人胚神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的研究人胚神经干细胞(hNSCs)移植治疗脑缺血大鼠的效果及其在缺血大鼠脑内的状况.方法从自然流产的孕10～13周的人胚脑组织中分离、培养神经干细胞.采用线栓法制作大鼠脑缺血模型,1 d后经尾静脉移植未分化的hNSCs入脑缺血大鼠体内,对移植后大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS),用免疫组化方法观察移植后hNSCs的存活、迁徙、分化状况.结果从人胎脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球,绝大多数的细胞表达神经干细胞的标记物神经巢蛋白(nestin).hNSCs移植组大鼠自移植后3周末起其NSS显著低于对照组(P＜0.05);移植后2、3、4、5周脑组织切片中均可见5-溴脱氧嘧啶尿苷(Brdu)染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧(P＜0.05),移植后3、4、5周末明显多于移植后2周(均P＜0.05);移植组各时间点脑组织切片中均可见nestin染色阳性细胞;在Brdu阳性细胞群中,73.8%为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性的星形胶质细胞,16.7%为2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)染色阳性的少突胶质细胞,9.5%为神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色阳性的神经元.结论经静脉移植hNSCs能有效改善脑梗死动物的神经功能,hNSCs体内体外均具有多向分化潜能,受缺血部位微环境信号的影响分化成3种主要类型的神经细胞.

人胚神经干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究

目的 建立神经干细胞与骨髓基质细胞的共培养系统,根据该系统的条件性培养液诱导多巴胺能神经元的分化。方法 来源于胎脑海马、纹状体、额叶、中脑的神经干细胞与骨髓基质细胞建立起各自的共培养系统,并根据数种条件性培养液诱导神经干细胞的分化,以免疫细胞化学检测神经元的总体分化率及多巴胺能神经元的诱导率。结果 骨髓基质细胞及CO-BMSC能显著提高不同来源的神经干细胞的神经元分化率,同时只有中脑神经干细胞能被有效地进行多巴胺能神经元的诱导。结论 共培养系统诱发了神经干细胞与骨髓基质细胞的自/旁分泌作用,该作用可根据神经干细胞的区域特异性有效的定向诱导中脑神经干细胞的分化。

细胞因子在脑外伤早期的变化和对人胚神经干细胞的影响

人胚胎来源的神经干细胞在体外成功地得到增殖,并在一定的条件下被诱导分化为神经元。脑损伤早期,脑局部产生影响神经再生的细胞因子,这些细胞因子在体外能影响神经干细胞增殖、分化。

人胚神经干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的实验研究

目的:研究侧脑室注射人胚神经干细胞(hNSCs)移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的有效性及hNSCs在EAE大鼠脑内的状况。方法:从自然流产的孕9～15周的人胚脑组织中分离、培养神经干细胞。用豚鼠全脊髓匀浆免疫Wistar大鼠制备EAE大鼠模型,分别在免疫后10、15、21天经侧脑室注射移植未分化的hNSCs入大鼠体内,观察hNSCs对EAE动物模型神经功能评分、脑内脱髓鞘病灶数目的影响,免疫组化方法观察移植后的hNSCs在EAE大鼠脑内存活、迁徙、分化的状况。结果:从人胎脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球。绝大多数细胞表达神经干细胞的标记物神经巢蛋白(nestin)。hNSCs移植组各时间点大鼠脑组织切片中均可见Brdu、nestin、NSE、GFAP、CNPase染色阳性细胞,CNPase阳性的少突胶质细胞比例随时间的延长而逐渐增多;hNSCs移植组大鼠自免疫后30天起其神经功能评分显著低于对照组(P<0.05);移植后20、30天脑内脱髓鞘病灶数目明显少于对照组(P<0.05)。结论:hNSCs体内体外均具有多向分化潜能,受炎症部位微环境信号的影响分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。hNSCs移植能有效改善EAE动物的神经功能评分,减少病灶数目。

