人胎盘来源间充质干细胞移植促进肌腱移植物在骨隧道内的愈合

背景:研究表明,人胎盘来源间充质干细胞来源广泛,增殖能力强,其移植对腱-骨愈合有明显的促进作用。目的:进一步验证人胎盘来源间充质干细胞对骨-肌腱结合处愈合的影响。方法:采用贴壁分离筛选法获取人胎盘来源间充质干细胞。30只雄性SD大鼠随机分为2组各15只。建立大鼠骨-肌腱损伤模型,实验组在骨-肌腱结合面注入人胎盘来源间充质干细胞,对照组只注入生理盐水。结果与结论:实验组人胎盘间充质干细胞移植后2,4,6周显微镜观察在腱骨界面有干细胞存在并有较多血管组织再生,并且有部分纤维软骨增生。在移植后4,6周实验组最大拔出载荷显著高于对照组(P<0.05)。说明人胎盘来源充质干细胞可以促进骨-肌腱结合部的早期愈合,提高其生物力学强度。

人胎盘来源间充质干细胞对T淋巴细胞分泌白细胞介素-4和γ干扰素影响的实验研究

目的观察人胎盘来源间充质干细胞对活化的T淋巴细胞分泌白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)能力的影响,推测人胎盘来源间充质干细胞应用于临床治疗多种疾病的可能性。方法分离两个健康人来源的T淋巴细胞,制备混合淋巴细胞培养(MLC)体系。再获取人胎盘来源间充质干细胞,将人胎盘来源间充质干细胞与MLC体系混合共培养。共分为4组,分别是同源T细胞Ⅰ组、同源T细胞Ⅱ组、共培养组、阳性对照组,每组接种10孔。培养72 h。采用ELISA法检测各组细胞培养上清液中IL-4、IFN-γ的含量。结果同源T细胞Ⅰ、Ⅱ组组间细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ比较差异无统计学意义(P>0.05);与同源T细胞Ⅰ、Ⅱ组比较,共培养组和阳性对照组细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ浓度显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与共培养组比较,阳性对照组细胞培养上清液中IL-4浓度显著升高,IFN-γ浓度显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论人胎盘来源间充质干细胞可抑制活化的T淋巴细胞分泌IL-4的能力、促进IFN-γ的能力,胎盘间充质干细胞可能具有促进Th0向Th1细胞分化的作用。

人胎盘来源间充质干细胞对糖尿病孕鼠血清及胎盘组织中相关生化指标的影响

背景:人胎盘来源间充质干细胞能够改善糖尿病鼠及糖尿病孕鼠的血糖水平,但对其血清及胎盘组织中胰高血糖素、脂联素、肿瘤坏死因子α等指标的影响鲜有研究。目的:探究人胎盘来源间充质干细胞对糖尿病孕鼠血清及胎盘组织中胰高血糖素、脂联素、肿瘤坏死因子α等指标的影响。方法:用高脂高糖饮食+低剂量链脲佐菌素注射方法制备糖尿病孕鼠模型,于妊娠第4,11天将第3代人胎盘来源间充质干细胞混悬液0.5 m L(1×10^(10) L^(-1))经尾静脉注入糖尿病孕鼠体内,对照组经尾静脉注射等量生理盐水。于妊娠第20天于腹主动脉抽血,然后行剖宫产术取出胎盘,采用ELISA法检测血清中胰高血糖素、脂联素、肿瘤坏死因子α水平;用real-time PCR检测上述指标在胎盘组织中的表达。结果与结论:(1)人胎盘间充质干细胞第4天干预组与人胎盘间充质干细胞第11天干预组孕鼠血清胰高血糖素、脂联素、肿瘤坏死因子α水平差异无显著性意义(P>0.05),胎盘组织中胰高血糖素、脂联素、肿瘤坏死因子αm RNA表达量差异无显著性意义(P>0.05);(2)与生理盐水第4天干预组相比,人胎盘间充质干细胞第4天干预组孕鼠血清脂联素水平明显升高,差异有显著性意义(P<0.05);人胎盘间充质干细胞第4天干预组孕鼠胎盘组织中胰高血糖素的m RNA表达量明显降低,差异有显著性意义(P<0.05);(3)与生理盐水第11天干预组相比,人胎盘间充质干细胞第11天干预组孕鼠血清胰高血糖素水平和胎盘组织中胰高血糖素的m RNA表达量均明显降低,差异有显著性意义(P<0.01),而肿瘤坏死因子α水平明显升高,差异有显著性意义(P<0.01);(4)结果表明,人胎盘间充质干细胞能够影响糖尿病孕鼠脂联素、胰高血糖素水平,从而为胎盘间充质干细胞改善糖尿病孕鼠血糖的可能作用机制提供进一步研究思路。糖尿病孕鼠于妊娠早期或晚期给予胎盘间充质干细胞对上述指标无明显影响。

