TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2Ae GFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2重组蛋白表达水平。通过His标签纯化试剂盒及Superdex 20010/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白结合情况。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白共定位。利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功。Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用。IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2蛋白具有生物学活性。结论成功构建了TP53BP2基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础。

茶多酚和维生素C对人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤保护作用的比较

目的从细胞水平研究茶多酚(TP)对人胚肾293细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用,并与抗氧化剂维生素C(VC)进行比较。方法采用缺糖培养基并以连二亚硫酸钠消除培养基中的氧,诱导产生缺氧缺糖损伤模型,测定细胞的存活率、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及总抗氧化能力,并计算IC50。结果在细胞损伤模型中,TP和VC均表现出极强的抗氧化能力,TP能显著提高细胞的存活率、SOD活性和总抗氧化能力并抑制LDH的活性,TP的作用均大于VC。结论TP和VC体外具有强大的自由基清除作用,且呈现明显的剂量依赖性,TP在细胞损伤模型中的抗自由基作用均大于VC。

超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法。方法以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率。结果当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%。结论超声联合微泡造影剂SonoVue能够作为载体介导质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果。

改构型酸性成纤维细胞生长因子对紫杉醇诱导的人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤的保护作用

目的观察紫杉醇对人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293的毒性作用,及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护,并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤,同时加入aFGF对肝、肾细胞进行保护,并测定培养上清液中的SOD,MDA,LDH值,MTT法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2、人胚肾细胞293有一定的毒性作用,使用aFGF对肝、肾细胞进行保护后,IC50值有明显的提高,SOD值与未加aFGF组相比明显升高,而MDA,LDH值明显降低(P<0.05)。结论 aFGF可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。

非折叠蛋白质应答对人胚肾细胞293A迁移特性的影响

为了研究非折叠蛋白质应答对器官发生的影响 ,应用衣霉素诱导非折叠蛋白质应答并观察其对人胚肾细胞系 2 93A迁移特性的影响。在实验中 ,应用划痕法对细胞迁移进行观察 ,并应用细胞黏附实验、荧光染色技术、扫描电镜技术及免疫印迹实验分别对细胞黏附特性、微管及微丝、细胞表面边缘的突起及小分子GTPase的表达水平进行研究。结果表明 ,非折叠蛋白质应答可以抑制细胞迁移 ,进一步的研究发现 ,非折叠蛋白质应答可以降低细胞的黏附能力、引起细胞骨架的重排、抑制伪足的形成并降低RhoA的表达水平。这提示 ,非折叠蛋白质应答可能通过抑制应激细胞的迁移为应激细胞的功能修复赢得了时间 。

HEK-293细胞α_(1B)-肾上腺素受体引起的Ca^(2+)依赖性K^+电流和Ca^(2+)内流(英文)

目的:研究HEK293细胞上α1B肾上腺素受体亚型引起向外K+电流和Ca2+内流的特性。方法:细胞贴附式单通道记录K+通道和Fura2荧光测定胞浆游离Ca2+浓度。结果:肾上腺素或苯肾上腺素可引发一电导为160pS的外向K+电流。该电流可被50μmol·L-1氯乙醛可乐定(CEC),5mmol·L-1依他酸(EGTA)或2mmol·L-1四乙铵(TEA)抑制。硝苯吡啶(nifedipine)不改变该电流及α1B亚型引起的Ca2+内流;后者可被1mmol·L-1LaCl3抑制。结论:激活转染在HEK293细胞上的α1B受体亚型可引起通过硝苯吡啶不敏感Ca2+通道的Ca2+内流。

20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用

目的:研究20(S)-原人参二醇(PPD)对人胚肾293细胞(HEK-293细胞)生长抑制作用。方法:采用台盼蓝染色和噻唑蓝(MTT)法观察PPD对HEK-293细胞增殖的抑制作用,同时通过Hoechst33258染色和DNA Ladder方法测定PPD对HEK-293细胞凋亡影响。结果:PPD可明显降低HEK-293细胞存活率和细胞活性,半数抑制浓度(IC50)为21.8μmol/L。PPD处理后HEK-293细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,琼脂糖电泳呈现明显的DNALadder条带。结论:PPD对HEK-293细胞生长有明显的抑制作用并有剂量依赖关系。

