不同砷化合物对人胚肾细胞系HEK-293细胞的毒性研究

目的观察不同砷化合物诱发人胚肾细胞系HEK-293细胞的细胞毒性与氧化应激作用。方法将细胞密度为1×105个/ml的HEK-293细胞分别暴露于As2O(3iAs3+,0～50μmol/L)、Na2HAsO4.7H2O(iAs5+,0～500μmol/L)和C2H6AsO2Na.3H2O(DMA5+,0～500μmol/L)24 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞生存率,并测定细胞中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果当iAs3+≥1.0μmol/L,iAs5+≥50μmol/L,DMA5+≥400μmol/L时,与溶剂对照相比,HEK-293细胞的生存率均下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);且随着染毒剂量的升高,iAs3+和iAs5+染毒HEK-293细胞的生存率呈下降趋势,而DMA5+染毒HEK-293细胞的生存率呈先上升后下降的趋势。与溶剂对照组比较,50.0μmol/LiAs3+,500μmol/L iAs5+和500.0μmol/L DMA5+染毒HEK-293细胞MDA含量升高,1.0、10.0、100.0、200.0μmol/L iAs3+,100.0、200.0、300.0、500.0μmol/L iAs5+,25.0、50.0、500.0μmol/L DMA5+染毒HEK-293细胞SOD水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 3种砷化物对HEK-293细胞的细胞毒性依次为iAs3+>iAs5+>DMA5+,砷化合物所诱发的细胞毒性作用机制之一可能与氧化应激有关。

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒(空载组)及重组质粒(FAT10质粒组)转染293T细胞,以脂质体混合PBS(PBS组)及未加入脂质体(未转染组)作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均<0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。

NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究

目的构建大鼠NELL2基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-NELL2的microRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应。方法从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的片段克隆至表达载体pcDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2。针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4)。将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组),采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染pcDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组。结果酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确。Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P<0.05或P<0.01)。结论成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒,证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应。

中国大鲵虹彩病毒对293T细胞系的感染性研究

中国大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)属于虹彩病毒科蛙病毒属,对两栖类具有强致病率,给两栖类养殖业带来了严重的经济损失。本研究将人胚肾细胞系(293T)作为CGSIV的潜在宿主细胞系,通过验证26℃下CGSIV对293T细胞的感染性及病毒特性,为将293T发展成为CGSIV病毒研究的细胞系模型打下基础。利用PCR、Western Blot和透射电镜等技术对CGSIV感染293T细胞及其在293T细胞中的基因表达、病毒复制及子代病毒等进行验证;并通过半数组织培养感染剂量(Median tissue culture infectious dose,TCID50)法和绝对定量qPCR检测CGSIV在293T中的病毒滴度及病毒含量。结果表明:293T在接种CGSIV 72 h时出现了典型的病变特征;成功在受感染的293T细胞内检测到CGSIV基因组及病毒相关基因的转录和翻译,表明CGSIV能够成功感染293T细胞并在细胞内顺利完成病毒相关基因的表达;通过透射电镜观察到293T细胞内呈晶格状排列且横切面为正六边形的病毒粒子,病毒感染实验显示其病毒粒子能够感染鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC),表明CGSIV能够在293T细胞内顺利完成其生活周期,产生具感染力的完整子代病毒;CGSIV在293T细胞内的病毒滴度约为2.26×105TCID50/mL;CGSIV在293T细胞中的复制时序表明病毒在感染24 h内复制缓慢,36 h后进入复制高峰期并延续于整个感染周期内。综上,在26℃下,CGSIV能够感染293T细胞系,并在细胞内完成其生活周期,产生具有感染力的完整子代病毒;另外,CGSIV对293T细胞的感染与鱼类细胞相比,其感染病变时间也有所延长。本研究为发展293T细胞作为CGSIV病毒研究的细胞系新模型奠定了基础。

弯管列当提取物的抗氧化活性

目的:研究弯管列当不同提取部位对DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼)自由基的清除能力及对H2O2诱导的人胚肾细胞系HEK-293细胞氧化损伤的保护作用。方法:弯管列当70%乙醇粗提物,依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取后,得到乙酸乙酯提取部位(gg1)、正丁醇提取部位(gg2)和水部位(gg3)。用清除DPPH自由基法测试gg1,gg2,gg3的抗氧化活性。用H2O2建立人胚肾细胞系HEK-293细胞氧化损伤模型,用MTT法检测细胞活力,观察gg1,gg2,gg3对氧化受损细胞活力的影响。结果:DPPH实验的IC50从小到大依次为:gg1(0.042 9 g.L-1)<gg2(0.059 9 g.L-1)<VC(0.071 8 g.L-1)<gg3(0.330 3 g.L-1),表明gg1,gg2具有较强的抗氧化活性。研究结果亦表明弯管列当的gg1,gg2,gg3均能明显提高受损伤HEK-293细胞的活力,表现出抗氧化活性。结论:弯管列当以上各提取部位均具有一定的清除自由基、抗氧化的活性。