

人肿瘤坏死因子-α突变蛋白与活性部位分析

利用基因工程技术 ,可以得到大量的hTNF α突变蛋白 ,它们是研究hTNF α活性部位结构与功能关系的有力工具 ,国外许多学者就此方面做了大量的实验研究。本文就影响hTNF α功能的活性区域和主要氨基酸残基以及N端、C端和二硫键与hTNF α生物活性的关系做一综述。

葡萄糖浓度对转人肿瘤坏死因子-α鱼腥藻IB02培养过程的影响

目的:通过在培养基中添加葡萄糖的方法,提高转基因鱼腥藻的产量和人肿瘤坏死因子(hTNF)-α的表达率。方法:在葡萄糖浓度为0～300mmol/L的范围内,进行了转hTNF-α鱼腥藻IB02的摇瓶混合营养培养,用比浊法和酶联免疫法测定转基因鱼腥藻的生长和hTNF-α的表达。结果:添加葡萄糖的藻液最高生长密度是未添加葡萄糖的3.5倍,且hTNF-α的表达率也提高至4倍。结论:在各种葡萄糖浓度下,葡萄糖的利用都不明显。

2型糖尿病人肿瘤坏死因子-α与胰岛素抵抗的关系

目的探讨2型糖尿病人血清肿瘤坏死因子(TNF-α)与胰岛素抵抗之间的关系。方法用氧化酶法,放免法和酶联免疫法分别测定正常健康人23例,2型糖尿病人22例的空腹血糖、空腹胰岛素、血清TNF-α。计算胰岛素敏感指数(ISI)。结果2型糖尿病人TNF-α水平较正常对照组升高(P<0.01),而ISI较正常组降低(P<0.01)。结论2型糖尿病人TNF-α水平增高与胰岛素抵抗有关,可能参与2型糖尿病的发生和发展。

tk基因/GCV系统联合重组人肿瘤坏死因子-α衍生物治疗鼠脑胶质瘤

目的 研究逆转录病毒介导的tk基因 /GCV系统联合重组人肿瘤坏死因子 α衍生物治疗鼠脑胶质瘤。方法 分别用tk基因 /GCV系统、重组人肿瘤坏死因子 α衍生物和两者联合进行治疗鼠脑胶质瘤 ,在治疗前、治疗后第 8、15、2 1天分别用核磁共振 (MRI)增强测量肿瘤大小 ,观察治疗后生存期。结果 联合tk基因 /GCV系统和重组人肿瘤坏死因子 α衍生物比单用其中一种的治疗效果好。结论 tk基因 /GCV系统联合重组人肿瘤坏死因子 α衍生物能提高鼠脑胶质瘤的治疗效果。

重组人肿瘤坏死因子-α联合环磷酰胺对胶质瘤的作用

目的探讨重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)联合环磷酰胺(CTX)对胶质瘤大鼠的增殖抑制作用及机制。方法通过颅脑注射大鼠胶质瘤C6细胞构建胶质瘤大鼠模型。取60只制备成功的胶质瘤大鼠模型,随机分为4组,每组15只。实验组-1和实验组-2经颈总动脉分别予以注射rhTNF-α10μg·kg-1,CTX 15μg·kg-1,实验组-3先予以经颈总动脉注射rhTNF10μg·kg-1,120 min后,再予以注射CTX 15μg·kg-1,模型组注射等量0.9%NaCl。观察各组大鼠存活周期及肿瘤体积,并检测实验组-2和实验组-3大鼠胶质瘤组织中CTX含量。结果模型组,实验组-1,实验组-2,实验组-3大鼠的存活时间分别为(12.69±2.54),(16.92±2.37),(25.23±2.26),(34.59±3.05) d,肿瘤体积分别为(442.63±16.59),(339.56±42.15),(156.28±23.15),(115.26±20.15) mm3。模型组分别与实验组-1,实验组-2,实验组-3比较,差异均有统计学意义(均P <0.05);实验组-3分别与实验组-1和实验组-2比较,差异均有统计学意义(均P <0.05)。实验组-2和实验组-3大鼠的胶质瘤组织中CTX含量分别为(1.96±0.52),(8.63±2.54)μg·mL-1,差异有统计学意义(P <0.05)。结论 rhTNF-α联合CTX可协同抑制胶质瘤生长,延长大鼠生存期,与rhTNF-α可调节血脑屏障增加瘤组织中CTX含量有关。

