发酵黄芪对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖及衰老相关蛋白表达的影响

目的探讨发酵黄芪对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖及衰老相关蛋白表达的影响。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),并根据代龄和加药情况分为青年组(30代前的HDF细胞),模型组(40代后的HDF细胞),对照组(用10%正常血清处理的40代后的HDF细胞),实验组(用10%发酵黄芪干预血清处理的40代后HDF细胞)。培养至40代时开始干预,光学倒置显微镜观察各组HDF细胞形态;采用活细胞计数(CCK-8)法检测各组HDF细胞增殖情况;采用分光光度法检测各组HDF细胞β-半乳糖苷酶(β-gal)活性;采用蛋白免疫印迹(Wb)法检测各组HDF细胞p16、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的蛋白表达。结果与青年组比较,模型组、对照组及实验组HDF细胞增殖能力及CDK4蛋白相对表达量均显著降低,且实验组高于模型组和对照组(P<0.05);HDF细胞β-gal活性及p16、CyclinD1蛋白相对表达量均显著升高,且实验组低于模型组和对照组(P<0.05),模型组与对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论发酵黄芪可促进HDF细胞增殖,降低β-gal活性,同时抑制衰老相关蛋白的表达,进而发挥抗细胞衰老的作用。

刺五加对人胚肺二倍体纤维母细胞生长的影响

目的 :探讨刺五加 (APS)对人胚肺二倍体纤维母细胞 (2 BS)增殖、凋亡的影响。方法 :采用生物活性法观察不同浓度APS在不同时间对 2 BS细胞增殖的抑制作用 ,利用流式细胞仪检测其诱导 2 BS细胞凋亡小体形成百分率及对细胞周期的影响 ,并与甲基强的松龙 (M- pred)比较。结果 :1APS和 M- pred对 2 BS细胞均有增殖抑制作用 ,与无药空白对照组比较差异有统计学意义 (P <0 .0 1) ,但两药作用相比差异无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ;2 APS和 M- pred均有诱导 2 BS细胞凋亡作用 ,主要作用于 S期 ,2 BS细胞凋亡小体形成百分率与无药空白对照组比较差异均有统计学意义 (P <0 .0 1) ,但两药作用相比差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :APS有显著抑制 2 BS细胞增殖并诱导其凋亡的作用、活性与 M- pred相近 ,但由于 APS尚有多种药理作用而无不良副反应 ,所以是治疗肺纤维化较好的药物。

红景天甙对体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞的影响

本实验采用体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞,从30代开始在培养液中加入红景天甙为实验组、不加红景天甙为对照组。分别观察了两组细胞的形态、增殖速度及对单胺氧化酶(MAO)活性的测定。结果表明,实验组细胞形态、增殖速度均比同代对照组好,MAO活性比对照组低。认为红景天甙对体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞具有一定的抗衰老作用。

淫羊藿苷对人胚肺二倍体成纤维细胞衰老的干预作用研究

目的观察淫羊藿苷对人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)衰老的干预作用与机制,为明确淫羊藿苷作为有效干预衰老的候选中药单体提供实验依据。方法 MRC-5进行体外培养,利用淫羊藿苷进行干预,观察细胞的传代次数;利用β-半乳糖苷酶染色观察衰老细胞阳性率;MTT法检测细胞活力;分别使用单细胞凝胶电泳和流式细胞仪检测H2O2诱导细胞DNA损伤和凋亡变化。结果淫羊藿苷能够延缓MRC-5细胞的复制性衰老,促进细胞增殖,减轻H2O2诱导的细胞DNA损伤,促进受损细胞的凋亡。结论淫羊藿苷能够延缓二倍体细胞的复制性衰老,这可能与其能够减轻细胞DNA损伤有关。

蜕皮激素对人胚肺二倍体细胞增殖的影响

目的 从细胞水平探讨怀牛膝主要活性成分蜕皮激素抗衰老的作用机制。方法 以体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞为材料 ,分为蜕皮激素组和正常对照组 ,相同条件下传代培养 ,以生长曲线、MTT法、3 H- Td R掺入法以及流式细胞仪法观察细胞增殖、细胞周期变化及 DNA合成情况。结果 同一代龄 ,蜕皮激素组细胞增殖数、OD490 值、PI值、CPM掺入量等均明显高于对照组。

