人胚肺成纤维细胞WI-38中AngⅡ信号转导途径的研究

本文采用免疫荧光染色、凝胶阻滞电泳(EMSA)和Western blot等方法,观察AngⅡ刺激人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38细胞前后,细胞中信号转导子和转录激活子STAT3、STAT1的活化状态,进而了解AngⅡ的信号转导通路。结果显示AngⅡ通过其AT1受体诱导WI-38细胞中STAT3、STAT1的磷酸化,形成以磷酸化的STAT3同源二聚体SIF-A为主的复合物,并转位入核与DNA结合,参与调控基因的表达;AngⅡ的作用存在量效及时效效应,10-3mmol/L的AngⅡ刺激60min能最强诱导WI-38细胞STAT3、STAT1的活化。因此JAK/STAT途径参与介导了 An-gⅡ在WI-38中的信号转导。

甘草酸对感染人巨细胞病毒的人胚肺成纤维细胞凋亡和炎性反应的影响

目的 探讨甘草酸对感染人巨细胞病毒(HCMV)的人胚肺成纤维细胞MRC-5增殖、凋亡和炎性反应的影响。方法 体外培养MRC-5细胞,并将其分为对照组、病毒组、更昔洛韦组(50μg/mL)、甘草酸低剂量组(0.25 mg/mL)、甘草酸中剂量组(0.50 mg/mL)、甘草酸高剂量组(1.00 mg/mL)。接种HCMV不同时间后,分别使用CCK8试剂盒检测细胞增殖活性,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)等蛋白表达情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平。结果 CCK8实验结果显示,经HCMV感染48、72 h时,病毒组增殖活性均低于对照组,更昔洛韦组、甘草酸中剂量组、甘草酸高剂量组增殖活性均高于病毒组,差异有统计学意义(P<0.05);甘草酸中剂量组与甘草酸高剂量组增殖活性比较,差异无统计学意义(P>0.05),故选择甘草酸中剂量组(0.50 mg/mL)进行后续实验,并简称甘草酸组。流式细胞仪检测结果显示,经HCMV感染48、72 h时,病毒组细胞凋亡率均高于对照组,更昔洛韦组、甘草酸组则低于病毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,经HCMV感染48 h后,病毒组细胞中Cleaved-caspase3、TNF-α、IL-6蛋白相对表达量均高于对照组,更昔洛韦组、甘草酸组则低于病毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示,经HCMV感染24、48、72 h时,病毒组MRC-5细胞TNF-α、IL-6水平均高于对照组,更昔洛韦组、甘草酸组则低于病毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 甘草酸具有体外抗HCMV效应,可促进感染HCMV的人胚肺成纤维细胞MRC-5增殖,并抑制HCMV感染诱导的细胞凋亡和细胞炎性反应。

p38MAPK信号通路在人胚肺成纤维细胞表达Ⅰ型胶原中的调控作用

目的：探讨p38MAPK信号通路在调控人胚肺成纤维细胞（HELF）增殖和Ⅰ型胶原表达中的作用。方法：收集矽肺患者肺泡巨噬细胞（AM），在体外用含有SiO2的DMEM培养液和不含SiO2的DMEM培养液培养18h，然后收集培养的AM上清液。用该上清培养HELF，WST-1法检测HELF增殖情况，用免疫细胞化学法检测HELF中Ⅰ型胶原的表达。结果：经SiO2刺激的矽肺患者AM培养上清可促进HELF增殖和Ⅰ型胶原的表达（平均A值为0．304±0．032），与空白对照组（平均4值为0．153±0.021）、对照组（平均吸光度值为0．213±0．021）比较增加，差异有统计学意义（P〈0．01）；预处理组加入了10μmol／L p38 MAPK特异性抑制剂SB203580后，HELF增殖能力和Ⅰ型胶原的表达下降（平均A值为0．176±0．020），与处理组相比差异明显（P〈0．01）。结论：经SiO2刺激的矽肺患者AM培养上清可促进HELF增殖和Ⅰ型胶原的表达，p38MAPK信号通路在此过程中起重要的调控作用。