移植维甲酸诱导的人胚神经干细胞在受损大鼠脊髓内的分化及作用

目的 将维甲酸 (RA)诱导的人胚神经干细胞移植入受损的大鼠脊髓内 ,观察大鼠后肢运动功能的变化及细胞的分化情况。方法 实验大鼠 30只遭受脊髓中度损伤后 7天作移植治疗 ,实验组分两组 :一组移植经维甲酸诱导后的细胞 ,另一组移植未诱导的细胞 ;对照组注射等量PBS液。每周一次观察大鼠后肢运动情况 ,移植后 4周 ,应用免疫组化技术检测移植细胞在大鼠脊髓内的生存和分化情况。结果 实验组大鼠脊髓内见许多移植细胞存在 ,部分可分化出神经元样细胞 ,其后肢运动功能优于对照组。其中维甲酸诱导组能分化出神经元样细胞 ,其促进脊髓功能恢复的能力较另一组更强。结论 维甲酸预处理的神经干细胞在体内能替代缺失的神经细胞 ,促进受损的脊髓功能恢复 ,在脊髓损伤的临床治疗中具有潜在的应用价值。

人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态(英文)

背景:研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复。然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程。目的:观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态。设计、时间及地点:免疫组织化学水平的开放性实验,于2007-05/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成。材料:纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供。方法:取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞。通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2d将标有5'-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染。主要观察指标:应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况。结果:5'-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广。移植后1周,脑组织切片见5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞。移植后2周,5'-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞。结论:人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞。

人胚神经干细胞及人脐血干细胞治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的:观察人胚神经干细胞(hNSCs)、人脐血干细胞(hUCBCs)治疗脑缺血大鼠的效果及其在缺血大鼠脑内的增殖、分化情况。方法:从自然流产的孕10～13周的人胚脑组织中分离、培养hNSCs;采集足月新生儿脐带血60～100ml,分离出其中的单个核细胞;治疗前hNSCs、hUCBCs均经5-溴脱氧嘧啶尿苷(BrdU)标记48h。采用线栓法制作大鼠脑缺血模型,1天后经尾静脉注射未分化的hNSCs、hUCBCs至脑缺血大鼠体内,对治疗后大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS),用免疫组化方法观察hNSCs、hUCBCs的存活、迁移、分化状况。结果:从人胚脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球;hUCBCs在体外也具有增殖能力。两治疗组大鼠均自治疗后21天起其NSS显著低于对照组(P<0.05),两治疗组间比较各时间点NSS无显著性差异(P>0.05)。治疗后14、21、28、35天脑组织切片中均可见BrdU染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧(P<0.05),治疗后21、28、35天明显多于治疗后14天(P<0.05);hNSCs组BrdU染色阳性细胞数多于hUCBCs组(P<0.05);治疗组各时间点脑组织切片中均可见nestin染色阳性细胞;在BrdU阳性细胞群中,hNSCs组73.8%为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性细胞,16.7%为2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)染色阳性细胞,9.5%为神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色阳性细胞;hUCBCs组74.5%为GFAP染色阳性细胞,15.4%为CNPase染色阳性细胞,10.1%为NSE染色阳性细胞;两组间差异无显著性(P>0.05)。结论:hNSCs、hUCBCs均具有多分化潜能,受缺血部位微环境信号的影响分化成3种主要类型的神经细胞;静脉注射hNSCs、hUCBCs能有效改善脑梗死大鼠的神经功能评分;除了hNSCs外,hUCBCs也是治疗缺血性脑血管病的一种可能手段。