人胚肾细胞HEK293中miRNA-128-1表达调控机制的初步研究

目的:初步研究人胚肾细胞HEK293中miRNA-128-1的表达调控机制,为进一步探讨miRNA-128-1在胶质瘤中的表达调控奠定基础。方法:通过软件UCSC预测miRNA-128-1的启动子区域;运用软件UCSC、CBIL预测可能与miRNA-128-1启动子区域结合的候选转录因子;构建相关质粒,包括pB-miRNA-128-1、pShNF1、pShc-Myc、pShTAF1、pShYY1、pShMAF、pShRELA2、pShRNUX1和pShNFkappaB。然后将pB-miRNA-128-1分别与上述质粒共转染人胚肾细胞HEK293,检测报告基因活性,确定候选转录因子的作用性质。结果:共转染pShc-Myc可显著抑制pB-miRNA-128-1启动子报告基因的活性;共转染pShNFkappaB可显著升高pB-miRNA-128-1启动子报告基因的活性;共转染pShNF1、pShTAF1、pSbYY1、pShMAF、pShRELA2或pShRNUX1对pB-miRNA-128-1启动子报告基因的活性未见明显影响。结论:在HEK293细胞miRNA-128-1的表达调控中,c-Myc可能发挥转录激活作用,而NFkappaB可能发挥转录抑制作用。

地高辛衍生物对人胚肾细胞293延迟整流钾电流的作用

目的研究地高辛衍生物对人胚肾细胞(human embryonic kidney 293 cell,HEK-293)上延迟整流钾电流(delayed after potassium current,I_K)的影响。方法应用磷酸钙瞬时转染的方法,将人心肌细胞上的延迟整流钾电流通道蛋白基因(human Ether-a-go-go Related Gene,HERG)转染进人胚肾细胞,全细胞膜片钳技术记录药物浓度分别为1、10、100 nmol·L^(-1)的地高辛甲、乙两种衍生物对人胚肾细胞上HERG钾通道时间依赖性电流(I_(step))和尾电流(I_(tail))的影响。结果地高辛衍生物甲和地高辛类似,对HERG钾通道时间依赖性电流和尾电流均呈现剂量依赖性抑制,其半数最大抑制浓度IC_(50)分别为20.61、22.69 nmol·L^(-1);未见地高辛衍生物乙对HERG钾通道延迟整流钾电流的抑制作用。结论地高辛衍生物甲对转染HERG钾通道的人胚肾细胞的延迟整流钾电流呈浓度依赖性抑制;而地高辛衍生物乙对转染HERG钾通道的人胚肾细胞的延迟整流钾电流无抑制作用。

小鼠胚肾发育过程中细胞衰老相关基因差异表达分析

目的通过转录组学筛选胚肾发育过程中的差异表达基因,采用生物信息学分析细胞衰老途径及其相关基因,进一步探讨细胞衰老与胚肾发育的关系。方法分别取胚龄为14.5 d(E14.5组)和18.5 d(E18.5组)的小鼠肾脏组织,使用过碘酸雪夫染色观察肾脏组织结构,通过转录组学分析胚肾发育过程中基因谱表达变化,采用生物信息学分析细胞衰老相关基因表达变化,并采用实时定量荧光PCR及Western blot验证靶基因的表达水平。结果随着胚肾的发育,肾脏结构逐渐成熟,转录组学结果及生物信息学分析发现细胞衰老相关基因在胚肾发育过程中发挥重要作用,其中E18.5组中细胞衰老相关基因Cdkn1a(P21)mRNA及蛋白相对表达水平较E14.5组升高(P<0.05),而Skp2、Ccne1、Ccnd2和Cdk4 mRNA表达水平较E14.5组降低(P<0.05)。结论在胚肾发育过程中细胞衰老相关基因表达水平发生显著变化,表明细胞衰老在胚肾发育过程中发挥重要作用。

GATA5抑制EpCAM表达对肾癌HEK-293细胞系的影响

目的研究GATA5对肾癌HEK-293细胞系增殖调控及对细胞重编程因子EpCAM表达的影响。方法构建pTT5-GATA5表达载体并进行基因序列测序验证;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率;细胞划痕实验检测细胞划痕修复情况;实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因mRNA表达;蛋白免疫印迹(Western Blot)检测蛋白表达。结果GATA5抑制HEK-293细胞增殖;GATA5抑制HEK-293细胞划痕修复;GATA5抑制EpCAM的mRNA和蛋白表达。结论GATA5可以抑制肾癌细胞HEK-293细胞的增殖率并抑制EpCAM表达。