大麻素受体2激动剂对人胚肺成纤维细胞株HLF1增殖和分化的影响及机制

目的探讨大麻素受体2(CB2)激动剂JWH133对人胚肺成纤维细胞株HLF1增殖、分化的影响及机制。方法取对数生长期HLF1细胞株,采用细胞计数试剂-8(CCK8)法检测不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00及20.00μmol/L)JWH133及CB2(0.0、0.5、5.0及50.0μmol/L)拮抗剂AM630对HLF1的增殖能力影响;取对数生长期HLF1细胞分为正常(N)组、5μg/L转化生长因子β1(TGF-β1)组(即0μmol/L JWH133)、10.00μmol/L JWH133(J10)组及J10+5.0μmol/L AM630(AM630)组,培养48 h,采用Western blot和逆转录-聚合酶链反应PCR(RT-qPCR)检测各组细胞中胶原蛋白1α1(Col1α1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、磷酸化-AKT(p-AKT)蛋白及Col1α1、α-SMA mRNA,采用细胞免疫荧光检测各组细胞中α-SMA蛋白荧光信号及应力纤维细胞百分比。结果随着JWH133浓度的增大,HLF1细胞的吸光度(OD)值逐渐降低,0.0、0.5、5.0及50.0μmol/L AM630组HLF1存活率均在1附近(P>0.05);J10组HLF1细胞中Col1α1、α-SMA蛋白及p-AKT表达均较TGF-β1组降低(P<0.05),J10+AM630组则较J10组升高(P<0.05);J10组HLF1细胞Col1α1、α-SMA mRNA均较TGF-β1组降低(P<0.05),J10+AM630组则较J10组升高(P<0.05);J10组HLF1细胞α-SMA蛋白荧光信号及应力纤维细胞占总细胞比值均较TGF-β1组减少(P<0.05),J10+AM630组则较J10组增多(P<0.05)。结论CB2受体激动剂JWH133可抑制HLF1细胞的增殖及分化,其机制可能与下调PI3K-AKT通路有关。

枇杷叶三萜酸对TGF-β_1刺激的人胚肺成纤维细胞转分化及ERK通路的影响

目的研究枇杷叶三萜酸(Triterpene acids of loquat,TAL)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激人胚肺成纤维细胞转分化、胶原合成及ERK通路的影响。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(HFL-Ⅰ),MTT比色法测定TAL对HFL-Ⅰ细胞的增殖抑制率。RT-PCR检测每组中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(CⅠ)、Ⅲ型胶原(CⅢ)mRNA的水平,Western blot检测各组细胞中p-ERK1/2和ERK1/2表达水平。结果 TAL呈剂量和时间依赖性抑制HFL-Ⅰ细胞的增殖(P<0.05),并能够降低CⅠ、CⅢ、α-SMA、CTGF的过度表达(P<0.05);Western blot结果显示TAL能降低TGF-β1刺激组p-ERK1/2的表达,而对ERK1/2的表达没有差异。结论 TAL能抑制HFL-Ⅰ的增殖,同时也能使活化后HFL-Ⅰ中的α-SMA生成减少,CTGF、胶原和p-ERK1/2表达降低。

大蒜新素对HCMV主要即刻早期抗原IE72和IE86在人胚肺成纤维细胞中表达的影响

目的 :研究大蒜新素对人巨细胞病毒 (HCMV)即刻早期抗原 (IEAs)在人胚肺成纤维细胞中表达的影响。方法 :建立HCMVAD16 9毒株 (MOI为 2.5和 0.2 5 )感染细胞模型和大蒜新素 (IC50 和MTC浓度 )干预模型。用WesternBlot检测药物处理后感染细胞中HCMV主要IEAs(IE72和IE86 )表达强度变化 ,并与相应浓度更昔洛韦(GCV)的作用效应相比较。结果 :在高MOI和低MOI感染时 ,不同浓度大蒜新素均能使HCMVIE72和IE86表达强度明显下降 ,对IE86表达的抑制率为IE72的 2倍左右。与GCV相比 ,大蒜新素对IE72的抑制率低于GCV ,而对IE86的抑制效应高于GCV。结论 :大蒜新素明显抑制HCMVIE72和IE86表达 ,对IE86的抑制尤为显著 。

