透射电镜及激光共聚焦技术观察体外丙型肝炎病毒感染的人胎盘滋养层细胞

目的:探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)的可能性,以及滋养层细胞感染HCV后的超微结构改变.方法:采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞后,以HCVRNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCVRNA,透射电镜观察HCV感染后滋养层细胞的超微结构改变,并用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCVNS5在滋养层细胞中的定位.结果:HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCVRNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCVNS5主要定位于细胞核周;HCV感染后滋养层细胞超微结构发生了明显改变,主要表现为溶酶体大量增生,粗面内质网增生,脂滴减少,出现空泡状结构,并可观察到病毒样颗粒.结论:HCV可以感染滋养层细胞,并导致滋养层细胞的超微结构发生类似黄病毒科病毒感染后的改变.

人胎盘滋养层细胞雌激素α,β受体免疫细胞化学研究

目的:探讨雌激素-α,β型受体（estrogen recoptor α,β）在人胎盘滋养层细胞的表达和定位。方法:采用细胞培养结合免疫细胞化学ABC法。结果:人胎盘及培养的人胎盘绒毛合体、细胞滋养层细胞均呈雌激素α,β受体免疫反应性,雌激素受体免疫反应阳性物质定位于胞核内,细胞质为阴性。结论:人胎盘滋养层细胞存在雌激素α,β受体,这为研究雌激素对人胎盘滋养层细胞的功能调控提供了形态学依据。

激光共聚焦技术证实HCV NS5在人胎盘滋养层细胞的定位表达

目的胎盘屏障是营养物质以及某些药物、病原体、激素等从母体进入胎儿的必经之路。体外分离培养滋养层细胞是研究其功能及母体与胎儿之间物质交换的具体分子机制的细胞学基础。本研究的目的是探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)后HCV NS5在滋养层细胞中的定位表达。方法采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞,以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCV RNA,用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCV NS5在滋养层细胞中的定位。结果HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCV RNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCV NS5主要定位于细胞核周围。结论感染HCV的人滋养层细胞中存在HCV NS5表达。此研究为进一步深入研究HCV的母婴传播分子机制奠定了实验基础。

人原代胎盘滋养层细胞摄取转运模型的建立及氟西汀对胎盘P-gp转运蛋白功能的影响

目的:建立人胎盘滋养层细胞(以下简称"滋养层细胞")转运模型,应用该模型考察氟西汀(fluoxetine,FXT)暴露下外排转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的功能变化,探讨FXT对胎盘转运能力的影响。方法:从足月胎盘中分离、消化、培养得到合胞体滋养层细胞,并从形态学和免疫组织化学等方面对细胞进行鉴定,应用P-gp蛋白的特异性底物罗丹明123及抑制剂维拉帕米对其功能进行评估,确定最适底物浓度及抑制剂浓度,随后采用低、中、高浓度的FXT分别干预滋养层细胞0.5 h、48 h和72 h,应用特异性底物开展细胞摄取实验,考查FXT对P-gp功能、蛋白表达、转录水平的影响。结果:基于人胎盘滋养层摄取转运模型,P-gp底物罗丹明123的最适浓度为1μmol/L,抑制剂维拉帕米的最适浓度为10μmol/L;低、中、高浓度FXT分别干预滋养层细胞0.5 h、48 h和72 h后,P-gp的底物罗丹明123在细胞内蓄积水平升高(P<0.05)。FXT可显著性下调P-gp蛋白表达(P<0.05),但对P-gp mRNA水平无显著影响(P>0.05)。结论:FXT可能通过下调P-gp的蛋白表达而抑制其外排转运功能。

