TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2Ae GFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2重组蛋白表达水平。通过His标签纯化试剂盒及Superdex 20010/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白结合情况。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白共定位。利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功。Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用。IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2蛋白具有生物学活性。结论成功构建了TP53BP2基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础。

茶多酚和维生素C对人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤保护作用的比较

目的从细胞水平研究茶多酚(TP)对人胚肾293细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用,并与抗氧化剂维生素C(VC)进行比较。方法采用缺糖培养基并以连二亚硫酸钠消除培养基中的氧,诱导产生缺氧缺糖损伤模型,测定细胞的存活率、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及总抗氧化能力,并计算IC50。结果在细胞损伤模型中,TP和VC均表现出极强的抗氧化能力,TP能显著提高细胞的存活率、SOD活性和总抗氧化能力并抑制LDH的活性,TP的作用均大于VC。结论TP和VC体外具有强大的自由基清除作用,且呈现明显的剂量依赖性,TP在细胞损伤模型中的抗自由基作用均大于VC。

水溶性碳纳米管对人胚肾和肝癌细胞毒性的研究(英文)

研究了聚乙二醇改性碳纳米管(PEG-CNTs)对人胚肾细胞(293T)及人肝癌细胞(HepG_2)的体外细胞毒性。在染毒24、48和72 h后,用水溶性四氮唑法检测不同浓度PEG-CNTs对细胞活性的影响;采用碘化丙啶染色研究不同浓度的PEGCNTs在对HepG_2细胞染毒24 h后死亡细胞染色情况,并用流式细胞术定量测定细胞死亡率。结果表明:水溶性较好的PEGCNTs作用于293T细胞与HepG_2细胞,其毒性存在浓度依赖关系,毒性会随着浓度的升高而增大;根据ISO2109932-5细胞毒性标准,浓度≤100μg/mL时为毒性Ⅰ级,认为PEG-CNTs没有毒性;当浓度为200μg/mL时,毒性变为Ⅱ级,为轻微毒性,说明低剂量的PEG-CNTs对细胞未显示毒性作用;在研究的时间范围内未发现随时间延长而毒性等级的变化。

藤茶活性成分二氢杨梅素对人胚肾细胞和肝细胞增殖的影响

目的探讨藤茶活性成分二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)对人正常细胞增殖的影响。方法体外培养人胚肾细胞(HEK-293)和肝细胞(L-02),MTT法观察DM)Y对其细胞增殖的影响。结果 DMY对HEK-293和L-02细胞的半数抑制浓度(IC_(50))分别为475.3μg/m L和324.8μg/m L,而阳性对照药物顺铂的IC_(50分别为7.4μg/m L和7.7μg/m L。结论藤茶活性成分二氢杨梅素对人正常细胞HEK-293和人L-02细胞具有相对低毒性。

枸杞多糖对顺铂诱导人胚肾细胞凋亡的影响

目的:研究枸杞多糖(LBP)对顺铂(CDDP)所致人胚肾细胞(HEK293)凋亡的影响,并探讨其可能机理。方法:体外培养HEK293,四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法观察LBP对CDDP诱导HEK293细胞生长的影响,流式细胞仪检测LBP对CDDP诱导HEK293细胞凋亡率的变化:Western blotting检测LBP对CDDP诱导HEK293细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:LBP能够拮抗CDDP诱发的细胞毒性,并且随着质量浓度的不同而产生变化。流式细胞仪检测表明随着LBP质量浓度的增加,细胞凋亡率随之减少;Western blotting表明,加入LBP后能够使Bax基因的表达减少而Bcl-2基因的表达增加。结论:LBP对CDDP诱导人胚肾细胞凋亡有抑制的作用,其作用机理可能与其下调Bax及上调Bcl-2蛋白表达有关。

葡萄籽原花青素对顺铂诱导人胚肾细胞凋亡的拮抗作用

目的:探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin,GSPE)对顺铂(cisdiamminedichloroplatinum,CDDP)诱导人胚肾细胞HEK293凋亡及相关凋亡基因的影响,并探讨可能的机制。方法:体外培养正常HEK293细胞,噻唑蓝法测定GSPE、CDD P分别对HEK293细胞生长的影响以及GSPE对CDDP诱导HEK293细胞毒性的保护作用,流式细胞仪测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的变化,Western blotting测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性具有拮抗作用,可减轻CDDP所致HEK293细胞凋亡,减弱Bax表达、增强Bcl-2表达。结论:GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡具有拮抗作用,其机制可能与GSPE降低促凋亡基因Bax,升高抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。

