人胎儿晶状体上皮细胞增殖及相关因子的动态研究

目的观察增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）及转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）、表皮生长因子（ＥＧＦ）在人胎儿晶状体上皮细胞的表达，并探讨其在晶状体发育中的作用。方法用ＳＰ免疫细胞化学法对４８例人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞进行ＰＣＮＡ，ＴＧＦ－β１，ＥＧＦ免疫细胞化学染色。结果ＰＣＮＡ，ＴＧＦ－β１，ＥＧＦ在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞内均有表达；免疫阳性细胞随着胎龄的增加而减少。ＰＣＮＡ阳性细胞核为桔黄色或棕黄色；ＴＧＦ－β１，ＥＧＦ阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状；经相关分析，ＴＧＦ－β１与ＥＧＦ以及ＴＧＦ－β１，ＥＧＦ与ＰＣＮＡ均呈正相关。结论ＰＣＮＡ，ＴＧＦ－β１，ＥＧＦ在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞内均有表达；ＴＧＦ－β１，ＥＧＦ具有协同作用，共同促进晶状体上皮细胞的增殖。

人胎儿晶状体上皮细胞增殖、凋亡及相关因子的研究

本实验应用TUNEL和免疫组化法，选用人正常胎儿晶状体，分为9，10，12，16，20，24，28，32周，每组6例，观察了晶状体发育过程中，晶状体上皮细胞凋亡率以及PCNA、EGF、TGF-β1的变化，以期为基础医学和临床医学对晶状体研究提供理论依据和形态学资料。PCNA、EGF、TGF-β1在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达，

TGF-β_1、EGF在人胎儿晶状体上皮细胞的表达

目的 :观察转化生长因子 β1(TGF- β1)、表皮生长因子 (EGF)在人胎儿晶状体上皮细胞的表达。方法 :用 SP免疫细胞化学法对 48例人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞进行 TGF- β1、EGF免疫细胞化学染色。结果 :TGF- β1、EGF在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达。TGF-β1、EGF阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状 ;并且阳性细胞随着胎龄的增加而减少。经相关分析 :TGF- β1与 EGF呈正相关。结论 :TGF- β1、EGF在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达 ,并且随着胎龄的增加而减少 ;TGF- β1与 EGF具有协同作用 。

TGF-β_1在人胎儿晶状体上皮细胞的加龄变化

目的 :观察转化生长因子 -β1(TCF-β1)在人胎儿晶状体上皮细胞的表达。方法 :用 SP免疫组织化学法对 4 8例人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞进行 TGF-β1免疫细胞化学染色。结果 :TGF-β1在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达 ;免疫阳性细胞随着胎龄的增加而减少。 TGF-β1阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状。结论

榅桲总黄酮对高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响及作用机制

目的探讨榅桲总黄酮对高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响及作用机制。方法用高糖诱导人晶状体上皮细胞建立细胞损伤模型。取人晶状体上皮细胞加入含有30 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基处理24 h,记为高糖组。用含有5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基处理24 h记为对照组。取人晶状体上皮细胞按照每孔5×10^(3)个接种于96孔板,分别加入含有10 mmol·L^(-1)、20 mmol·L^(-1)、40 mmol·L^(-1)榅桲总黄酮与30 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基处理24 h,记为高糖+低榅桲总黄酮组、高糖+中榅桲总黄酮组、高糖+高榅桲总黄酮组。用Lipofectamine2000转染试剂向人晶状体上皮细胞分别转染anti-miR-NC、anti-miR-370,随后加30 mmol·L^(-1)葡萄糖处理24 h,命名为高糖+anti-miR-NC组、高糖+anti-miR-370组。分别向人晶状体上皮细胞转染miR-NC、miR-370 mimics,加30 mmol·L^(-1)葡萄糖的培养基及40 mmol·L^(-1)榅桲总黄酮处理24 h,记为高糖+榅桲总黄酮+miR-NC组、高糖+榅桲总黄酮+miR-370组。采用ELISA法监测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率,qRT-PCR检测miR-370表达量,Western blot检测凋亡蛋白表达情况。结果与对照组相比,高糖组人晶状体上皮细胞SOD和CAT活性降低,MDA含量升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+低、中、高榅桲总黄酮组人晶状体上皮细胞SOD和CAT的活性升高,MDA含量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组相比,高糖组人晶状体上皮细胞凋亡率,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+低、中、高榅桲总黄酮组人晶状体上皮细胞凋亡率,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。对照组、高糖组、高糖+低榅桲总黄酮组、高糖+中榅桲总黄酮组、高糖+高榅桲总黄酮组人晶状体上皮细胞miR-370表达量分别为1.00±0.00、4.04±0.36、3.22±0.24、2.42±0.23和1.62±0.14,5组比较差异有统计学意义(F=256.138,P<0.05)。与高糖+anti-miR-NC组相比,高糖+anti-miR-370组人晶状体上皮细胞miR-370表达量降低,SOD和CAT活性升高,MDA含量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与高糖+anti-miR-NC组相比,高糖+anti-miR-370组人晶状体上皮细胞凋亡率,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与高糖+榅桲总黄酮+miR-NC组相比,高糖+榅桲总黄酮+miR-370组人晶状体上皮细胞SOD和CAT活性降低,MDA含量、细胞凋亡率、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。结论高糖诱导的人晶状体上皮细胞中miR-370的表达升高,榅桲总黄酮可抑制高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡,其作用机制可能与其能降低miR-370表达有关。