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞(MSCs),研究人胎盘来源MSCs(HPMSCs)和大鼠骨髓来源MSCs(BMSCs)的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表达阳性率;用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。

人胎盘来源间充质干细胞对妊娠期高血压病细胞滋养细胞凋亡的影响:随机对照实验方案

背景:细胞滋养细胞凋亡增加、浸润能力下降是妊娠期高血压病发病的重要环节之一。人胎盘来源间充质干细胞已经在许多研究中显示出了对损伤的修复作用,而且胎盘间充质干细胞还具有一定的内分泌功能,可通过自分泌或旁分泌细胞因子的方式作用于近、远处的组织。因此,尝试移植人胎盘来源间充质干细胞修复损伤的滋养细胞功能,进而治疗妊娠期高血压病,有一定可行性。方法/设计:随机对照细胞学实验。收集人胎盘来源间充质干细胞培养液,过滤后即为人胎盘来源间充质干细胞条件培养基。培养人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞,随机分为3组,对照组在培养液中加入体积分数15%正常孕妇血清;妊娠期高血压病模型组在培养液中加入体积分数15%子痫前期重度患者的血清;人胎盘来源间充质干细胞条件培养组在培养液中加入体积分数15%子痫前期重度患者血清培养24 h后,更换为体积分数15%子痫前期重度患者血清+人胎盘来源间充质干细胞条件培养基。采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。讨论:实验从人胎盘来源间充质干细胞对妊娠期高血压病细胞滋养细胞功能的影响入手,可能为妊娠期高血压疾病的治疗找到一条细胞移植之路。伦理批准:研究方案取得沈阳医学院附属中心医院临床研究伦理委员会的书面批准。正常及子痫前期孕妇签署知情同意书。

Bio-oss骨粉对人胎盘来源间充质干细胞体外成骨活性影响的研究

目的:研究人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)与Bio-oss骨粉结合后的增殖分化情况,探讨以人胎盘源干细胞(HPMSCs)作为种子细胞,Bio-oss骨粉作为支架材料联合构建组织工程化生物衍生骨的可能性。方法:无菌条件下分离培养人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)并检测其分化能力。将细胞分为单独培养组与复合Biooss骨粉培养组。观察细胞与支架材料结合情况并在细胞形态特点、增殖分化能力方面将两组细胞进行比较。结果:人胎盘源间充质干细胞与Bio-oss骨粉复合培养后,细胞形态、增殖分化能力与对照组人胎盘源间充质干细胞无明显差异。结论:以人胎盘源干细胞(HPMSCs)为种子细胞、Bio-oss骨粉为支架复合培养构建组织工程化衍生骨是可行的。