重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗老年糖尿病周围神经病变的疗效

目的探讨重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rh TNFR-Fc)对老年糖尿病周围神经病变(DPN)的效果。方法选取老年DPN患者60例,随机分成对照组与治疗组,两组均采取降糖药物降低血糖,对照组以硫辛酸液作为主要注射药品(每天静脉注射1次,剂量0.6 mg),4 w为1个疗程,治疗组在此基础上,注射rh TNFR-Fc,注射2次/w,25 mg/次,连续注入5次,共观察4 w,临床症状的评测采用多伦多临床评分系统(TCSS),观察两者治疗前后TCSS评分的变化;用酶联免疫吸附法检测rh TNFR-Fc治疗前后DPN患者血清肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。结果两组治疗后TNF-α水平明显下降,TCSS评分明显改善(均P<0.05)。治疗组改善情况明显优于对照组(P<0.05)。结论 rhTNFR-Fc对老年DPN患者的治疗有效。

乌头汤及四妙丸对人肿瘤坏死因子-α转基因关节炎小鼠模型的作用研究

目的:探讨乌头汤、四妙丸对人肿瘤坏死因子-α转基因关节炎(Tgtc)小鼠模型的疗效,以反证法验证该小鼠模型的寒热属性,并探讨该模型的病理实质与缺氧诱导因子1α(HIF1α)及热休克蛋白70(HSP70)的关系。方法:32只Tgtc小鼠随机分为对照组、乌头汤组、四妙丸组和来氟米特组,每组8只。连续4周灌胃相应药物,记录各组踝关节变形指数、直径、颜色,进行双踝关节激光散斑血流成像,膝关节核磁共振扫描,血清及滑膜组织HIF1α、HSP70含量,踝关节组织病理及微血管密度(MVD)等检测。结果:与对照组比较,乌头汤组小鼠关节变形及红肿程度、关节表面散斑流速指数、膝关节积液面积、滑膜组织HIF1α含量及MVD计数均显著降低(P<0.05),血清及滑膜组织HSP70表达显著升高(P<0.05),关节病理中软骨层损伤深度及范围、炎症细胞浸润程度显著降低(P<0.01);四妙丸加重了Tgtc小鼠关节炎症状。结论:乌头汤通过改善关节缺氧,抑制HIF1α表达,并促进HSP70释放,减轻滑膜炎症及骨破坏,减缓Tgtc小鼠关节炎进展;Tgtc小鼠关节炎属性偏寒。

内部核糖体结合位点介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体表达质粒的构建及在CHO细胞中的表达

目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术扩增hTNF-α抗体的轻、重链基因,并与IRES基因连接,将连接产物LC-IRES-HC基因克隆至pOptiVEC^(TM)-TOPO~?TA载体,构建单表达载体pOptiVEC-LIH。将单表达载体pOptiVEC-LIH及共转染载体pOptiVEC-HC和pcDNA3.3-LC分别电转至CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选高表达单克隆细胞株,并采用3 L反应罐对高表达株进行补料批次发酵培养。结果经测序鉴定,单表达载体pOptiVEC-LIH构建正确。瞬时转染后,单表达载体pOptiVEC-LIH转染组的抗体表达量明显高于共转染载体p Opti VEC-HC和pcDNA3.3-LC(P<0.05);经稳定转染有限稀释筛选后,共获得132个克隆,其中A值>2.0的克隆有18株,应用3 L反应器补料批次发酵培养,其表达量可达250 mg/L。结论成功构建了三顺反子抗hTNF-α单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行了表达。