雷帕霉素对人晶状体上皮细胞侵袭、迁移及炎症因子TNF-α、 IL-6、MIP-1α的影响

目的探讨雷帕霉素(RAPA)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人晶状体上皮细胞侵袭、迁移,以及对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)的影响。方法体外培养人晶状体HLE-B3细胞系,分为Con组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+RAPA组、Y组、RAPA+Y组和RAPA+A组。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-6和MIP-1α表达水平;采用Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测上皮间质转化(EMT)相关基因、蛋白的相对表达量;采用蛋白免疫印迹(WB)法测定EMT和转化生长因子-β(TGF-β)/Smads信号通路相关蛋白的相对表达量。结果细胞活力实验结果显示,选择50μmol/L的H_(2)O_(2)作为造模条件进行后续实验,选择20 nmol/L RAPA加入TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761和激活剂SRI-011381进行TGF-β1/Smads信号通路验证实验。与Con组比较,H_(2)O_(2)组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及纤维粘连蛋白(FN)的mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05),E-钙粘蛋白(E-cadherin)的mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+RAPA组和Y组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-cadherin、Vimentin及FN mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05),E-cadherin mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05);与H_(2)O_(2)+RAPA组比较,RAPA+Y组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-cadherin、Vimentin及FN mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05),E-cadherin mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05),RAPA+A组TNF-α、IL-6、MIP-1α表达水平,细胞迁移与侵袭能力,N-cadherin、Vimentin及FN mRNA、蛋白相对表达量,TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05),E-cadherin mRNA、蛋白相对表达量和Smad7蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)。结论RAPA可显著抑制H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮HLE-B3细胞的侵袭、迁移能力,抑制EMT进程,并且缓解炎症反应,其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smads通路的信号转导有关。

长链非编码RNA-P21在过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞损伤中的表达

目的检测过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3生物活性及长链非编码RNA-p21(lncRNA-p21)的表达变化。方法将HLE-B3细胞分为正常对照组和过氧化氢组,分别用正常培养液和含200μmol/L过氧化氢的培养液培养24 h。采用MTS比色法检测细胞活力;采用活性氧试剂盒检测细胞活性氧簇(ROS)的水平;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Caspase-3活性试剂盒法检测细胞Caspase-3活性;采用Western Blot方法检测细胞凋亡相关Bax,Bcl-2蛋白表达;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用EDU增殖试剂盒检测细胞增殖能力;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中lncRNA-p21的表达;采用荧光原位杂交实验法检测细胞中lncRNA-p21的定位。结果过氧化氢组细胞ROS水平为4.65±0.38,明显高于正常对照组的1.00±0.01,差异具有统计学意义(t=16.66,P<0.05)。与正常对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率显著上升,Caspase-3活性增强,凋亡蛋白Bax相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(t=20.69、39.80、12.73,均P<0.05)。与正常对照组相比,过氧化氢组G2期细胞比例明显增多,差异有统计学意义(t=23.10,P<0.05)。过氧化氢组EDU阳性细胞比例为(25.41±6.99)%,明显低于正常对照组的(50.58±9.15)%,差异具有统计学意义(t=6.559,P<0.05)。过氧化氢组lncRNA-p21相对表达量为2.36±0.29,明显高于正常对照组的1.02±0.02,差异具有统计学意义(t=7.893,P<0.05)。荧光原位杂交实验结果显示,lncRNA-p21定位于细胞质中。结论过氧化氢诱导的氧化应激模型中晶状体上皮细胞增殖能力显著降低、凋亡水平显著上升,ROS和lncRNA-p21表达水平升高。lncRNA-p21可能参与晶状体上皮细胞的氧化应激损伤过程。