烹调油烟挥发性有机物对人胚肺二倍体成纤维细胞活性氧水平的影响

目的:研究烹调油烟挥发性有机物(COF VOCs)对人胚肺二倍体成纤维细胞(HELF)活性氧(ROS)水平的影响。方法:用活性炭采集烹调油烟挥发性有机物,对HELF进行染毒,采用MTT试验测得半数抑制浓度(IC50),设计剂量和暴露时间,设立添加和不添加维生素C组,以2',7'-二氯双氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和双氢罗丹明123(DHR123)进行标记,通过流式细胞术检测细胞ROS水平。结果:COFVOCs刺激HELF12、24、48h的IC50分别是104.9、111.9和127.2μg/mL;HELF胞质内ROS平均荧光强度随COFVOCs剂量增加而增高;线粒体内ROS24、48h暴露于0.8、4μg/mL剂量与阴性对照组相比有统计学差异;维生素C预处理后,ROS平均荧光强度较未预处理时均有所降低,100μg/mL剂量组前后差异有统计学意义。结论:COFVOCs可引起HELF内ROS水平升高,维生素C对细胞的ROS升高有一定的抑制作用。

人胚肺二倍体细胞KMB_(17)凋亡的形态学发生

无血清培养是诱导细胞凋亡的常规方法 ,具有简便、快速的特点 .用光学显微镜、荧光显微镜及透射电镜观察了人胚肺二倍体成纤维细胞 (KMB1 7)在无血清培养过程中细胞凋亡的形态学发生过程 .结果 :无血清诱导后 1h ,光镜下可见致密单层的成纤维状细胞出现疏松状态 ;3h后 ,少数细胞(1%～ 5% )出现圆缩 ;6h后 ,成纤维细胞全部由长梭形收缩为圆形 ,体积缩小 .荧光及电镜下可将细胞凋亡从形态上分为两个阶段 ,第一阶段细胞出现典型的凋亡特征 ,细胞圆缩、出芽、核染色质凝缩、成块状或新月状分布于核膜边缘 ;第二阶段 ,在细胞凋亡晚期出现坏死症状 :电镜下整个细胞崩解成碎片 .结果表明 :无血清培养诱导的凋亡在凋亡的晚期由于营养过度缺乏易出现二次坏死现象 .首次报道用于生物制品生产的人胚肺二倍体细胞在无血清诱导下凋亡发生的形态学特征 .

喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的影响

目的:通过体外实验,初步研究喙尾琵琶甲乙醇提取物A、B、C对人胚肺二倍体成纤维细胞增殖的抑制作用,并比较3种提取物的抑制效果。方法:用浓度为3.9～1 000.0μg/mL的A、B、C提取物作用于体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞,采用MTT(噻唑蓝)法检测3种喙尾琵琶甲乙醇提取物对细胞增殖的影响。结果:高浓度的3种喙尾琵琶甲乙醇提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞的生长均有显著的抑制作用,并且呈时间-剂量-效应的依赖关系。在质量浓度为1 000.0μg/mL、72 h时,A、B、C对细胞的抑制率达到最大,分别为49.87%、50.13%、42.34%,A、B、C抑制细胞增殖的活性差异无统计学意义。结论:喙尾琵琶甲乙醇提取物可显著抑制人胚肺二倍体成纤维细胞的增殖,不同浓度乙醇提取物之间对细胞增殖的抑制作用相差不大。

不同pH值对人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5生长的影响

目的在不同pH值培养液中培养人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5),观察其生长情况,选出最有利于MRC-5细胞生长的pH值范围。方法采用细胞培养技术,分别在pH值为6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6的培养液中培养MRC-5细胞,通过显微技术观察细胞形态、对细胞进行计数,然后对MRC-5细胞的生长情况进行分析比较。结果在不同pH值的培养液中,MRC-5细胞的生长状况不同,细胞数量和细胞形态都有差异,当培养液的pH值为7.2-7.3时,细胞生长形态最好,细胞数量最高可达2.37×106/ml。结论研究表明,培养液的pH值为7.2-7.3时,MRC-5细胞的生长状况最佳。