人胚神经干细胞移植对脊髓横切大鼠后肢运动功能恢复及脊髓再生的观察

目的:观察脊髓横切大鼠人胚神经干细胞移植后功能恢复和神经干细胞的存活和分化情况,以证实其对脊髓损伤后截瘫的治疗作用。方法:从20周人胚胎分离神经干细胞进行鉴定后长期培养,培养了6个月的细胞于移植前48h标记BrdU。成年雌性Wistar大鼠于T11水平行椎板切开术并横切腰段脊髓,单纯随机分为实验组和对照组,各15只。实验组立体定向注射细胞进入两侧脊髓断端中线的4个部位(薄束、楔束、灰质联合及皮质脊髓束),每个部位注射0.5μL,细胞密度为10000个/μL,对照组注射同等量的生理盐水。利用BBB评分客观评价后肢运动功能的恢复。移植3个月后利用双标免疫组化和电子显微镜观察神经干细胞的存活和分化情况。结果:体外培养神经干细胞达到了10个月。移植神经干细胞的截瘫模型大鼠表现为后肢运动功能的逐渐恢复,3个月后BBB评分达到平均13分,对照组评分2.5分,两组差异有非常显著性意义(P<0.01)。细胞在宿主体内存活良好,它们向受伤部位迁移。电镜观察发现移植神经干细胞的大鼠在横切脊髓的部位有再生活跃的髓鞘。结论:人胚胎神经干细胞提供了一种有效的对哺乳动物脊髓损伤修复的策略,可能为脊髓损伤后再生带来新的修复手段。

长期培养人胚神经干细胞对兔脊髓损伤的修复作用

[目的]观察长期培养人胚神经干细胞(hNSCs)的体外生长特性与转染EGFP基因后移植治疗兔脊髓横切损伤模型在体内的生物学活性及对神经结构修复和功能恢复的影响。[方法]体外分离、培养并鉴定hNSCs,用逆转录病毒介导的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)进行转染;制备兔T9全横断脊髓损伤模型;观察hNSCs移植对脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的影响。[结果]从胎龄10～20周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞,该细胞具有连续克隆传代能力,诱导分化后表达分化细胞的特异抗原。本实验室已成功连续培养10个月(17代),转染EGFP基因后,仍保持未分化状态,能够自我更新形成新的神经球;移植入兔SCI模型后,hNSCs能在体内存活、迁移、分化并增殖。与对照组相比,hNSCs移植组明显促进了脊髓神经的再生、结构的修复和下肢运动功能的恢复。[结论]hNSCs移植促进了脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复,是治疗急性脊髓损伤的一种有效方法。

人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活和分化

背景：神经干细胞移植可明显改善受损的神经功能,但在体内外多种因素的影响下,移植的神经干细胞其分化数量和分化方向受到限制。目的：观察人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活、迁移和分化情况。设计、时间及地点：细胞学体内观察,于2007-04/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成。材料：SD雌性大鼠30只,由中国医学科学院实验动物研究提供。流产胎儿由泸州医学院附属医院妇产科提供。方法：取流产胎儿大脑皮质,剪碎后消化离心,过滤后取沉淀细胞重新悬浮,加入含成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、白血病抑制因子的DMEM/F12培养基,体外培养获得人胚神经干细胞。30只大鼠通过结扎颈外动脉建立脑梗死模型,行走时向右侧转圈者为成功模型,剔除5只无上述明显症状的失败模型鼠。于造模后24h,以前囟尾侧0.8mm,中线右外侧1.2mm为注射点,每只大鼠移植行BrdU标记的1×10^9L^-1人胚神经干细胞悬液10μL,深度为硬脑膜下3.0-3.2mm。主要观察指标：免疫组织化学及免疫荧光染色观察植入的人胚神经干细胞在脑梗死区的存活、迁移和分化状态。结果：人胚神经干细胞体外培养48h后聚集成球悬浮生长,传三四代后加入血清诱导可见巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,发出绿色荧光并聚集成球。BrdU阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后第2,4周均可见其在脑梗死区存活并向周围迁移,且第4周时迁移的范围更广。移植后2周,皮质颗粒层和皮质下均见较多的BrdU阳性细胞,且BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞多于BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞;移植后4周脑梗死区BrdU阳性细胞数明显减少,主要存在于脉络丛和微血管中,且BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞。结论：人胚神经干细胞能存活于脑梗死的环境中,并逐渐分化成神经元或星形胶质细胞。移植后期脑实质内存活的神经干细胞明显减少,大量迁移到侧脑室脉络丛和脑表面微血管内,被内皮吞噬系统消化。