HSYA对人晶状体上皮细胞系SRA01/04生物学特性的影响

目的探讨羟基红花黄色素A(HSYA)对重组人表皮生长因子(rhEGF)诱导的人晶状体上皮细胞系SRA01/04(HLEC-SRA01/04)增殖、迁移及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法研究时间为2022年6月至2023年9月。不同浓度HSYA溶液处理rhEGF诱导的HLEC-SRA01/04不同时长,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖状态并计算半数抑制浓度值(IC50)。细胞划痕实验与Transwell小室测定不同浓度组细胞的迁移能力。逆转录荧光定量聚合链式反应法(RT-qPCR)与蛋白印迹法(Western Blot)测定不同浓度组细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)及EMT标记物波形蛋白(Vimentin)的mRNA表达水平与蛋白含量。计量资料采用t检验。结果MTT实验结果示:选取20、40、60、80、100μmol/L的HSYA溶液处理5μg/L rhEGF诱导人晶状体上皮细胞24 h后,增殖抑制率分别为(12.1±0.6)%、(19.0±3.8)%、(31.5±2.2)%、(53.7±0.4)%、(70.8±0.3)%,IC50值为(76.520±0.954)μmol/L,48 h增殖抑制率分别为(14.3±3.7)%、(27.4±3.1)%、(42.6±2.7)%、(59.2±2.2)%、(81.0±1.0)%,IC50值为(66.094±2.508)μmol/L,呈明显剂量依赖性。细胞划痕实验结果显示:空白组及0、20、40、70、100μmol/L组的24 h细胞迁移率分别为(46.9±1.8)%、(90.0±1.5)%、(88.4±2.1)%、(43.3±6.6)%、(31.5±16.2)%、(5.82±5.2)%,48 h细胞迁移率分别为(81.1±2.3)%、100%、(95.5±0.1)%、(72.6±3.5)%、(58.5±6.1)%、(37.4±7.1)%。Transwell小室实验结果显示:空白组及0、20、40、70、100μmol/L组的细胞数分别为(171.667±20.407)个、(290.222±24.135)个、(198.667±16.826)个、(161.222±5.981)个、(134.111±6.850)个、(67.444±7.351)个,HSYA对rhEGF诱导人晶状体上皮细胞迁移的抑制呈明显浓度依赖性。RT-qPCR法及Western Blot法结果示:HSYA可明显下调rhEGF诱导的人晶状体上皮细胞内PCNA、Vimentin及mRNA表达水平,呈剂量依赖性。结论HSYA可明显抑制rhEGF诱导的HLEC-SRA01/04增殖、迁移及EMT,可能成为预防后发性白内障的潜在药物。

人参皂苷Rg_(3)对人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的影响

目的探讨人参皂苷Rg_(3)对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的改善作用及对核转录因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)信号通路的调节作用。方法用不同浓度人参皂苷Rg_(3)处理过氧化氢诱导的SRA01/04细胞,用噻唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞存活率。将第3代对数生长期SRA01/04细胞随机分为正常组、氧化损伤组(用200μmol∙mL^(−1)过氧化氢处理)、人参皂苷Rg_(3)低剂量组和人参皂苷Rg_(3)高剂量组(分别用40、80μg∙mL^(−1)人参皂苷Rg_(3)处理6 h,更换培养基后用200μmol∙mL^(−1)过氧化氢处理12 h),用MTT法检测细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用试剂盒检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)的含量,用蛋白印迹法检测Nrf2、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch like epichlorohydrin related protein 1,Keap1)和HO-1蛋白的相对表达量。结果与0μg∙mL^(−1)人参皂苷Rg_(3)组比较,10、20、40、80μg∙mL^(−1)人参皂苷Rg_(3)组的细胞存活率逐渐升高(P<0.05)。与正常组比较,氧化损伤组的细胞存活率、SOD和GSHPx含量以及Nrf2、Keap1和HO-1蛋白相对表达量降低,细胞凋亡率和MDA含量升高(P<0.05);与氧化损伤组比较,人参皂苷Rg_(3)低剂量和人参皂苷Rg_(3)高剂量组的细胞存活率、SOD和GSH-Px含量以及Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的相对表达量升高,细胞凋亡率和MDA含量降低(P<0.05);人参皂苷Rg_(3)低剂量和人参皂苷Rg_(3)高剂量组各项指标水平变化规律相同,人参皂苷Rg_(3)高剂量组更显著(P<0.05)。结论人参皂苷Rg_(3)可抑制过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡,减轻氧化应激损伤,其可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥调节作用的。