Lipocalin-2基因表达产物对人胚肾细胞增殖的影响

目的构建Lipocalin-2(Lcn-2)基因真核表达质粒PL-2,并检测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响。方法利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增Lcn-2基因,克隆入真核表达质粒pEGFP-C1中,构建重组质粒PL-2。转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基因的表达。将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Westernblot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。结果重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确。经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达。加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响。结论已成功构建了Lcn-2基因真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋白对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖。

表达心脏SCN5A基因的人胚肾细胞钠电流特性及其对钠通道阻滞剂的反应性

目的利用人胚肾293细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并研究其钠电流特性和对钠通道阻滞剂的反应性。方法野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于人胚肾293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录给药(氟卡尼与利多卡因)前后的钠电流。结果 SCN5A基因转染效率约为60%;测试电压为-40mV时记录到钠电流峰值大小约为-8nA;100μmol/L的氟卡尼轻度抑制钠电流,使钠电流峰值减少(21.1±4.6)%[(-435.8±30.5)pA/pF vs.(-343.9±27.1)pA/pF,P<0.01];氟卡尼使钠通道激活曲线和失活曲线均呈负向移动,改变的幅值分别是-6.08mV[(-51.88±1.20)mVvs.(-57.96±0.79)mV,P<0.05]和-9.08mV[(-94.12±0.13)mVvs.(-103.20±0.11)mV,P<0.05];1Hz和10Hz频率刺激时,氟卡尼使钠电流分别减少(64.5±10.7)%和(83.5±12.2)%(P<0.01);30μmol/L利多卡因使钠通道失活后快恢复时间常数和慢恢复时间常数分别延长2倍和3倍。结论表达心脏钠通道SCN5A基因的人胚肾293细胞模型可用于基因特异性的钠通道阻滞剂安全性与药效学筛查。

非折叠蛋白质应答对人胚肾细胞293A迁移特性的影响

为了研究非折叠蛋白质应答对器官发生的影响 ,应用衣霉素诱导非折叠蛋白质应答并观察其对人胚肾细胞系 2 93A迁移特性的影响。在实验中 ,应用划痕法对细胞迁移进行观察 ,并应用细胞黏附实验、荧光染色技术、扫描电镜技术及免疫印迹实验分别对细胞黏附特性、微管及微丝、细胞表面边缘的突起及小分子GTPase的表达水平进行研究。结果表明 ,非折叠蛋白质应答可以抑制细胞迁移 ,进一步的研究发现 ,非折叠蛋白质应答可以降低细胞的黏附能力、引起细胞骨架的重排、抑制伪足的形成并降低RhoA的表达水平。这提示 ,非折叠蛋白质应答可能通过抑制应激细胞的迁移为应激细胞的功能修复赢得了时间 。

超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法。方法以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率。结果当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%。结论超声联合微泡造影剂SonoVue能够作为载体介导质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果。

地高辛抑制豚鼠心室肌细胞Na^+,K^+-ATP酶和人胚肾上皮细胞系HERG钾通道电流

强心苷类药对Na^＋,K^＋-ATP酶的作用在低浓度时为兴奋、在高浓度时呈抑制作用[1]。应用膜片钳技术观察地高辛（Digoxin）对豚鼠心室肌细胞Na^＋,K^＋-ATP酶电流（Ip）的作用还未见报道。此外,由于很多药物的心脏不良反应是通过抑制人ether-a-go-go-related基因（HERG）编码的快速激活的延迟整流钾通道（IKr）而引起QT间期延长和尖端扭转性室速（TdP）。

改构型酸性成纤维细胞生长因子对紫杉醇诱导的人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤的保护作用

目的观察紫杉醇对人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293的毒性作用,及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护,并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤,同时加入aFGF对肝、肾细胞进行保护,并测定培养上清液中的SOD,MDA,LDH值,MTT法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2、人胚肾细胞293有一定的毒性作用,使用aFGF对肝、肾细胞进行保护后,IC50值有明显的提高,SOD值与未加aFGF组相比明显升高,而MDA,LDH值明显降低(P<0.05)。结论 aFGF可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。

谷胱甘肽合成抑制对人胚肾细胞的毒作用

目的 研究细胞谷胱甘肽 (GSH)合成抑制对人胚肾细胞的影响。方法 用GSH合成特异抑制剂 (BSO)抑制GSH合成 ,从而降低胞内GSH的水平。测定BSO处理不同时间人胚肾细胞内GSH的水平、细胞周期的变化、活性氧水平、细胞凋亡率和细胞存活率。结果 细胞内总GSH水平随BSO处理时间的延长而下降。处理 2 4h时 ,总GSH水平下降至对照的 10 % ,分析发现细胞周期G2 M期增多 (P <0 0 1) ,S期减少 (P <0 0 5 ) ;但活性氧水平、细胞凋亡率及细胞存活率没有明显改变。处理 48h时 ,总GSH水平下降至对照的 4% ,细胞存活率明显降低 (P <0 0 1) ,活性氧水平明显升高(P <0 0 1)。细胞凋亡率直到处理 72h时升高才有显著性 (P <0 0 1,n =3 ) ,此时细胞内总GSH已基本耗竭。结论 由于GSH水平下降而引起的氧化还原状态失衡可能是凋亡发生的普遍诱导因素。