人胚神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

目的探讨人胚神经干细胞(hNSC)移植治疗脊髓损伤(SCI)的可行性。方法分离、培养和鉴定hNSC;用5溴2脱氧尿苷嘧啶(BrdU)标记hNSC,并将其移植到14只T10半横断的Wistar大鼠损伤脊髓内(另外14只T10半横断损伤的大鼠作为对照组,仅损伤脊髓内注射DMEM/F12培养液),用BrdU的FITC免疫荧光染色检测移植细胞的存活和迁徙,用NF200、GFAP免疫组织化学鉴定移植细胞的分化,BBB评分评定大鼠功能恢复情况。结果(1)获得了大量的hNSC;(2)用免疫组织化学可以检测到移植的hNSC能在体内长时间存活(达2个月)并向远处迁徙,并分化为神经元和胶质细胞;(3)检测到实验组大鼠BBB得分明显高于对照组大鼠(P<0.01),在SCI后第10周时实验组和对照组BBB得分最大差距达到2.1分。结论hNSC移植能促进SCI大鼠后肢功能恢复,它是SCI移植治疗较有价值的细胞资源。

人胚神经干细胞移植对大鼠脑液压冲击伤的影响

目的 通过人胚神经干细胞 (HNSCs)移植大鼠脑液压冲击伤 (FPI)探讨HNSCs对脑损伤修复的影响。方法 体外培养HNSCs并用 5 溴脱氧尿嘧啶 (BrdU)标记 ,液压冲击大鼠右侧大脑皮质运动感觉区制作脑外伤模型 ,脑外伤后 2 4h移植HNSCs ,分别于脑外伤前、脑外伤后 2 4h、4周行神经运动行为学评分 (NMFE)和检测左下肢的短潜伏期体感诱发电位 (SLSEP)及免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白 (nestin)、微管相关蛋白 2 (MAP2 )、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)和半乳糖脑苷 (GalC)蛋白表达。结果 大鼠液压冲击伤后 2 4h ,左下肢功能障碍明显 ,运动评分14 .3 75 0± 2 .13 3 9,SLSEP潜伏期 3 0 .463± 4.64 0与损伤前相比均差异有显著性 (P <0 .0 1) ,但移植HNSCs组与对照组差异无显著性 ;HNSCs移植后 1周 ,BrdU阳性细胞从移植区域向周围扩散 ,邻片nestin、MAP2和GFAP均为阳性 ,但MAP2阳性细胞较多 ;HNSCs移植后 4周 ,未见nestin阳性细胞 ,液压冲击区域聚集GFAP/BrdU双阳性细胞和MAP2 /BrdU双阳性细胞 ,且GFAP/BrdU阳性细胞较多。结论 HNSCs移植对大鼠脑液压冲击伤的功能恢复无影响 ,但早期HNSCs多数分化为神经细胞 ,晚期多数分化为神经胶质细胞。

角质细胞生长因子促进人胚神经干细胞增殖与分化的实验研究

目的探讨人源性角质细胞生长因子2(human keratinocyte growth factor 2,hKGF-2)对体外长期培养人胚神经干细胞(human neural stem cells,hNSCs)存活和分化的影响。方法将液氮冻存17代hNSCs复苏常规培养7 d形成神经球后,取少许行免疫细胞化学染色鉴定干细胞及分化细胞特异抗原。一部分神经球浓缩后种植至12孔培养板中,分为7组,每组6孔,均添加1 mL基础培养液[含N2(1∶100)、20 ng/mL EGF的DMEM/F12培养基]后,B、C、D、E、F组分别添加10、30、60、90、120 ng/mL KGF-2,G组添加10 ng/mL bFGF,A组为空白对照组;培养7、14 d观察并计数神经球与hNSCs,了解神经球生长与增殖情况。另一部分浓缩后种植至置有多聚赖氨酸包被玻片的6孔培养板内,分为4组,每组6孔,均添加3 mL DMEM/F12培养基后,A1、B1、C1、D1组对应加入N2(1∶100)、N2(1∶100)+90 ng/mL hKGF-2、FBS(1∶20)、FBS(1∶20)+90 ng/mL hKGF-2;培养14 d内观察神经球生长与分化情况。7 d时各取5孔玻片行免疫荧光细胞化学鉴定和流式细胞仪检测,分析神经球的生长与分化状况。结果复苏后培养形成的神经球含大量巢蛋白阳性细胞,充满整个神经球;诱导分化后表达分化细胞特异性蛋白神经丝200(neurofilament200,NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。各组神经球培养7 d后均有不同程度增大;随hKGF-2浓度增加,神经球数量和hNSCs数目均依次增多,呈递增趋势,E、F、G组显著高于A、B、C、D组(P<0.05);B、C、D组间两两比较差异亦有统计学意义(P<0.05);但A、B组间以及E、F、G组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。体外诱导过程中,A1、B1、C1、D1组分化细胞生长旺盛程度呈递增趋势,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);B1组NF-200阳性率显著高于其余3组(P<0.05),GFAP阳性率显著低于其余3组(P<0.05);A1、C1、D1组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养14 d后各组生长均达峰值,以星形细胞为主。结论体外培养17代的hNSCs系纯化hNSCs,hKGF-2能促进其增殖和诱导分化为神经元细胞。