PCNA与TGF-β_1胎儿晶状体上皮细胞的表达

目的 :观察增殖细胞核抗原 (PCNA)及转化生长因子 -β1(TGF-β1)在人胎儿晶状体上皮细胞的表达。方法 :用 SP免疫组织化学法对 4 8例人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞进行 PCNA、TGF- β1免疫细胞化学染色。结果 :PCNA、TGF-β1在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达 ;免疫阳性细胞随着胎龄的增加而减少。PCNA阳性细胞核为桔黄色或棕黄色 ;TGF- β1阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的颗粒状或斑块状 ;经相关分析 ,TGF-β1与 PCNA呈正相关。结论 :PCNA、TGF-β1在人胎儿不同胎龄胎晶状体上皮细胞均有表达 ;

蒸馏水处理对体外人晶状体上皮细胞活性的抑制作用

目的研究蒸馏水处理对体外培养的人晶状体上皮细胞(LECs)活性的影响。方法收集2020年5—12月在南京大学医学院附属鼓楼医院确诊为年龄相关性白内障并行超声乳化白内障吸除联合人工晶状体植入术的患者156例156眼,将手术过程中收集的晶状体前囊膜标本156片等分为312小片。采用计算机取随机数法将其中157小片样本分为正常对照组23小片、阳性对照组10小片、平衡盐溶液(BSS)浸泡组61小片和蒸馏水浸泡组63小片,其中正常对照组无任何处理;阳性对照组直接用质量分数4%组织细胞固定液固定;BSS浸泡组中20小片浸泡1 min、21小片浸泡2 min、20小片浸泡3 min;蒸馏水浸泡组中20小片浸泡1 min、23小片浸泡2 min、20小片浸泡3 min。另选取125小片模拟白内障手术过程中的注吸过程,按照上述BSS浸泡组和蒸馏水浸泡组处理相应时间后,用装有BSS的瓶子在70 cm高度冲洗1 min。采用锥虫蓝-伊红染色法检测细胞活力,计算LECs密度、死亡数、死亡率及脱落百分率。将剩余小片分为正常对照组、BSS浸泡组和蒸馏水浸泡1、2、3 min组,其中BSS浸泡组浸泡3 min,其余分组处理同前,光学显微镜和透射电子显微镜下观察各组LECs结构。结果BSS浸泡各组LECs边界清晰,形态与正常对照组相比无明显差异。蒸馏水浸泡各组随时间延长,LECs逐渐胀大,死亡细胞边界不清。各组LECs密度、死亡数和死亡率总体比较差异均有统计学意义(F=13.459、98.918、130.600,均P<0.001),其中蒸馏水浸泡2 min和3 min LECs密度均低于正常对照组,蒸馏水浸泡1、2、3 min组LECs死亡数和死亡率均高于正常对照组,蒸馏水浸泡1、2、3 min组LECs死亡数和死亡率均高于BSS浸泡相同时长组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组,BSS浸泡1、2、3 min组和BSS浸泡联合冲洗组仅检测到少量LECs脱落。浸泡不同时间点,蒸馏水浸泡联合冲洗组LECs脱落明显,且随着蒸馏水浸泡时间的增加,LECs脱落范围增大。各组LECs脱落百分率总体比较差异有统计学意义(F=123.670,P<0.001),其中蒸馏水浸泡组、蒸馏水浸泡联合冲洗组处理不同时间LECs脱落百分率均高于正常对照组,蒸馏水浸泡组随处理时间延长LECs脱落百分率明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。光学显微镜下显示蒸馏水浸泡1、2、3 min组细胞破坏,其中浸泡2 min和3 min组LECs部分脱落。透射电子显微镜下可见蒸馏水浸泡1、2、3 min组细胞溶解破坏,亚细胞器肿胀,细胞间连接破坏;其中浸泡1 min和2 min组细胞与囊膜连接疏松,浸泡3 min组LECs与囊膜部分分离。结论蒸馏水浸泡可导致LECs死亡,其作用强度呈时间依赖性,蒸馏水浸泡联合冲洗可去除晶状体囊膜LECs。

