超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法。方法以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率。结果当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%。结论超声联合微泡造影剂SonoVue能够作为载体介导质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果。

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。

再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化

目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。

菌多糖对Balb/c 3T_3、Hela、HEK-293细胞增殖的影响

用苯酚法提取JM109大肠杆菌、O157大肠杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌及多头绒泡菌的菌多糖,用MTT法检测菌多糖在体外对Balb/c 3T_3(鼠成纤维细胞)、Hela(人上皮细胞)和HEK-293(人胚肾细胞)增殖的影响.结果表明,菌多糖在低质量浓度(低于40mg/L)时抑制Hela细胞和HEK-293细胞的增殖,但促进Balb/c 3T_3细胞的增殖;菌多糖超过一定质量浓度(80mg/L)时,对Balb/c 3T_3细胞的增殖作用和对Hela、HEK-293细胞增殖的抑制作用趋于饱和.

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。

Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立

目的在前列腺肿瘤细胞系LNCa P中建立Notch信号报告系统。方法采用In-Fusion酶系统将巨细胞病毒(CMV)启动子和Notch蛋白胞内结构域(ICD)细胞核内DNA结合蛋白CSL的8拷贝串联DNA序列克隆入p LVX-ac GFP-N1慢病毒载体,构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒(p LVX-8XCSL-ac GFP)。在人胚肾293T细胞中转染p LVX-8XCSL-ac GFP质粒或对照质粒p LVX-ac GFP,6 h后再转染Notch受体的细胞内结构域(NICD)的表达质粒p ETP-NICD(过表达NICD)或对照质粒p ETP。转染48 h后用荧光显微镜观察GFP的表达,用流式细胞仪进行荧光定量分析。然后将p LVX-8XCSL-ac GFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系LNCa P,72 h后荧光显微镜观察绿色荧光,用流式细胞仪分选出GFP荧光强度最强5%及最弱5%的细胞。提取这两部分细胞的RNA,采用qRT-PCR方法检测细胞中Notch1、Notch2以及Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达。结果在转染p LVX-8XCSL-ac GFP的293T细胞中,转染p ETP-NICD的细胞荧光强度较转染p ETP对照质粒的细胞增加了约10倍;而在转染p LVX-ac GFP的293T细胞中,转染p ETP-NICD的细胞与转染p ETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异。根据p LVX-8XCSL-ac GFP荧光强度分选出的LNCa P细胞,荧光强度高的细胞Notch1、Notch2、Hey1表达高于荧光强度弱的细胞(P均<0.05)。结论在LNCa P细胞中p LVX-8XCSL-ac GFP可以作为报告Notch信号水平的有效工具。

人胚肾细胞株对脂多糖刺激的反应及关键基因的表达

人胚肾细胞株是研究Toll样受体（TLR）最常使用的细胞。为更好地认识其特性，我们进行了相关研究。一、材料与方法1．细胞培养及反转录一聚合酶链反应（1it—PCR）：人胚肾细胞株293T、293A、HEK293采用杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）进行常规培养，总RNA抽提后行RT—PCR，引物均为自行设计。

高表达H2型人类组织血型抗原HEK-293T细胞系的构建及其应用

目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系。方法构建FUT2慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2细胞系。PCR鉴定FUT2基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性。结果成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2细胞系,PCR验证显示,FUT2基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中。HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA水平提高了330倍。99.9%的HEK-293T/FUT2细胞表达H2型人类组织血型抗原。GI.1重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2细胞产生很好的结合反应,EC50为2.007μg/mL。结论建立了H2型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法。