人胎盘来源间充质干细胞的生物学性能及体外生物相容性

背景:目前作为骨组织工程的种子细胞主要是骨髓间充质干细胞,但其在骨髓中的含量极低,只有0.001%-0.01%,同时分离纯化难度大。目的:探讨人胎盘来源间充质干细胞的生物学性能及与三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架的生物相容性。方法:人胎盘来源间充质干细胞进行形态学观察和流式细胞仪鉴定;将人胎盘来源间充质干细胞经成骨、成脂、成软骨诱导分化培养3周,进行茜素红S、油红O、甲苯胺蓝染色,鉴定其多向分化潜能。将人胎盘来源间充质干细胞接种于三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架,通过DAPI染色、扫描电镜观察人胎盘来源间充质干细胞在支架表面的黏附情况。结果与结论:(1)人胎盘来源间充质干细胞呈长梭形,大小均匀一致;(2)人胎盘来源间充质干细胞高表达CD29,CD90等干细胞表面标志,不表达CD45,CD106等造血细胞表面标志;(3)诱导培养3周后,茜素红S染色可以看到红色的矿化结节,油红O染色观察到红色的脂滴,甲苯胺蓝染色可以看到软骨细胞染成蓝色;(4)DAPI染色、扫描电镜均观察到人胎盘来源间充质干细胞在支架表面能很好地黏附,可以作为组织工程良好的种子细胞。

体外诱导人胎盘来源间充质干细胞向肝细胞分化

背景:间充质干细胞是治疗肝功能衰竭的重要细胞来源,将其诱导分化为肝细胞后能提高肝功能衰竭的治疗效果。目的:探讨胎盘组织来源间充质干细胞在体外诱导分化为成熟肝细胞的可行性,为其用于肝功能衰竭治疗奠定基础。方法:从人胎盘组织中分离培养人胎盘来源间充质干细胞,采用流式细胞分析、多向诱导分化等方法鉴定。应用多细胞因子将胎盘间充质干细胞向肝细胞诱导分化22 d,采用免疫荧光染色检测肝细胞标志物的表达变化,糖原染色检测细胞的糖原合成能力。结果与结论:①倒置显微镜下可见分离培养的细胞为梭形或成纤维细胞样细胞,增殖迅速,传10代后细胞形态未见明显变化;②流式细胞分析结果显示CD73、CD90、CD105、CD44、CD166、CD29、CD54、HLA-ABC在胎盘间充质干细胞中阳性率超过95%,而CD34、CD45、CD117、CD14、CD19、CD133、CD31、HLA-DR均为阴性;③经成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化后,油红O、茜素红、阿辛蓝染色均为阳性;④向肝细胞诱导分化22 d后,呈圆形或多角形、细胞界限明显的典型肝细胞形态,免疫荧光染色显示大量细胞表达肝细胞表面标志物白蛋白、细胞角蛋白18、HepPar1、CYP7A1,糖原染色为阳性;⑤结果表明,从人胎盘组织分离培养的细胞为间充质干细胞,人胎盘间充质干细胞在体外可诱导分化为成熟肝细胞,有望为肝功能衰竭治疗提供可靠的肝细胞来源。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

骨粘连蛋白促骨髓来源间充质干细胞成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸中的作用

目的探究骨骼肌分泌的骨粘连蛋白(Osteonectin)促骨髓来源间充质干细胞(BMSC)成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法纳入30例AIS患者,根据X射线片测量的Cobb角,将其分为轻度AIS组和重度AIS组。比较2组患者腰椎和骨骼肌骨密度(BMD)。收集2组患者BMSC,通过流式细胞术检测CD73和CD90蛋白表达,qRT-PCR检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平,ELISA检测碱性磷酸酶(ALP)活性。收集2组患者骨骼肌,检测Osteonectin mRNA和蛋白表达水平。ELISA检测2组患者血清中Osteonectin水平。体外培养BMSC,分为BMSC组(无特殊处理)和BMSC+Osteonectin组(添加Osteonectin),检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平及ALP活性。结果与轻度AIS组比较,重度AIS组患者腰椎和骨骼肌BMD降低(P<0.05),BMSC中Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平降低(P<0.05),ALP活性降低(P<0.05);骨骼肌中Osteonectin mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);血清中Osteonectin水平降低(P<0.05)。与BMSC组比较,BMSC+Osteonectin组细胞Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平升高(P<0.05),ALP活性升高(P<0.05)。结论AIS患者骨骼肌分泌Osteonectin减少,BMSC的成骨分化能力降低。外源性补充Osteonectin可改善BMSC的成骨分化能力,可能有助于AIS病情的恢复。