人参皂甙Rb_1、Rg_1、Re和Rh_1对人胚肺成纤维细胞非程序DNA合成的影响

应用３Ｈ－ＴｄＲ和１４Ｃ－ＴｄＲ双标记法，液闪测定不同代龄人胚肺成纤维细胞（２ＢＳ）由丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）诱导的非程序ＤＭＡ合成（ＵＤＳ），以及人参皂甙Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｈ１和Ｒｅ对细胞ＵＤＳ的影响。结果表明，当ＭＭＣ剂量在１０ｎｇ／ｍｌ时，衰老细胞的ＵＤＳ水平下降，而年轻细胞的ＵＤＳ水平显著升高。人参皂甙Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｈ１、Ｒｅ均能显著提高衰老细胞的ＵＤＳ水平，且Ｒｂ１、Ｒｇ１作用更明显。

天然生物材料壳聚糖支架上人胚肺成纤维细胞的生长

采用不同粒度的硅胶粒子作为致孔剂 ,按硅胶和壳聚糖重量比 9∶1,制备了三组不同孔径的壳聚糖多孔支架 .以无孔壳聚糖支架为参照 ,对多孔支架的有效孔径、吸水性进行了比较 .结果表明 :孔径大小由硅胶尺寸控制 ,吸水性随孔径增大而增大 .为研究支架孔径大小对其生物相容性的影响 ,在系列支架上进行了人胚肺成纤维细胞的培养 .细胞种植 1d后 ,多孔支架上的细胞粘附较多 ,而无孔支架上的细胞伸展情况较好 ;细胞培养 5d后 ,所有支架上细胞伸展情况良好 ,孔径越大的支架上细胞增殖越多 .

青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞系HFL-I细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的进一步探讨青蒿琥酯的抗纤维化作用及机制。方法取对数生长期人胚肺成纤维细胞（HELF）系HFL-I细胞株，随机分为观察1—4组及对照组，观察1-4组分别加入质量浓度为4、8、16、32mg／L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液后继续培养。用CCK-8法检测细胞增殖情况（A值），流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率，RT-PCR法测定Survivin mRNA表达。结果观察1-4组G0＋G1期细胞所占比例及细胞凋亡率均显著高于对照组，细胞A值及Survivin mRNA表达均显著低于对照组，且各观察组间亦有显著差异（P〈0．05）。结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用，可能机制为通过下调Survivin mRNA表达抑制HFL-I细胞增殖、促进HFL-I细胞凋亡。

姜黄素对人胚肺成纤维细胞的生长抑制及细胞外基质合成的影响

目的:研究姜黄素对体外培养人胚肺成纤维细胞(HEF-5)MRC-5增殖、胶原表达和周期分布的影响。方法:体外培养MRC-5细胞,用姜黄素处理,分为正常对照组和10、20、30、40、50、60μmol/L姜黄素组。于37℃继续培养24 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,用天狼猩红染色法测定细胞内胶原的表达,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:姜黄素呈剂量和时间依赖性抑制MRC-5细胞的增生(P<0.05),并降低胶原的生成(P<0.05),流式细胞仪检测结果显示,细胞主要停滞于G1期。结论:姜黄素能抑制MRC-5细胞的增殖和胶原的增加,并使细胞周期停滞在G1期,提示姜黄素可能通过抑制MRC-5细胞的增殖来减少细胞外基质积聚,从而发挥其抗肺纤维化的作用。

沙利度胺抑制TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系转分化为肌成纤维细胞

目的研究沙利度胺(THD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-F)向肌成纤维细胞(MF)转分化和对已分化MF的作用。方法体外培养HFL-F,以TGF-β1(5μg/L)诱导HFL-F向MF转分化,通过碱水解法测定羟脯氨酸含量(HYP),免疫印迹法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,半定量RT-PCR测定α-SMAmRNA和Ⅲ型胶原(COLⅢ)mRNA,观察THD(50μg/L)对HFL-F向MF转分化的过程及已分化MF的影响。结果TGF-β1诱导HFL-F 96 h,诱导分化同时加入THD可抑制HYP含量增高和COLⅢ mRNA表达上调(P<0.05),可抑制α-SMA蛋白表达增加,但对于α-SMA mRNA表达没有影响。TGF-β1诱导HFL-F 96 h后再加入THD可抑制COLⅢ mRNA的表达(P<0.05),但对HYP含量、α-SMA蛋白表达量和α-SMA mRNA表达无明显影响。结论TGF-β1可诱导HFL-F向MF转分化,THD可抑制这一过程中α-SMA蛋白与胶原合成。对TGF-β1诱导下已分化的MF,THD可抑制其COLⅢ mRNA的表达。