西红花苷对人胚肾细胞293延迟整流钾电流的作用研究

目的:研究西红花苷对人胚肾细胞(human embryonic kidney 293cell,HEK293)上表达的延迟整流钾电流的作用。方法:运用脂质体转染法,将人心肌细胞上的延迟整流钾电流通道蛋白基因转染到HEK293细胞上,采用穿孔膜片钳法记录西红花苷对快激活延迟整流钾电流(The rapidly activating delayed rectifier potassium current,IKr)和慢激活延迟整流钾电流(The slowly activating delayed rectifier potassium current,IKs)的影响。结果:西红花苷对表达在HEK293上的IKr和IKs均无明显作用。结论:西红花苷不影响延迟整流钾电流,临床使用不易诱发QT间期延长和心律失常。

BDE-47对人胚肾细胞HEK293的毒理效应及作用机制

2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)是生物体中含量最高且毒性最强的PBDEs之一,有关BDE-47对肾细胞的毒性及其作用机制的研究仍有待补充。选取3个剂量组(低:10-6mol·L-1、中:10-5mol·L-1、高:10-4mol·L-1)及溶剂对照组,研究了BDE-47对人胚肾细胞(HEK293)的细胞凋亡率及活性氧(ROS)水平的影响;并从分子水平对细胞氧化损伤、凋亡相关蛋白(APE1及p53)及凋亡相关基因m RNA(p53、Bax、Caspase 3、Caspase 8)的表达量进行测定。实验结果显示:与对照组相比,中、高剂量组细胞凋亡率显著增加(P<0.05);ROS水平在中剂量组显著上升(P<0.01);随BDE-47浓度的变化,APE1蛋白表达量与细胞ROS水平存在一致性;p53、Bax、Caspase 8 m RNA表达量与BDE-47的浓度间存在剂量-效应关系。结果表明,BDE-47可诱导HEK293细胞凋亡及氧化应激,APE1可能是细胞ROS升高与细胞凋亡间重要的中介因子;BDE-47可以通过影响Caspase 8及线粒体途径中p53及Bax的表达诱导细胞凋亡。

双酚类化合物对人胚肾细胞HEK293的毒性和氧化应激的研究

双酚类化合物(bisphenols,BPs)是一类新型环境有机污染物,BPs排放到环境介质后经多种途径进入生物体并在体内蓄积,已逐渐成为威胁环境和健康的重要风险因子。为探明BPs对人体健康的潜在毒性效应,选取人胚肾细胞HEK293作为模型,通过测定细胞活力、胞内活性氧含量、氧化应激参数(SOD、GSH、MDA)及细胞内钙离子水平,比较了双酚A(bisphenol A,BPA)、双酚S(bisphenol S,BPS)、双酚F(bisphenol F,BPF)和双酚AF(bisphenol AF,BPAF)对HEK293细胞的毒性影响。结果表明,BPA、BPS、BPF和BPAF能够不同程度的抑制HEK293细胞活力,通过促进氧化应激产生ROS,降低抗氧化能力,迅速提高细胞内Ca2+水平,诱导HEK293细胞损伤。在本文研究所选的浓度范围内,BPAF对HEK293细胞的毒性影响最大,BPA和BPF对HEK293细胞的毒性影响次之,BPS对HEK293细胞的毒性影响较小。研究结果为深化了解双酚类化合物的毒理学系统研究和风险评估提供参考依据。

千金子制霜前后提取物对人胚肾细胞HEK293的体外毒性作用

目的:比较千金子制霜前后提取物对正常人胚肾细胞HEK293的影响,探究千金子制霜减毒的作用机制。方法:采用HEK293细胞为体外模型,随机分为对照组,千金子生品低、中、高质量浓度(100、200、400μg·mL^(-1))组和千金子霜品低、中、高质量浓度(100、200、400μg·mL^(-1))组。细胞体外培养后,分别给予等体积的无血清培养液和千金子生品、霜品提取物溶液,各组均设置3个复孔。采用CCK-8法评价细胞存活率,利用倒置显微镜观察细胞数量及形态变化;碘化丙啶(PI)染色法和AnnexinV-FITC/PI双重染色法检测细胞周期和凋亡情况;试剂盒法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽(GSH)、肌酐(Cr)和细胞裂解液中尿素氮(BUN)水平。结果:与对照组比较,千金子生品各质量浓度组HEK293细胞存活率降低,细胞形态异常,细胞数量减少,G_(0)/G_(1) 、 G_(1)/G_(2)期细胞比例明显降低,S期细胞比例明显增加,细胞凋亡率升高(P<0.01),LDH、BUN、Cr水平升高(P<0.05,P<0.01),GSH水平降低(P<0.01);与千金子生品组比较,千金子霜品相应质量浓度可显著增加HEK293细胞存活率(P<0.01),改善细胞形态,增加G_(0)/G_(1) 期、 G_(1)/G_(2)期细胞比例,降低S期细胞比例,同时能明显降低LDH、BUN、Cr水平(P<0.05,P<0.01),提高GSH水平(P<0.01)。结论:千金子制霜后可能通过减轻细胞周期阻滞和细胞氧化损伤改善肾细胞功能、减少细胞凋亡,从而降低体外肾毒性。