Osteonectin促进骨髓来源间充质干细胞成骨分化的机制及其与青少年特发性脊柱侧凸的相关性研究

目的 探究Osteonectin在促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的分子机制,以及Osteonectin在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法 将2020年5月—2022年5月就诊的20例AIS及健康体检20例分别作为AIS组和健康组。使用qRT-PCR技术测定2组BMSCs中Osteonectin、BMP2以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Tcf7、Lef1)和成骨分化相关基因(Runx2、Osteocalcin)的表达水平。通过X线检测AIS患者的Cobb角度,并分析上述基因表达水平与Cobb角度的相关性。在BMSCs中,加入Osteonectin和BMP2抑制剂Noggin,并分为对照组、Osteonectin组和Osteonectin+Noggin组。通过qRT-PCR检测BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平。采用ChIP-qPCR检测β-catenin在Runx2和Osteocalcin基因转录起始位(TSS)的富集水平。结果 与健康组比较,AIS组BMSCs中Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平均降低(P<0.05);Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平与AIS患者Cobb角度呈负相关(r=-0.466 3、-0.369 1、-0.272 7、-0.543 4、-0.606 5、-0.343 3,P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,Osteonectin组BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平升高,且β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平增加(P<0.05)。相比Osteonectin组,Osteonectin+Noggin组BMSCs中Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平降低,β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平降低(P<0.05)。结论 在AIS患者中,BMSCs中Osteonectin、BMP2-Wnt/β-catenin的表达以及成骨分化水平与AIS疾病的发展呈负相关。Osteonectin通过激活BMP2-Wnt/β-catenin信号通路,促使β-catenin转录激活成骨分化相关基因,从而促进BMSCs的成骨分化。

不同年龄小鼠骨来源间充质干细胞衰老相关特性与成骨分化能力的比较研究

目的探索不同年龄组小鼠骨来源的间充质干细胞(bone derived mesenchymal stem cells,BMSCs)衰老相关的生物学特性及骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导成骨分化能力的改变。方法将8只C57BL/6J小鼠分为青年组(4周龄,体质量约为10~15 g,n=4)和老年组(12月龄,体质量约为20 g~25 g,n=4),每组雌雄各半。分别从2组小鼠的整骨中提取间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),通过流式细胞术鉴定2组BMSCs的表面标志物,通过β-半乳糖苷酶染色比较2组BMSCs的衰老程度,通过MTT和EdU掺入实验比较2组BMSCs的增殖及自我更新能力。通过Western blot分析2组BMSCs中周期蛋白CyclinD1、P21的表达情况。采用ALP染色和茜素红S染色及RT-qPCR评估2组BMSCs的体外成骨分化能力,使用RNA-seq分析比较2组BMSCs经BMP2诱导后的差异基因表达,并用流式分析验证测序结果。结果流式细胞术分析结果显示,分离培养的小鼠BMSCs符合间充质干细胞判定标准。β-半乳糖苷酶染色结果显示,老年组BMSCs的衰老水平显著高于青年组(P<0.05)。而MTT和EdU掺入实验结果表明,老年组BMSCs的细胞活力和增殖能力显著低于青年组(P<0.05)。Western blot结果显示,与青年组比较,老年组BMSCs的细胞周期蛋白CyclinD1表达水平较低,而细胞周期阻抑因子P21蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。ALP染色和茜素红S染色及RT-qPCR检测结果显示,BMP2诱导后青年组BMSCs的成骨分化能力显著高于老年组(P<0.05)。RNA-seq结果显示,BMP2诱导后,整合素αV重组蛋白(cluster of differentiation 51,CD51)在青年组和老年组中的表达趋势相反。而流式细胞术分析结果显示,青年组CD51^(+)细胞在CD45^(-)细胞中占比明显高于老年组(P<0.01)。结论老年组BMSCs中CD51^(+)细胞在CD45^(-)细胞中占比下降与CD51^(+)细胞对BMP2的成骨诱导响应性下降密切相关。