虾青素对晶状体上皮细胞氧化应激损伤的抑制作用及其机制

目的研究虾青素对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导晶状体上皮细胞HLEB-3氧化应激损伤的调控作用及其可能的作用机制。方法将HLEB-3细胞于不同浓度H_(2)O_(2)(0、50、100、200、500、750μmol/L)下培养,噻唑蓝(MTT)法检测细胞抑制率,计算半数抑制浓度(IC50)。将HLEB-3细胞使用不同浓度(0、5、10、20、50μmol/L)虾青素培养,MTT法检测细胞存活率。将HLEB-3细胞分为4个组,其中正常对照组用完全培养基培养、氧化应激组于250μmol/L H_(2)O_(2)培养基中培养,10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组分别于相应浓度虾青素+250μmol/L H_(2)O_(2)培养基中培养,各组均培养24 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用ELISA法检测细胞一氧化氮(NO)浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)活性和丙二醛(MDA)含量;采用Western bolt法检测细胞核核因子E2相关因子2(Nrf2)、细胞质Nrf2和血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白表达。另将细胞分为正常对照-小干扰RNA(NC-siRNA)组、Nrf2-siRNA组、NC-siRNA+虾青素组和Nrf2-siRNA+虾青素组,分别转染NC-siRNA或Nrf2-siRNA,转染后24 h分别于含0或10μmol/L虾青素和250μmol/L H_(2)O_(2)培养基中培养24 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用ELISA法检测细胞NO浓度、SOD活性、GSH活性和MDA含量。结果随着H_(2)O_(2)浓度的增加,HLEB-3细胞抑制率升高,不同浓度H_(2)O_(2)处理细胞的抑制率总体比较差异有统计学意义(F=12.358,P<0.05)。H_(2)O_(2)对HLEB-3细胞的IC50为264.20μmol/L。0、5、10、20、50μmol/L虾青素处理HLEB-3细胞的存活率分别为(100.00±0.00)%,(102.20±1.34)%、(109.50±3.60)%、(115.40±4.13)%和(93.60±2.59)%,后续选取10μmol/L和20μmol/L作为实验剂量。氧化应激组细胞凋亡率为(38.50±2.38)%,高于正常对照组的(9.20±0.24)%,差异有统计学意义(P<0.05);10μmol/L虾青素组细胞凋亡率为(27.60±4.33)%,低于氧化应激组,高于20μmol/L虾青素组的(14.90±1.23)%和正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。氧化应激组细胞中NO浓度、MDA含量高于正常对照组、10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组,SOD、GSH活性低于正常对照组、10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组,差异均有统计学意义(均P<0.05);10μmol/L虾青素组NO浓度、MDA含量高于20μmol/L虾青素组和正常对照组,SOD、GSH活性低于20μmol/L虾青素组和正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组间细胞核Nrf2、细胞质Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=43.512、20.381、31.014、23.435,均P<0.001);正常对照组、氧化应激组、10μmol/L虾青素组和20μmol/L虾青素组细胞质Nrf2蛋白相对表达量逐渐下降,细胞核Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相对表达量逐渐升高,组间两两比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Nrf2-siRNA组和Nrf2-siRNA+虾青素组细胞凋亡率高于NC-siRNA组和NC-siRNA+虾青素组,NC-siRNA组细胞凋亡率高于NC-siRNA+虾青素组,差异均有统计学意义(均P<0.05);Nrf2-siRNA+虾青素组和Nrf2-siRNA组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。Nrf2-siRNA组细胞NO浓度、MDA含量高于NC-siRNA组,SOD、GSH活性低于NC-siRNA组,差异均有统计学意义(均P<0.05);NC-siRNA+虾青素组NO浓度、MDA含量低于NC-siRNA组和Nrf2-siRNA+虾青素组,SOD、GSH活性高于NC-siRNA组和Nrf2-siRNA+虾青素组,差异均有统计学意义(均P<0.05);Nrf2-siRNA+虾青素组细胞NO浓度、SOD和GSH活性及MDA含量与Nrf2-siRNA组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论虾青素能提高晶状体上皮细胞抗H_(2)O_(2)诱导的氧化应激损伤能力,其作用可能是通过活化Nrf2相关信号通路而实现的。