5，4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮对人肺腺癌细胞及其裸鼠异种移植瘤生长的影响

摘要目的研究金雀异黄素(genistein)衍生物5，4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮(5，4’-Di-n-octoxyl-7-gem-difluoromethylenegenistein，DOdFMG)对人肺癌细胞系(A549)细胞生长的影响及其作用机制。方法MTT比色法测定5，4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮对A549和人胚肺二倍体成纤维细胞(KMB—17)增殖的影响；细胞记数法观察DOdFMG对A549细胞生长曲线的抑制作用；P1染色流式细胞术(FCM)分析DOdFMG对A549细胞凋亡和细胞周期的影响；人肺腺癌(A549)细胞裸鼠异种移植瘤模型治疗实验检测DOdFMG体内抗肺癌作用。结果MTT比色法测定结果显示，DOdFMG对A549细胞增殖有显著抑制作用，呈浓度依赖关系，半数抑制浓度(IC50值)是10．26μmol／L，对KMB-17细胞增殖抑制作用弱，IC50值为163．2μml/L，其对人肺腺癌细胞毒选择指数为15．91。细胞记数法测定结果表明，5，4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮对A549细胞生长具有抑制作用，在10．0／μmol/L浓度下，A549细胞群体倍增时间延长到52．7h(溶媒对照组倍增时间为31、4h)。PI染色FCM分析发现，5，4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮明显使A549细胞周期停滞于G1期(G1期细胞百分数由52．5％上升到74．7％，P<0．05)。裸鼠异种移植瘤治疗实验结果显示，5，4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮对人肺癌异种移植瘤生长具有显著抑制作用，其作用效价强度弱于羟基喜树碱(HCPT)，强于其母体化合物金雀异黄素。结论5，4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮具有体内外抗肺腺癌作用，其机制可能与细胞周期G1期阻滞有关。

山茱萸多糖对HDF细胞β-半乳糖苷酶及p16表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗HDF细胞衰老的作用及其可能的调控机制。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),实验组从40代开始加多糖含药血清,观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,分光光度法检测β-半乳糖苷酶活性,免疫组化法检测p16蛋白的表达。结果衰老组细胞活力下降,β-半乳糖苷酶含量升高,p16蛋白表达阳性细胞数升高;山茱萸多糖可提高细胞活力、降低β-半乳糖苷酶含量,p16蛋白表达阳性细胞数下降。结论山茱萸多糖可通过改变p16的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。

黄芪多糖对衰老HDFβ-半乳糖苷酶活性影响的实验研究

目的探讨黄芪多糖(APS)对衰老人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)衰老相关β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性的影响。方法MTT法测细胞活力;免疫组化法测衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数。结果黄芪多糖可以增强细胞活力,降低SAβ-gal染色阳性细胞数。结论黄芪多糖延缓HDF细胞衰老的机制之一可能是减少了SAβ-gal的表达。

银杏叶总黄酮延缓细胞衰老的实验研究

目的:研究银杏叶总黄酮(total flavone of Ginkgo biloba,FG)延缓人胚肺二倍体成纤维细胞衰老的作用。方法:采用含FG的大鼠血清对人胚肺二倍体成纤维细胞2BS细胞株进行处理,观察2BS细胞寿命;采用荧光实时定量PCR法检测P16基因mRNA的表达。结果:银杏叶总黄酮(FG)能够延长2BS细胞的传代寿命,下调2BS细胞P16基因mRNA的表达。结论:银杏叶总黄酮可通过抑制P16基因表达而延缓细胞衰老。

黄芪多糖对衰老HDF细胞染色体末端限制性片段长度的影响

目的探讨黄芪多糖(APS)改善衰老人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF细胞)衰老表型的机制。方法 HDF细胞连续传代培养,形成衰老细胞模型;采用MTT法检测细胞活力;免疫组化法检测β-半乳糖苷酶活性;DNA杂交法检测染色体末端限制性片段(TRF)长度。结果 APS提高衰老HDF细胞活力(P<0.05),降低了SA-β-gal表达(P<0.05);衰老HDF细胞TRF长度明显缩短(P<0.05),而APS可使TRF缩短速度降低(P<0.05)。结论 APS可以通过减慢TRF缩短速度,提高衰老HDF细胞活力,发挥抗衰老作用。

枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻2BS融合细胞DNA合成的影响

目的 :研究枸杞子、淫羊藿水提液对衰老 -年轻 2BS融合细胞DNA合成的影响。方法 :以人胚肺二倍体成纤维细胞国内标准株 2BS为衰老模型 ,用细胞脱核和细胞融合技术 ,观察枸杞子、淫羊藿对衰老-年轻 2BS融合细胞的DNA合成的影响。结果 :2BS细胞分别在含 0 0 2 5 (V/V)枸杞子、淫羊藿水提液的DMEM培养液中 ,可连续培养至 6 1 0± 2 9、5 6 0± 2 6代 ,对照组为 4 9 0± 2 6代 (P <0 0 1) ;衰老的 2BS细胞分别用枸杞子、淫羊藿水提液处理 2h后 ,进行细胞脱核并与年轻 2BS细胞融合 ,其〔3H〕TdR掺入百分率明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论 :枸杞子、淫羊藿均能促进衰老 -年轻 2BS融合细胞的DNA的合成速率 ,延长 2BS细胞寿命。