TGF-β信号通路对牙源性黏液瘤来源的间充质干细胞成骨分化的影响分析

目的探究转化生长因子-β(TGF-β)信号通路对牙源性黏液瘤(OM)来源的间充质干细胞(OMMSC)成骨分化的影响。方法选择2018年至2020年南京大学医学院附属口腔医院收治的OM患者2例,经手术取部分病灶标本进行OMMSC分离培养。另外选择于该院接受牙种植治疗的年轻患者5例,抽取颌骨骨髓进行颌骨骨髓来源的间充质干细胞(JBMSC)分离培养。通过细胞增殖实验、流式细胞术检测、茜素红S染色进行细胞鉴定。成骨培养7 d后通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β信号通路以及成骨相关基因的表达情况。观察小分子药物SB431542及TGF-β1干预对OMMSC、JBMSC成骨分化能力的影响。结果经分离获得的OMMSC、JBMSC具有梭形形态,表达间充质干细胞表面标志物,并具有成骨分化能力,符合间充质干细胞的特征。与JBMSC相比,OMMSC具有更强的增殖能力。RT-PCR检测结果显示,TGF-β/Smad信号相关因子在OMMSC中呈高表达(P<0.05),成骨相关因子骨桥蛋白(OPN)表达降低(P<0.05)。茜素红S染色结果显示SB431542可显著促进OMMSC成骨分化,而TGF-β1对OMMSC成骨分化有抑制作用。结论该研究成功对OMMSC进行了分离,发现TGF-β信号相关因子在OMMSC中呈高表达,抑制TGF-β信号转导通路可增强OMMSC的成骨能力,为改善OM患者骨缺陷提供参考。

胎盘间充质干细胞促进大鼠急性皮肤创面修复

背景:目前已有多种间充质干细胞被证实具有促进创面修复的作用,但胎盘间充质干细胞是否可促进急性皮肤创面愈合目前尚缺乏相关研究。目的:探讨胎盘间充质干细胞移植对大鼠急性皮肤损伤愈合的影响。方法:20只SD大鼠采用随机数字表法分为PBS组、干细胞组,每组10只。所有大鼠建立全层皮肤缺损模型,PBS组、干细胞组于建模后即刻和第8天在创面及创缘分别注射PBS、胎盘间充质干细胞。建模后即刻及2,4,6,8,10,12,14 d观察创面愈合情况,在14 d时取大鼠创面处皮肤组织,进行苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组织化学染色及免疫荧光染色。结果与结论:①各组大鼠创面均随治疗时间延长而缩小,干细胞组14 d时创面愈合率、创面上皮化率高于PBS组(P<0.01),创面挛缩比率低于PBS组(P<0.01);②苏木精-伊红染色结果显示,干细胞组皮肤创面修复优于PBS组,创面上皮化程度更高,胶原纤维形态更接近正常皮肤;③Masson染色结果显示,与PBS组相比,干细胞组皮肤创面组织中胶原纤维明显增多且粗大,新生组织内胶原纤维含量更多(P<0.01);④免疫组化染色显示,干细胞组新生毛细血管数量多于PBS组(P<0.01),而肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的表达低于PBS组(P<0.01);⑤免疫荧光染色显示,干细胞组新生创面内的M2型巨噬细胞数多于PBS组(P<0.01),M1型巨噬细胞数少于PBS组(P<0.01)。结果表明,胎盘间充质干细胞可加速皮肤创面修复、促进创面上皮化、减轻创面挛缩,可能与促进创面内毛细血管新生、调节胶原纤维生成、抑制炎症、调控巨噬细胞向M2型极化有关。

间充质干细胞来源的外泌体治疗器官纤维化的研究进展

器官纤维化是组织损伤后过度修复的结果,与器官衰竭和高死亡率有关,因而寻找有效的治疗纤维化的方法具有重要价值。近年来研究发现间充质干细胞来源的外泌体具有体积小、免疫原性低、无致瘤作用等优势,在抗纤维化方面显示出良好的应用前景。该文综述了间充质干细胞来源的外泌体治疗各种器官纤维化的机制及相关研究进展。