挫伤脑组织对人胚神经干细胞影响的体外研究

目的建立人胚胎来源的神经干细胞体外培养方法,初步研究挫伤脑组织提取液(TBITE)对人胚神经干细胞(HNSCs)存活、增殖能力和分化的影响。方法10周龄左右的胎儿大脑皮层细胞体外培养,神经干细胞增殖2～3代后,剔除生长因子,分别加入不同浓度的脑外伤病人的挫伤脑组织提取液,培养2-3周后,免疫细胞化学方法鉴定细胞分化后的类型。用Laemmli凝胶电泳法分析培养液上清。结果成功获得以神经球形式生长的人胚神经干细胞,Nestin表达阳性;与空白对照相比,TBITE组中的神经干细胞有明显的增殖,并分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着TBITE含量的增加,星形胶质细胞的比例增加。结论脑外伤的局部微环境可促进神经干细胞增殖和分化。

Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程神经干细胞的实验研究

目的:探索以Lentivirus为载体,构建同时携带并表达多基因的基因工程人胚神经干细胞(hum an neu鄄ral stem cell,hNSC)的可行性,为脊髓损伤治疗的研究提供材料。方法:培养和鉴定hNSC;用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)和神经营养因子-3(neurotrophic factor-3,NT-3)的Lentivirus转染hNSC;用荧光显微镜观察、鼠胚背根神经结培养(dorsal root ganglion,DRG)和Slot blot等方法检测基因工程hNSC的多基因表达情况。结果:培养获得了大量的hNSC;荧光显微镜观察到几乎100%的hNSC表达GFP;基因工程hNSC的培养液能促使大鼠DRG旺盛生长;Slot blot检测到基因工程hNSC能高效分泌NT-3蛋白。结论:以Lentivirus为载体能构建同时携带并稳定表达多基因的基因工程hNSC,为脊髓损伤治疗的基础研究及进一步临床应用提供了有价值的细胞资源。

人胚中脑神经干细胞的分离、增殖及分化的研究

目的 探讨人胚中脑腹侧神经干细胞的分离、增殖条件及分化方向。方法 应用表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）使人胚中脑腹侧幼稚细胞维持在未分化状态并促进其增殖;通过克隆分析、细胞增殖曲线及流式细胞仪检测培养细胞的增殖能力;应用免疫组织化学方法鉴定这些细胞的分化方向。结果 该细胞群具有一定的增殖能力,在撤除生长因子后至少能分化为神经元和星形胶质细胞,但未检测到多巴胺能神经元。结论 从人胚中脑腹侧分离出的幼稚细胞具有一定的增殖和自我更新能力,有多向分化潜能,具备中枢神经系统干细胞的一般特征。

脊髓

颅脑外伤合并颈椎和颈髓损伤的诊断,脊髓千细胞移植对脊髓损伤后神经功能的影响,高压氧与脊髓损伤（专家述评）,人胚神经干细胞条件化培养基促进脊髓损伤大鼠皮质脊髓束再生,椎管内淋巴管瘤二例报告并文献复习。