中国大鲵虹彩病毒对293T细胞系的感染性研究

中国大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)属于虹彩病毒科蛙病毒属,对两栖类具有强致病率,给两栖类养殖业带来了严重的经济损失。本研究将人胚肾细胞系(293T)作为CGSIV的潜在宿主细胞系,通过验证26℃下CGSIV对293T细胞的感染性及病毒特性,为将293T发展成为CGSIV病毒研究的细胞系模型打下基础。利用PCR、Western Blot和透射电镜等技术对CGSIV感染293T细胞及其在293T细胞中的基因表达、病毒复制及子代病毒等进行验证;并通过半数组织培养感染剂量(Median tissue culture infectious dose,TCID50)法和绝对定量qPCR检测CGSIV在293T中的病毒滴度及病毒含量。结果表明:293T在接种CGSIV 72 h时出现了典型的病变特征;成功在受感染的293T细胞内检测到CGSIV基因组及病毒相关基因的转录和翻译,表明CGSIV能够成功感染293T细胞并在细胞内顺利完成病毒相关基因的表达;通过透射电镜观察到293T细胞内呈晶格状排列且横切面为正六边形的病毒粒子,病毒感染实验显示其病毒粒子能够感染鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC),表明CGSIV能够在293T细胞内顺利完成其生活周期,产生具感染力的完整子代病毒;CGSIV在293T细胞内的病毒滴度约为2.26×105TCID50/mL;CGSIV在293T细胞中的复制时序表明病毒在感染24 h内复制缓慢,36 h后进入复制高峰期并延续于整个感染周期内。综上,在26℃下,CGSIV能够感染293T细胞系,并在细胞内完成其生活周期,产生具有感染力的完整子代病毒;另外,CGSIV对293T细胞的感染与鱼类细胞相比,其感染病变时间也有所延长。本研究为发展293T细胞作为CGSIV病毒研究的细胞系新模型奠定了基础。

HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究

目的利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证。结果将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达。结论RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究。

MicroRNA表达载体对大鼠KiSS1基因的干预效应

目的在细胞水平观察microRNA(miRNA)载体瞬时转染293T细胞株后对KiSS1基因转录、翻译的干预效应。方法以SD大鼠基因组DNA为模板,克隆KiSS1基因全长序列,构建重组载体pcDNA3.1(+)-KiSS1。应用miRNA设计软件,针对大鼠KiSS1基因的4个不同靶位点设计4对干扰序列及1对非相关性的阴性对照序列,得到miRNA表达载体p-KiSS1-miRNA1-4及p-KiSS1-miRNA-neg。利用脂质体介导将上述载体与pcDNA3.1(+)-KiSS1共转染293T细胞,采用荧光显微镜及免疫荧光技术检测转染72 h后细胞中各载体表达。采用实时荧光定量-PCR(RT-RCR)及Western blot技术观察转染48 h及72 h后miRNA表达载体对KiSS1基因的干预效应。结果荧光显微镜观察到miRNA载体转染293T细胞后可表达绿色荧光蛋白,免疫荧光结果显示转染pcDNA3.1(+)-KiSS1载体组可见红色的KiSS1蛋白在细胞质中表达;RT-PCR结果显示干预组细胞KiSS1 mRNA表达显著低于阳性对照组和阴性对照组(Pa<0.05)。其中p-KiSS1-miRNA2组KiSS1基因表达抑制最显著,降低了85%;Western blot结果显示p-KiSS1-miRNA2干预组KiSS1蛋白表达明显低于阳性对照组及阴性对照组。结论 4个miRNA载体对大鼠KiSS1基因均具有抑制效应,其中针对KiSS1 mRNA序列304～324 bp的p-KiSS1-miRNA2抑制效果最佳,为个体水平沉默KiSS1防治性早熟的研究提供依据。

小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2基因真核重组表达质粒的构建及其对微管蛋白聚合的影响

目的构建小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,SRPK2)基因(srpk2)的真核重组表达质粒,并分析其对微管蛋白α-Tubulin聚合的影响。方法利用RT-PCR法扩增srpk2的全长cDNA序列,通过分子克隆技术构建真核重组表达质粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2;在脂质体Lipofectamine 2000的介导下,将真核重组表达质粒及空载体pLV-EGFP2(A)Puro分别转染人胚肾HEK293T细胞,同时设空白对照组(未转染)。采用RT-PCR及Western blot法分别检测HEK293T细胞中srpk2基因mRNA转录及SRPK2蛋白的表达情况;Western blot法分析HEK293T细胞中聚合态和游离态α-Tubulin的含量。结果双酶切及DNA序列鉴定证明真核重组表达质粒pLV-EGFP2(A)Puro-srpk2构建正确,且在HEK293T细胞中实现了srpk2基因过表达。真核重组表达质粒转染组HEK293T细胞中游离态α-Tubulin含量显著低于空载体转染组及空白对照组(P<0.05),而聚合态α-Tubulin水平明显高于空载体转染组及空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了srpk2基因的真核重组表达质粒,SRPK2可促进α-Tubulin微管蛋白聚合。