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨子宫内膜来源间充质干细胞抑制子宫内膜纤维化的机制

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路介导间质上皮转化(EMT)在子宫内膜来源间充质干细胞(eMSCs)抑制子宫内膜纤维化中的作用机制。方法将18只雌性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组和eMSCs组,每组6只。Sham组的大鼠在剖腹手术后不接受任何形式的子宫介入手术。Model组和eMSCs组建立子宫内粘连大鼠模型。eMSCs组在模型损伤后立即移植eMSCs细胞悬液进行治疗,总量为每子宫0.05 ml(2×107细胞/ml)。3周后收集单侧损伤子宫进行苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色。通过蛋白质印迹分析子宫内膜纤维化、EMT、Wnt/β-catenin通路蛋白表达。结果Model组大鼠宫腔结构破坏,腺体数量明显减少并积聚大量蓝色胶原纤维,但在eMSCs治疗后子宫内膜腺体数量显著增加,并且纤维化面积显著降低。与Sham组相比,Model组中I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白的表达水平显著增加(P<0.05),但在eMSCs组中均显著减少(P<0.05)。在Model组中,N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表达显著增加,而E-cadherin的表达减少。然而,在eMSCs组中,上述分子蛋白质的变化完全相反。与Sham组相比,Model组β-连环蛋白(β-catenin)和C-myc表达增加(P<0.05)。与Model组相比,eMSCs组中周期蛋白E(CyclinE)、β-catenin和C-myc表达增加(P<0.05)。结论eMSCs可以通过抑制EMT和子宫内膜纤维化来促进子宫内粘连大鼠子宫内膜修复,这种作用部分是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来实现。

胎盘间充质干细胞外泌体通过调控NF-κB信号通路抑制矽肺肺纤维化的进展

目的探讨人胎盘间充质干细胞外泌体(hPMSCs-Exo)对二氧化硅(SiO_(2))诱导小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)肺纤维化(PF)的作用机制。方法采用差速超速离心法提取外泌体,采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)、透射电镜、纳米粒径追踪鉴定外泌体。用MTT实验检测24 h不同浓度SiO_(2)干预MH-S增殖细胞活力影响,结合实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测在MH-S细胞中胶原蛋白Ⅰ型(COL-Ⅰ)和α-平滑肌(α-SMA)的表达,选择SiO_(2)最佳刺激质量浓度进行后续实验。将MH-S细胞分为正常对照(Control)组、SiO_(2)组、SiO_(2)+DMSO组、SiO_(2)+PDTC组,SiO_(2)+DMSO+hPMSCs组、SiO_(2)+PDTC+hPMSCs组、SiO_(2)+DMSO+hPMSCs-Exo组、SiO_(2)+PDTC+hPMSCs-Exo组,采用RT-qPCR检测细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α相对转录水平;采用Western blot检测各组NF-κB信号通路及细胞凋亡相关蛋白表达。结果SiO_(2)刺激MH-S细胞后PF相关基因COL-Ⅰ、α-SMA表达增高,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加,NF-κB通路被激活,其相关蛋白表达量上调,细胞凋亡因子表达量上调(P均<0.01),促进了纤维化的发生;在加入抑制NF-κB信号通路抑制剂PDTC后,NF-κB通路被抑制,其相关蛋白表达量降低,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达降低,PF相关基因COL-Ⅰ、α-SMA表达减弱,细胞凋亡率降低(P均<0.05),PF的发展被抑制。抑制NF-κB通路后移植hPMSCs细胞和hPMSCs-Exo,PF相关基因表达降低,炎症因子释放减少(P均<0.05),抑制了细胞凋亡,PF的发生被有效干预。结论hPMSCs-Exo可能通过调控NF-κB信号通路来抑制矽肺PF的进展。