人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

目的探讨人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控。方法通过Polysome profiling结合Western blot实验检测并验证HEK293细胞中mRNA的翻译活性;通过针对RPL10A和RPS17两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀、建库测序(RIP-seq)及生物信息学分析,获得参与HEK293细胞蛋白质合成调控的相关分子。结果在两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀实验富集的分子中共有129种基因,其中93.8%为蛋白质编码基因;且功能与RNA剪接、分解代谢、MAPK信号通路、染色体定位、RNA转运等相关。结论通过针对核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀可以获得HEK293细胞中活跃翻译的mRNA。

二甲双胍对人胚肾HEK293T细胞增殖、凋亡和Cyclin D1表达的影响

目的研究二甲双胍对人胚肾细胞系HEK293T增殖的抑制和诱导凋亡的作用,并初步探讨其可能的机制。方法采用0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L二甲双胍浓度梯度处理HEK293T细胞,各组分别处理24、48、72h后,通过MTT实验分析细胞增殖变化;在二甲双胍浓度梯度处理48h后,利用Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;采用实时定量PCR检测Cyclin D1基因mRNA的表达变化。结果二甲双胍处理后,所有处理组在24、48、72h的细胞存活率均显著下降(P<0.05),但并未发现有时间依赖和浓度依赖效应;经流式细胞仪检测,二甲双胍干预48h之后,5mmol/L、10mmol/L和20mmol/L浓度处理组HEK293T细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.05);0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L二甲双胍分别处理HEK293T细胞48h后,实时定量PCR结果显示,10mmol/L和20mmol/L处理组的CyclinD1表达量出现明显降低(P<0.05),但5mmol/L处理组未发现有明显变化(P>0.05)。结论二甲双胍对HEK293T细胞增殖有明显抑制作用,而对HEK293T细胞凋亡有明显的促进作用,这可能是通过抑制细胞内CyclinD1表达来实现的。

玉米赤霉烯酮对人正常肝细胞(LO_2)和人胚肾细胞(HEK293)的毒性作用研究

以体外培养的人正常肝细胞(LO2)和人胚肾细胞(HEK293)为模板,用MTT比色法研究了玉米赤霉烯酮对以上两种细胞株的毒性作用,结果表明,在所测浓度范围内,玉米赤霉烯酮对这两种细胞的抑制率随其作用浓度的增加而增强,而其作用浓度到达一定程度时,玉米赤霉烯酮对这两种细胞的抑制率保持在一定的范围内不再增加。实验结果证明在2.50μg/mL和1.25μg/mL的最高浓度下,玉米赤霉烯酮对人正常肝细胞(LO2)和人胚肾细胞(HEK293)的抑制率分别为86.61%和67.06%,可见其肝毒性和肾毒性明显。

氟康唑对豚鼠心室肌细胞I_K和在HEK-293细胞中表达的HERG钾通道的抑制作用

目的研究氟康唑对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(IK)和在HEK-293细胞中表达的HERG钾通道的抑制作用。方法应用酶解法消化豚鼠单个心室肌细胞,观察氟康唑对IK的影响;采用磷酸钙沉淀瞬时转染的方法将HERG基因表达于HEK-293细胞上,观察氟康唑对野生型HERG钾通道电流、激活和失活曲线的影响,以及氟康唑对Y652A和F656C突变型HERG钾通道的作用;IK和HERG电流的记录均采用全细胞膜片钳技术。结果氟康唑(0.01、0.1、1、3、10、30、100、300和1 000μmol.L-1)浓度依赖性地抑制IK和HERG钾电流,其IC50值分别为(68.1±21.6)μmol.L-1和(48.2±9.4)μmol.L-1,对HERG钾通道的电压依赖性激活和失活曲线无影响;与野生型(WT)比较,Y652A和F656C突变型可减弱氟康唑对HERG通道的阻断作用。结论氟康唑能阻断IK和HERG通道,Y652和F656是氟康唑与HERG通道结合的关键位点。