紫外线照射后人晶状体上皮细胞的iTRAQ定量蛋白质组学研究

目的:探索氧化损伤状态下人晶状体上皮细胞(SRA01/04)的蛋白表达变化,以期为年龄相关性白内障(ARC)发病机制的研究提供新的蛋白靶点。方法:将SRA01/04细胞分为实验组和对照组,实验组即细胞通过紫外线(UVB)照射以构建细胞氧化损伤模型,照射时长为10min;对照组即细胞未经任何处理。应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对这两组细胞进行蛋白组测序,以差异倍数>1.2且p<0.05的标准筛选差异表达蛋白(DEPs),并通过基因本体(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库分别对上调和下调显著性前50的DEPs进行功能富集分析,利用Pathway commons构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络。结果:本研究共筛选出552个DEPs。相比于对照组,实验组中上调的DEPs有176个,包括HMGB1、USP1等,下调的DEPs有376个,包括POLR2A、POLR2B等。GO和KEGG富集分析显示上调和下调显著性前50的DEPs参与了多种重要的生物学过程和信号通路。PPI网络提示氧化损伤修复(ODR)相关蛋白在UVB诱导的氧化损伤中可能起关键作用。结论:UVB照射SRA01/04细胞可致多种蛋白,尤其是ODR相关蛋白的表达发生改变,这些研究结果为深入探索ARC发病机制以及研究与治疗靶点相关的蛋白质或通路提供了细胞层面的参考。

2型糖尿病合并白内障患者晶状体上皮细胞中PEDF和VEGF的表达及意义

目的:观察糖尿病合并年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞(LECs)中色素上皮衍生因子(PEDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达水平,探讨糖尿病合并年龄相关性白内障的发病机制。方法:回顾性研究。收集2020-08/2021-04在蚌埠医学院第一附属医院眼科就诊的年龄相关性白内障和2型糖尿病合并年龄相关性白内障患者各30例。所有患者白内障超声乳化术中收取术眼晶状体中央区5.5~6.0mm直径的前囊膜标本,采用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测LECs中PEDF、VEGF蛋白表达水平。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测PEDF、VEGF mRNA的相对表达量。结果:两组患者LECs中均存在PEDF、VEGF的表达,2型糖尿病合并年龄相关性白内障组患者VEGF mRNA相对表达量为1.364±0.062,高于年龄相关性白内障组的1.000±0.0(P<0.01),PEDF mRNA的相对表达量为0.398±0.053,明显低于年龄相关性白内障组的1.000±0.0(P<0.001)。2型糖尿病合并年龄相关性白内障组患者LECs中VEGF和PEDF蛋白表达量为2.053±0.026、0.579±0.045,年龄相关性白内障组为1.680±0.064、1.058±0.007(均P<0.01)。结论:2型糖尿病合并年龄相关性白内障患者LECs中PEDF和VEGF表达水平发生变化,可能与糖尿病患者白内障的发生和发展有关。

ROCK2在ARC中的表达及对晶状体上皮细胞的自噬及氧化损伤的影响

目的探讨Rho激酶2(ROCK2)在年龄相关性白内障(ARC)晶状体前囊膜中的表达及其对H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮细胞自噬及氧化损伤的影响。方法收集2020年6月~2021年4月在我院行超声乳化白内障吸出术的ARC患者20例,获取晶状体前囊膜,并获取眼科标本库中无眼科疾病、眼球结构完整且晶状体透明的正常晶状体前囊膜。免疫组织化学染色和Western blot检测ROCK2蛋白表达;将人晶状体上皮细胞HLE-B3随机分为对照组、H_(2)O_(2)组、sh-NC+H_(2)O_(2)组和sh-ROCK2+H_(2)O_(2)组,转染sh-NC或sh-ROCK2至对应组细胞,并用H_(2)O_(2)处理细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞转染效率,MTT法检测各处理组细胞增殖活性,透射电镜观察细胞内自噬现象,自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染细胞后观察自噬溶酶体和自噬体水平,Western blot检测细胞中自噬相关蛋白表达情况,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)含量。结果与正常组织比较,ARC中ROCK2表达增高(P<0.05);转染sh-ROCK2后成功下调了HLE-B3细胞中ROCK2表达水平(P<0.05);与对照组比较,H_(2)O_(2)处理细胞后,细胞增殖活性显著下降,自噬体明显增多,明显激活了自噬溶酶体和自噬体水平,Beclin-1蛋白相对表达量显著升高,LC3-II/LC3-Ⅰ比值显著上调,ROS水平显著上升,SOD和GSH-Px的活性均显著降低,MDA含量则显著升高(均P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,细胞转染sh-ROCK2后再用H_(2)O_(2)处理,细胞增殖活性显著提高,自噬体减少,自噬溶酶体和自噬体水平受到抑制,Beclin-1蛋白相对表达量显著降低,LC3-II/LC3-Ⅰ比值显著下调(均P<0.05),同时,细胞内ROS水平显著下降,SOD和GSH-Px的活性均显著升高,MDA含量显著降低(均P<0.05)。结论ROCK2在ARC晶状体前囊膜内高表达,下调其表达能够抑制H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮细胞过度自噬,减少氧化损伤。