旋转生物反应器内球形体培养对人胎盘间充质干细胞炎症因子分泌的影响

背景:生物反应器内球形体培养是既能维持间充质干细胞干性又能大规模扩增的体外培养方法,明确其对干细胞免疫调节作用的影响有利于指导临床应用。目的:探讨旋转生物反应器内球形体培养对人胎盘间充质干细胞炎症因子分泌的影响。方法:从人胎盘组织中分离培养人胎盘间充质干细胞,分别进行二维培养和旋转生物反应器培养,利用倒置相差显微镜、免疫组化染色和CCK-8实验观察细胞形态与增殖能力,RT-qPCR和流式荧光法检测多种炎症因子基因表达与蛋白分泌量。结果与结论:①旋转生物反应器内培养的人胎盘间充质干细胞聚集成多细胞球形体,数量与体积逐渐增加;②苏木精-伊红染色可见旋转生物反应器内培养4 d的人胎盘间充质干细胞在球形体内分布均匀,形态正常;③免疫组化染色显示球形体内有大量人胎盘间充质干细胞的细胞核Ki-67阳性;④CCK-8实验结果显示,生物反应器内球形体培养的人胎盘间充质干细胞活力显著高于二维培养的细胞;⑤RT-qPCR和流式免疫荧光法检测结果显示,旋转生物反应器内球形体培养的人胎盘间充质干细胞中白细胞介素1β、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、白细胞介素17、肿瘤坏死因子α和干扰素α的基因表达量和蛋白分泌量显著高于二维培养的细胞;⑥结果表明,旋转生物反应器内球形体培养能显著提高人胎盘间充质干细胞分泌多种炎症因子的能力,加强人胎盘间充质干细胞的免疫调节作用。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用研究

目的:分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用。方法:选择2013年10月—2014年3月河南省洛阳正骨医院实验室试验的78例大鼠为研究对象,应用随机抛球法将大鼠分为手术组(n=26)、对照组(n=26)、外泌体组(n=26)。通过脊髓法建立大鼠脊髓损伤模型后,对照组不作处理,手术组在对照组的基础上实施切开减压术,而外泌体组在对照组的基础上实施全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,应用ExoQuickPrecipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63,在造模1 h后尾静脉给予外泌体移植500μL。分别采用BBB评分、斜板实验在术后1、3、7、14、21、28 d评价大鼠的运动功能恢复情况,并于术后28 d处死试验大鼠,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:术后各时间点手术组大鼠BBB评分高于对照组和外泌体组,术后7、14、21、28 d外泌体组大鼠BBB评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。手术组术后各时间点斜板评分高于对照组及外泌体组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后28 d,手术组的脊髓组织HE染色体等均正常,神经元数目减少。结论:BMSCs外泌体静脉移植对脊髓损伤有明显的改善作用,可以提高患者的运动能力,减轻脊髓损伤,加速脊髓损伤的恢复。

间充质干细胞来源外泌体对HDM刺激的气道上皮细胞炎症及EMT的影响

目的:探究间充质干细胞来源外泌体(MSC-EXO)对屋尘螨(HDM)刺激的气道上皮细胞炎症及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:从人脐带中分离MSCs(hUCMSCs),经过分选和鉴定后分离提取MSC-EXO。透射电镜和Western blot检测外泌体形态及标志蛋白CD63、CD81、TSG101表达。将MSC-EXO与HDM刺激的16HBE细胞共培养后,观察细胞形态变化;MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;qRT-PCR检测细胞炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA水平;荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)水平;Western blot检测EMT相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(VIM)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果:hUCMSC中CD73、CD90和CD105表达呈阳性,CD34、CD45和HLA-DR表达呈阴性;电子透射显微镜下MSC-EXO呈囊泡状,直径30~200 nm,表达CD63、CD81、TSG101。与对照组相比,HDM组16HBE细胞变长、变尖呈长梭形,细胞凋亡率、ROS、TNF-α和IL-6 mRNA水平、N-cadherin、VIM、α-SMA表达显著升高,E-cadherin表达显著降低(P<0.05);与HDM组相比,50、100μg/ml EXO组细胞形态接近正常细胞,细胞凋亡率、ROS、TNF-α和IL-6 mRNA水平、N-cadherin、VIM、α-SMA表达明显降低,E-cadherin表达明显升高(P<0.05)。结论:MSC-EXO可减轻HDM诱导的气道上皮细胞炎症,抑制EMT过程。