川芎嗪对TGF-β_1诱导人胚肾近端小管上皮细胞转分化影响的实验研究

目的利用原代培养的人胚肾近端小管上皮细胞作为研究对象,探讨川芎嗪(TMP)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肾近端小管上皮细胞转分化的影响。方法采用胶原酶消化后系列网筛过滤,再用密度梯度离心分离纯化细胞的方法,进行人胚肾近端小管上皮细胞的原代培养。原代培养的人胚肾近端小管上皮细胞传至第2代后分为5组,空白对照组、10ng/mL TGF-β1刺激组、5ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组、10ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组及20ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组。刺激48h后,采用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、酶化学染色和免疫细胞化学方法检测细胞的转分化情况。结果 TGF-β1刺激人胚肾近端小管上皮细胞后细胞拉长呈梭形,细胞间隙加大;电子显微镜下细胞失去极性,微绒毛减少直至消失;碱性磷酸酶染色阴性;细胞角蛋白18(CK-18)表达减弱,波形蛋白(Vimentin)表达增强,并表达α平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA)。各浓度TMP+10ng/mL TGF-β1刺激组细胞的上述变化均有不同程度的减弱,减弱程度与TMP浓度呈正比。结论 TMP能以浓度依赖方式阻止TGF-β1诱导的人胚肾近端小管上皮细胞的转分化。

基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。

20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用

目的:研究20(S)-原人参二醇(PPD)对人胚肾293细胞(HEK-293细胞)生长抑制作用。方法:采用台盼蓝染色和噻唑蓝(MTT)法观察PPD对HEK-293细胞增殖的抑制作用,同时通过Hoechst33258染色和DNA Ladder方法测定PPD对HEK-293细胞凋亡影响。结果:PPD可明显降低HEK-293细胞存活率和细胞活性,半数抑制浓度(IC50)为21.8μmol/L。PPD处理后HEK-293细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,琼脂糖电泳呈现明显的DNALadder条带。结论:PPD对HEK-293细胞生长有明显的抑制作用并有剂量依赖关系。

中国仓鼠卵巢细胞和人胚肾T细胞骨架及其迁移特性的比较

【目的】比较中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾T(HEK293T)细胞的迁移能力,筛选适用于细胞骨架形态和外源基因对细胞迁移影响研究的细胞系。【方法】通过免疫荧光组织化学比较CHO和HEK293T细胞骨架的形态差异,通过延时成像和划痕试验比较细胞迁移能力,通过免疫印迹比较2株细胞系细胞骨架基因的相对表达,并从细胞骨架差异和结构基因的选择性表达方面解释细胞迁移能力的差异。【结果】CHO和HEK293T细胞系的细胞骨架在形态上存在较大差异,HEK293T细胞系的核质比是CHO细胞的2.25倍;CHO细胞比HEK293T细胞的迁移能力强,是HEK293T细胞的2.9倍;2种细胞内α-Tubulin/β-Actin的比率存在较大差异,CHO是HEK293T的1.2倍。【结论】细胞中微管微丝的差异性分布及结构基因Tubulin和Actin的选择性表达是细胞迁移特性不同的关键因素。CHO细胞适用于涉及细胞骨架形态和外源基因对细胞迁移影响的研究,HEK293T细胞不适用于此类研究。

曲霉菌素诱导人胚肾细胞毒性机制(英文)

目的 研究曲霉菌素诱导人胚肾细胞毒性作用机制。方法 结晶甲紫法用于细胞存活率研究。琼脂糖凝胶及Burton法研究细胞核DNA断裂片段。以水解特异性底物Ac DEVD AMC活性为研究指标 ,测定胞浆半胱天冬酶 (caspase) 3类蛋白酶活性。采用蛋白质印迹法检测细胞半胱天冬酶 3蛋白表达。采用荧光标记探针、流式细胞仪技术研究细胞核DNA核型及细胞活性氧的产生。结果 曲霉菌素浓度依赖性地诱导人胚肾细胞凋亡 ,最大效应浓度为 1 .0mg·L-1 。BAF ,半胱天冬酶 3蛋白抑制剂和N 乙酰半胱氨酸 (活性氧抑制剂 )能显著性抑制曲霉菌素诱导人胚肾细胞凋亡作用。结论 半胱天冬酶类及活性氧调节曲霉菌素诱导的人胚肾细胞凋亡。