蒸馏水促进人晶状体上皮细胞(SRA01/04)凋亡并抑制其增殖、迁移、侵袭及转分化能力研究

目的探究蒸馏水(DW)对人晶状体上皮细胞SRA01/04凋亡、增殖、迁移、侵袭及转分化的影响。方法将人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞随机分为5组:对照组(不作处理)、BBS组(BBS处理3 min)、DW 30 s组(DW处理30 s)、DW 1 min组(DW处理1 min)、DW 2 min组(DW处理2 min)、DW 3 min组(DW处理3 min)。除对照组外,其余组加入2 mL细胞培养液终止作用,继续培养24 h。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;5-乙炔基-2’-脱氧尿苷和CCK-8实验检测各组细胞增殖情况;Western blot检测各组凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9及转分化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、纤连蛋白(Fibronectin)、波形蛋白(Vimentin)的表达;细胞划痕实验检测各组细胞迁移情况;Transwell细胞迁移实验检测各组细胞迁移及侵袭情况。使用单因素方差分析(ANOVA)进行多组间的比较,组间两两比较采用Tukey检验。结果随着DW作用时间的逐渐增加,SRA01/04细胞凋亡率逐渐增加;SRA01/04细胞的增殖、迁移及侵袭能力受到明显抑制;SRA01/04细胞促凋亡相关蛋白Bax、Caspase-9表达逐渐增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低;转分化相关蛋白α-SMA、N-cadherin、Fibronectin及Vimentin表达逐渐降低,SRA01/04细胞EMT作用受到抑制。结论DW可以促进SRA01/04细胞凋亡,抑制SRA01/04细胞增殖、迁移、侵袭及转分化能力。

碱性成纤维细胞生长因子基因在胎儿与白内障患者晶状体上皮细胞内表达的比较

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子基因在胎儿和白内障患者晶状体上皮细胞内表达的区别。方法:采用原位杂交方法,用cDNA探针检测胎儿培养及组织切片中的晶状体上皮细胞和白内障患者前囊中的晶状体上皮细胞的bFGF的mRNA,并用图像分析进行相对定量,比较胎儿培养细胞、组织切片细胞及患者囊膜细胞的积分光吸收度值。结果:胎儿的培养及组织切片中晶状体上皮细胞和白内障患者前囊中的晶状体上皮细胞都存在bFGF基因表达。胎儿体外培养晶状体上皮细胞、胎儿组织切片晶状体上皮细胞和白内障患者晶状体上皮细胞积分光吸收度值分别为627.1±268.7,131.5±42.8和79.2±26.3。胎儿体外培养晶状体上皮细胞积分光吸收度值显著高于胎儿组织切片晶状体上皮细胞(P<0.01);白内障患者晶状体上皮细胞积分光吸收度值显著低于胎儿晶状体上皮细胞(P<0.01)。结论:晶状体上皮细胞体外培养可增加bFGF基因表达;胎儿晶状体上皮细胞bFGF基因表达显著高于白内障患者晶状体上皮细胞。

褪黑素对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡及自噬的影响

目的 探讨褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮细胞(LECs)氧化损伤的作用机制。方法 将培养好的人晶状体上皮细胞株(SRA01/04)随机分为对照组(不做任何处理)、H_(2)O_(2)组(400μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)处理)、DMSO+H_(2)O_(2)组(400μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)和0.2μmol·L^(-1)DSMO处理)、褪黑素+H_(2)O_(2)组(400μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)和50μmol·L^(-1)褪黑素处理)。细胞分组处理后继续培养24 h,进行各项实验室检测比较。CCK8实验检测各组细胞活力;免疫印迹实验检测各组细胞凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)以及自噬相关蛋白(P62、Beclin-1、LC3)的表达水平;TUNEL法检测各组细胞凋亡情况。结果 与DMSO+H_(2)O_(2)组相比,褪黑素+H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞活力升高,Bax蛋白表达水平降低(P<0.001), Bcl-2蛋白表达水平增加(P<0.01),SRA01/04细胞凋亡率下降。与DMSO+H_(2)O_(2)组相比,褪黑素+H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中LC3-I、LC3-II及Beclin-1蛋白表达水平均升高(均为P<0.001),P62蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),SRA01/04细胞的自噬能力增强。结论 褪黑素能减轻H_(2)O_(2)诱导的LECs细胞凋亡并增强自噬形成,有望为褪黑素在年龄相关性白内障中的作用机制研究提供新的思路。