马立克氏病病毒pp38基因真核表达质粒的构建及其在鸡胚成纤维细胞中的表达

通过 PCR方法扩增马立克氏病病毒 (Marek′s disease virus,MDV) Md11株的 pp38基因 ,并将其克隆到真核表达载体 pc DNA3.1/ zeo(+)中。阳性克隆鉴定后 ,在脂质体作用下转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过间接免疫荧光试验 (IFA)检测到了 pp38在 CEF中的表达。

Fas及FasL和Caspase-3在青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡中的表达(英文)

背景:青蒿琥酯具有减轻肺纤维化的作用,但相关机制的研究罕见报道。目的:探讨青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞凋亡的作用及其与Fas,FasL,Caspase-3表达的关系。方法:用1,10,100mg/L青蒿琥酯分别干预体外培养的人胚肺成纤维细胞。采用CCK-8法检测青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞增殖的影响,流式细胞术测定细胞凋亡率,RT-PCR法测定Fas,FasL,Caspase-3的mRNA的表达。结果与结论:青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制人胚肺成纤维细胞增殖,细胞经青蒿琥酯作用后凋亡率明显增加(P<0.05或P<0.01),Fas,FasL,Caspase-3mRNA的表达显著高于对照组(P<0.05)。结果证实,青蒿琥酯可通过上调Fas,FasL,Caspase-3mRNA的表达抑制人胚肺成纤维细胞增殖、并促进细胞凋亡,发挥抗肺纤维化作用。

青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞系HFL-Ⅰ细胞胶原合成的影响及机制

目的进一步探讨青蒿琥酯对肺纤维化的治疗作用及机制。方法取对数生长期的人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-Ⅰ细胞,随机分为观察1～3组及对照组,观察1～3组分别加入质量浓度为1、10、100 mg/L的青蒿琥酯,对照组加入等体积培养液继续培养。用天狼猩红染色法检测胶原蛋白的分泌水平,RT-PCR法测定Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达。结果观察1～3组胶原表达量、Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达均显著低于对照组,且各观察组间两两比较有显著差异(P均<0.05)。结论青蒿琥酯具有抗纤维化的作用,可在一定程度上降低胶原分泌,其机制可能为下调Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达。

COX-2基因对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞生长及Notch信号通路的影响及其作用机制

目的探讨抑制环氧合酶-2(COX-2)基因表达对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系MRC-5活力、胶原合成和转化及Notch信号通路的影响。方法将MRC-5细胞分为对照组、TGF-β1组、NC组和COX-2-siRNA组,各组细胞处理48 h,Western blotting检测COX-2、胶原合成相关的COL-Ⅰ和COL-Ⅲ、 EMT标志物α-SMA及Notch信号通路受体Notch1及配体Jagged1的蛋白表达;CCK8法检测各组细胞活力。结果 TGF-β1组COX-2的表达显著高于对照组,COX-2-siRNA组COX-2的表达显著低于TGF-β1组(P<0.05),NC组COX-2的表达与TGF-β1组差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,TGF-β1组细胞活力及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、Notch1和Jagged1的蛋白表达均显著升高(P<0.05),与TGF-β1组比较,COX-2-siRNA组细胞活力及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、Notch1和Jagged1的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论抑制COX-2基因表达中可能通过降低MRC-5细胞活力、抑制细胞胶原合成和转化,并下调Notch信号通路,从而对肺纤维化起保护作用。

大蒜新素对人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞凋亡的影响

目的研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)诱导感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)凋亡的动态变化及凋亡调控基因bcl-2和fasmRNA表达的影响。方法用流式细胞术测定HELF在高、低感染复数(MOI分别为2.5、0.25)HCMV感染后1、12、24、36、48、72、96h凋亡细胞比率;大、中、小剂量大蒜新素(9、6和3μg/mL)处理正常的和感染的HELF细胞(MOI为2.5)后上述各时间点凋亡细胞比率。用原位杂交法检测大剂量大蒜新素处理感染细胞(MIO为0.25)72h后bcl-2和fasmRNA表达强度变化,并与正常细胞和感染细胞对比分析。结果正常细胞凋亡比率保持恒定低水平(凋亡率平均2.68%);低、高感染复数感染细胞随时间延长凋亡细胞逐渐增多,凋亡率峰值分别达8.85%(96h)和25.63%(72h);各剂量大蒜新素处理的正常细胞凋亡率增加,呈剂量依赖性,峰值分别为4.88%、6.47%和8.35%;但各剂量药物处理感染细胞后却使细胞凋亡比率下降,大剂量药物处理72h时效应最为明显,凋亡细胞比率由25.63%降至16.24%。正常细胞高表达bcl-2,低表达fas基因;感染HCMV后,bcl-2表达显著下调,fas表达明显增强;大蒜新素处理感染细胞后使bcl-2表达强度明显高于感染细胞,fas表达水平明显低于感染细胞,但仍未恢复到正常细胞水平。结论HCMV是HELF凋亡的强诱导剂;