低氧诱导因子-3α对胎盘滋养层细胞生长的影响

目的研究低氧诱导因子-3α(HIF-3α)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo)生物学行为的影响。方法构建人HIF-3α过表达载体(pcDNA3.1-HIF-3α),并筛选HIF-3α抑制剂(HIF-3αsiRNA)最佳靶序列;用2.5μg的pcDNA3.1-HIF-3α质粒和75 pmol/L的HIF-3αsiRNA分别转染HTR8/SVneo细胞作为转染组,同时各自设立阴性转染组。采用EdU法和MTT法检测细胞增殖和细胞活力水平;用细胞流式法检测细胞凋亡水平;并用细胞培养小室(Transwell)法检测细胞浸润和迁移的能力。结果蛋白质印迹法(Western Blot)结果表明成功构建了过表达载体pcDNA3.1-HIF-3α,并筛选到HIF-3αsiRNA#2是最佳抑制靶序列(P<0.05)。EdU实验结果显示,过表达HIF-3α使细胞的增殖显著增强(P<0.05),敲低HIF-3α则使细胞的增殖显著下降(P<0.05)。MTT法检测发现,过表达HIF-3α后细胞活力无显著差异(P>0.05);敲低HIF-3α后细胞活力显著升高(P<0.05)。细胞流式法检测发现,HIF-3α过表达有降低HTR8/SVneo细胞早期凋亡的趋势,但无显著差异(P>0.05);HIF-3α敲低后细胞凋亡无显著差异(P>0.05)。Transwell小室法检测发现,HIF-3α过表达使细胞的迁移以及浸润显著增强(P<0.05),而HIF-3α敲低后细胞的迁移以及浸润显著下降(P<0.05)。结论HIF-3α是调节HTR8/SVneo细胞增殖、迁移和浸润能力的重要因子。

牙龈卟啉单胞菌对人滋养层细胞增殖及凋亡的影响

目的:检测牙龈卟啉单胞菌感染对人胎盘滋养层细胞(HTR-8细胞)增殖以及凋亡的影响。方法:用不同感染复数(MOI)的牙龈卟啉单胞菌体标准菌ATCC 33277体外感染HTR-8细胞,未感染牙龈卟啉单胞菌的HTR-8细胞作为空白对照组。感染后,用Cell Counting Kit(cck-8)检测HTR-8细胞增殖情况,用线粒体膜电位凋亡检测试剂(JC-1)检测HTR-8细胞凋亡情况。结果:MOI=10组,感染72h内,HTR-8细胞增殖未受抑制(P>0.05)。而MOI=100组和MOI=200组,感染24h开始,HTR-8细胞增殖受到明显抑制(P<0.01)。并且与MOI=100组相比,MOI=200组在感染48h(P<0.05)和72h(P<0.01)时,HTR-8细胞增殖明显降低。牙龈卟啉单胞菌感染24h,MOI=200组HTR-8细胞凋亡率显著高于空白对照组(P<0.01)。感染48h,MOI=100组HTR-8细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。MOI=10组在感染24h和48h时细胞凋亡率与空白对照组相比差异无统计学意义。结论:在体外感染模型中,牙龈卟啉单胞菌标准菌ATCC 33277感染可抑制滋养层细胞增殖,且促进其凋亡。提示早产低体重儿与牙龈卟啉单胞菌感染引起滋养层细胞增殖和凋亡失衡有关。

乙型肝炎病毒感染Bewo细胞模型的建立

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)感染人胎盘滋养层细胞系Bewo的细胞模型,为HBV母婴传播过程中胎盘细胞感染机制的研究提供体外细胞模型。方法:选择人胎盘滋养层细胞系Bewo进行体外培养,用高浓度HBV DNA阳性血清(5×106/拷贝.ml-1)与Bewo细胞共培养48 h后,采用选择性PCR技术检测培养细胞中HBVrcDNA和HBVcccDNA。结果:HBV DNA阳性血清与Bewo共培养48 h,Bewo细胞中HBV rcDNA和HBV cccDNA均呈现阳性结果(243 bp和373 bp)。HBVDNA阳性血清与Bewo共培养对细胞形态无明显影响。结论:HBV能够直接感染人胎盘滋养层细胞系Bewo,该细胞系可用于进行HBV母婴传播过程中胎盘细胞感染机制的研究。