吲哚菁绿对人晶状体上皮细胞生物学行为和转分化的抑制作用及其机制

目的研究吲哚菁绿(ICG)对人晶状体上皮细胞(HLECs)生物学行为和转分化的抑制作用及其机制。方法将HLECs细胞系分为空白对照组、5%葡萄糖溶液(GS)组和0.5%、1.5%、2.5%ICG组,分别用平衡盐溶液、5%GS以及0.5%、1.5%和2.5%的ICG溶液处理3 min,然后在新鲜培养基中孵育24 h。采用流式细胞术检测HLECs凋亡水平;采用Western blot法检测HLECs凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)和caspase-9表达水平;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)和5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)法检测HLECs增生过程;采用细胞划痕实验检测HLECs迁移能力;采用Transwell法检测HLECs迁移和侵袭过程。采用Western blot法检测HLECs转分化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、纤维连接蛋白(FN)和波形纤维蛋白(vimentin)表达水平。结果空白对照组、5%GS组、0.5%ICG组、1.5%ICG组和2.5%ICG组细胞凋亡率分别为(4.35±0.60)%、(4.63±0.19)%、(8.17±0.69)%、(13.90±0.33)%和(23.08±1.12)%,总体比较差异有统计学意义(F=412.74,P<0.05),其中0.5%ICG组、1.5%ICG组和2.5%ICG组细胞凋亡率明显高于空白对照组和5%GS组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。0.5%ICG组、1.5%ICG组、2.5%ICG组caspase-3、caspase-9和Bax蛋白相对表达量明显高于空白对照组和5%GS组,1.5%ICG组、2.5%ICG组Bcl-2蛋白相对表达量较空白对照组和5%GS组降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。0.5%ICG组、1.5%ICG组和2.5%ICG组EdU阳性细胞率明显低于空白对照组和5%GS组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。0.5%ICG组、1.5%ICG组、2.5%ICG组细胞生存率明显低于空白对照组和5%GS组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,0.5%ICG组、1.5%ICG组、2.5%ICG组细胞迁移率明显低于空白对照组和5%GS组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Transwell实验结果显示,0.5%ICG组、1.5%ICG组、2.5%ICG组细胞迁移数和侵袭细胞数明显少于空白对照组和5%GS组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。0.5%ICG组、1.5%ICG组和2.5%ICG组α-SMA、N-cadherin和FN蛋白相对表达量明显低于空白对照组和5%GS组,1.5%ICG组和2.5%ICG组vimentin蛋白相对表达量较空白对照组和5%GS组降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论ICG可促进HLECs凋亡,抑制其增生、迁移、侵袭和转分化,并呈浓度依赖性。

Dickkopf-1调控Wnt通路在缺氧诱导的晶状体上皮细胞转分化中的作用

目的:探讨缺氧条件下Wnt/β-catenin通路在晶状体上皮细胞上皮-间充质转化(EMT)中的作用,分析Dickkopf-1(DKK-1)的表达对晶状体上皮细胞EMT的影响。方法:将体外培养人晶状体上皮细胞(HLEB3细胞)分为正常氧培养组(加入含10%FBS的DMEM培养液)和缺氧培养组(加入含100μmol/L CoCl 2溶液的培养液进行缺氧处理6、12、24、48h)。利用免疫荧光染色法检测Wnt3a和DKK-1蛋白的表达及β-catenin蛋白的表达和定位;利用qRT-PCR法检测DKK-1 mRNA的表达。结果:免疫荧光染色结果显示,随着缺氧时间的延长,HLEB3细胞中Wnt3a和DKK-1蛋白表达水平明显上调,β-catenin蛋白在细胞核内积聚逐渐增多。qRT-PCR检测结果显示,与正常氧培养组相比较,缺氧培养6h组细胞中DKK-1 mRNA无显著差异(P>0.05),而缺氧培养12、24、48h组细胞中DKK-1 mRNA表达明显增加(P<0.001)。结论:缺氧可以激活晶状体上皮细胞Wnt/β-catenin通路,并诱导Dickkopf-1的表达,参与调控Wnt/β-catenin通路,影响EMT进程。