补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞增的调控作用

目的 :比较补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞增殖的调控作用。方法 :采用含药血清对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞 2BS细胞株进行处理 ,观察四种中药对细胞寿命、细胞生长曲线、代谢活力 (MTT法 )以及衰老细胞生物学标志衰老相关半乳糖苷酶活力的影响。结果 :补肾和益气方药能够明显延长衰老细胞的传代次数 ,促进细胞增殖 ,使细胞MTT的还原量明显升高 ,抑制细胞衰老相关半乳糖苷酶 (SA β Gal)活力。而健脾、活血方药对细胞增殖的促进作用不明显。 结论 :细胞衰老时增殖变慢 ,活力降低 ,衰老相关半乳糖苷酶活力增高。补肾、益气中药能改善上述衰老变化 ,健脾、活血药作用不明显。

不同浓度山茱萸多糖对HDF细胞衰老的影响

目的研究不同浓度山茱萸多糖对体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)的影响,探讨制备含山茱萸多糖家兔血清的最佳采血时间。方法选择家兔为对象,制备含山茱萸多糖血清,DMEM培养基培养复制性衰老HDF细胞;采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,MTT法检测细胞活力。将HDF细胞分为4组,观察不同浓度含山茱萸多糖家兔血清培养基对衰老HDF细胞细胞活力的影响。结果血清中山茱萸多糖浓度在给药1.5,2,4h明显高于给药0.5、11h(P<0.001),给药2,2.5,3,3.5,4h高于0.5、11h(P<0.01),而在给药48,72h则明显降低(P<0.01)。培养基中加入含山茱萸多糖兔血清(SCP)0.5%、1%和1.5%均能提高衰老HDF细胞活力(P<0.01),细胞衰老表型不明显,其中1%SCP组效果好于0.5%,1.5%组。而2%SCP组和3%SCP组表现明显的细胞生长抑制。结论制备含山茱萸多糖家兔血清最佳取血时间是在给药后1.5～2h或4h,山茱萸多糖抗HDF细胞衰老作用效果最好的是1%含山茱萸多糖兔血清组。

H_2O_2诱导的2BS早老细胞中自噬体增多

自噬在细胞复制性衰老中起着重要的作用.然而,早老细胞中的自噬现象基本无相关的报道.本文通过外源性过氧化氢(H2O2)的诱导,构建人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS细胞)早老模型.首先,通过SA-β-gal染色,验证细胞早老;从形态学和特异标志分子及雷帕霉素作用的靶位点(mTOR)信号通路不同角度检测自噬的变化,其中形态学检测包括丹(磺)酰戊二胺(MDC)自噬分子定量法及电镜自噬超微结构的观察;特异标志分子LC3的检测包括GFP-LC3自噬定位法和免疫印迹法检测LC3;及检测mTOR信号通路下游激酶p70S6蛋白的表达变化.结果表明,过氧化氢诱导的早老细胞中自噬体相对年轻细胞明显增多,且具有保护早老细胞的作用.

人成纤维细胞转录因子Sp1Sp3对p16^(INK4a)基因的调控

p16 INK4a是一种细胞周期蛋白依赖激酶 (cdk)的抑制因子 ,它通过抑制cdk4与cdk6的活性 ,使视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb处于低磷酸化状态 ,从而使细胞阻滞于G1期 .对p16 INK4aATG上游 6 2 2bp片段进行序列分析发现 ,该区域富含GC ,其中有 5个GC盒 (分别命名为GC Ⅰ～GC Ⅴ ) .将上述片段插入到荧光素酶报告载体pGL3 Basic ,分别对 5个GC盒进行点突变后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)发现 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的突变体显著下调p16 INK4a启动子的活性 ,而Ⅲ、Ⅴ位点突变体无明显作用 .电泳迁移率变动分析 (EMSA)证实 ,GC Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅳ能与转录因子Sp1和Sp3结合 ,而且结合条带可被转录因子Sp1和Sp3的抗体所拮抗 .共转染Sp1有助于增加启动子的活性 ,而共转染Sp3则有较弱的抑制作用 ,证明p16 INK4a的转录受到Sp1与Sp3的调控 .