蜂毒素对人胚肺成纤维细胞生长的抑制作用及其机制探讨

目的研究蜂毒素(melittin)对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)生长的抑制作用及其机制。方法采用MTT法检测蜂毒素对MRC-5细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR法检测细胞中Cyclin D1、CDK4及E2F-1mRNA的表达变化;Western blot法检测Cyclin D1、CDK4、p21及E2F-1蛋白表达。结果与对照组比较,蜂毒素处理组细胞增殖明显受到抑制,并呈剂量和时间依赖性(P<0.05);流式细胞仪检测结果发现,随着浓度的增大,G0/G1期细胞百分比逐渐上升,S期细胞百分比逐渐下降;同时Western blot结果提示蜂毒素(1,2,4 mg.L-1)可以明显降低Cyclin D1、CDK4及E2F-1表达,而上调p21表达。结论蜂毒素能抑制MRC-5细胞增殖,其机制可能与干扰该细胞G0/G1期相关基因的转录相关且抑制Cyclin D1/E2F信号转导。

青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的分子机制研究

目的研究青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-I细胞株体外生长的影响,为青蒿琥酯抗纤维化提供实验依据。方法采用CCK-8法检测青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞的生长抑制作用,用流式细胞术测定细胞凋亡率;RT-PCR法测定Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达。结果青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制HFL-I细胞增殖,HFL-I细胞经青蒿琥酯作用后凋亡率明显增加(P<0.01),Bcl-2 mRNA的表达显著低于对照组,Bax mRNA的表达显著高于对照组。结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用,可能机制为通过下调Bcl-2 mRNA和上调Bax mRNA表达抑制HFL-I细胞增殖,促进HFL-I细胞凋亡。

人胚肺成纤维细胞饲养兔角膜上皮和内皮细胞的体外培养

目的 研究人胚肺成纤维饲细胞体外培养兔角膜上皮和内皮细胞。方法 人胚肺成纤维细胞系细胞，经丝裂霉素Ｃ处理成饲细胞。兔角膜上皮和内皮细胞组织块原代培养，消化接种于人胚肺饲细胞瓶传代培养。体外培养的角膜上皮和内皮细胞行常规病理形态学检查，角膜上皮细胞行角蛋白、内皮细胞行神经烯醇化酶免疫组化染色检测。结果人胚肺成纤维细胞形态均一，易于分辨，经丝裂霉素处理后失去增殖能力。角膜上皮和内皮细胞原代培养５～７天，细胞密集，经人胚肺饲细胞共培养５代，细胞无衰老现象。检测角膜上皮细胞角蛋白、内皮细胞神经烯醇化酶表达阳性，人胚肺饲细胞表达阴性。结论 人胚肺饲细胞能够明显增强角膜上皮和内皮细胞的体外生存能力，提高细胞的增殖能力。

硫酸铍对人胚肺成纤维细胞的细胞毒性和遗传毒性

背景与目的:探讨硫酸铍对体外培养的人胚肺成纤维细胞(HEL-I)的细胞毒性和遗传毒性。材料与方法:用不同浓度的硫酸铍(0.2、2.0、20.0、100.0、200.0μmol/L)作用HEL_I细胞24 h,采用MTT法测定细胞存活情况,用单细胞凝胶电泳(SCGE)和微核实验测定硫酸铍对HEL_I细胞遗传损伤的情况。结果:随着硫酸铍浓度的增加,HEL-I细胞的存活率呈下降趋势,硫酸铍浓度为100.0μmol/L和200.0μmol/L时,存活细胞数低于空白对照组(P<0.05);在2.0～100.0μmol/L浓度范围内,硫酸铍均可诱发HEL-I细胞出现DNA损伤和微核率升高(P<0.05)。结论:硫酸铍对HEL-I细胞具有明显细胞毒性和遗传毒性。