TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2Ae GFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2重组蛋白表达水平。通过His标签纯化试剂盒及Superdex 20010/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白结合情况。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白共定位。利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功。Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用。IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2蛋白具有生物学活性。结论成功构建了TP53BP2基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础。

不同砷化合物对人胚肾细胞系HEK-293细胞的毒性研究

目的观察不同砷化合物诱发人胚肾细胞系HEK-293细胞的细胞毒性与氧化应激作用。方法将细胞密度为1×105个/ml的HEK-293细胞分别暴露于As2O(3iAs3+,0～50μmol/L)、Na2HAsO4.7H2O(iAs5+,0～500μmol/L)和C2H6AsO2Na.3H2O(DMA5+,0～500μmol/L)24 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞生存率,并测定细胞中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果当iAs3+≥1.0μmol/L,iAs5+≥50μmol/L,DMA5+≥400μmol/L时,与溶剂对照相比,HEK-293细胞的生存率均下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);且随着染毒剂量的升高,iAs3+和iAs5+染毒HEK-293细胞的生存率呈下降趋势,而DMA5+染毒HEK-293细胞的生存率呈先上升后下降的趋势。与溶剂对照组比较,50.0μmol/LiAs3+,500μmol/L iAs5+和500.0μmol/L DMA5+染毒HEK-293细胞MDA含量升高,1.0、10.0、100.0、200.0μmol/L iAs3+,100.0、200.0、300.0、500.0μmol/L iAs5+,25.0、50.0、500.0μmol/L DMA5+染毒HEK-293细胞SOD水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 3种砷化物对HEK-293细胞的细胞毒性依次为iAs3+>iAs5+>DMA5+,砷化合物所诱发的细胞毒性作用机制之一可能与氧化应激有关。

GATA5抑制EpCAM表达对肾癌HEK-293细胞系的影响

目的研究GATA5对肾癌HEK-293细胞系增殖调控及对细胞重编程因子EpCAM表达的影响。方法构建pTT5-GATA5表达载体并进行基因序列测序验证;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率;细胞划痕实验检测细胞划痕修复情况;实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因mRNA表达;蛋白免疫印迹(Western Blot)检测蛋白表达。结果GATA5抑制HEK-293细胞增殖;GATA5抑制HEK-293细胞划痕修复;GATA5抑制EpCAM的mRNA和蛋白表达。结论GATA5可以抑制肾癌细胞HEK-293细胞的增殖率并抑制EpCAM表达。

人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

目的探讨人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控。方法通过Polysome profiling结合Western blot实验检测并验证HEK293细胞中mRNA的翻译活性;通过针对RPL10A和RPS17两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀、建库测序(RIP-seq)及生物信息学分析,获得参与HEK293细胞蛋白质合成调控的相关分子。结果在两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀实验富集的分子中共有129种基因,其中93.8%为蛋白质编码基因;且功能与RNA剪接、分解代谢、MAPK信号通路、染色体定位、RNA转运等相关。结论通过针对核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀可以获得HEK293细胞中活跃翻译的mRNA。

茶多酚和维生素C对人胚肾293细胞缺糖缺氧损伤保护作用的比较

目的从细胞水平研究茶多酚(TP)对人胚肾293细胞缺糖缺氧性损伤的保护作用,并与抗氧化剂维生素C(VC)进行比较。方法采用缺糖培养基并以连二亚硫酸钠消除培养基中的氧,诱导产生缺氧缺糖损伤模型,测定细胞的存活率、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及总抗氧化能力,并计算IC50。结果在细胞损伤模型中,TP和VC均表现出极强的抗氧化能力,TP能显著提高细胞的存活率、SOD活性和总抗氧化能力并抑制LDH的活性,TP的作用均大于VC。结论TP和VC体外具有强大的自由基清除作用,且呈现明显的剂量依赖性,TP在细胞损伤模型中的抗自由基作用均大于VC。

超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法。方法以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率。结果当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%。结论超声联合微泡造影剂SonoVue能够作为载体介导质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果。

地高辛抑制豚鼠心室肌细胞Na^+,K^+-ATP酶和人胚肾上皮细胞系HERG钾通道电流

强心苷类药对Na^＋,K^＋-ATP酶的作用在低浓度时为兴奋、在高浓度时呈抑制作用[1]。应用膜片钳技术观察地高辛（Digoxin）对豚鼠心室肌细胞Na^＋,K^＋-ATP酶电流（Ip）的作用还未见报道。此外,由于很多药物的心脏不良反应是通过抑制人ether-a-go-go-related基因（HERG）编码的快速激活的延迟整流钾通道（IKr）而引起QT间期延长和尖端扭转性室速（TdP）。

改构型酸性成纤维细胞生长因子对紫杉醇诱导的人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤的保护作用

目的观察紫杉醇对人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293的毒性作用,及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护,并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤,同时加入aFGF对肝、肾细胞进行保护,并测定培养上清液中的SOD,MDA,LDH值,MTT法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2、人胚肾细胞293有一定的毒性作用,使用aFGF对肝、肾细胞进行保护后,IC50值有明显的提高,SOD值与未加aFGF组相比明显升高,而MDA,LDH值明显降低(P<0.05)。结论 aFGF可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。

20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用

目的:研究20(S)-原人参二醇(PPD)对人胚肾293细胞(HEK-293细胞)生长抑制作用。方法:采用台盼蓝染色和噻唑蓝(MTT)法观察PPD对HEK-293细胞增殖的抑制作用,同时通过Hoechst33258染色和DNA Ladder方法测定PPD对HEK-293细胞凋亡影响。结果:PPD可明显降低HEK-293细胞存活率和细胞活性,半数抑制浓度(IC50)为21.8μmol/L。PPD处理后HEK-293细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,琼脂糖电泳呈现明显的DNALadder条带。结论:PPD对HEK-293细胞生长有明显的抑制作用并有剂量依赖关系。

WT1基因对肾胚瘤细胞系G401细胞肿瘤逆转的研究

目的 肾胚瘤是一种较常见的儿科实体肿瘤 ,该肿瘤的发生与抑癌基因WT1密切相关。本研究的目的是利用脂质体介导转染法将WT1cDNA导入G4 0 1细胞 ,研究WT1基因对G4 0 1细胞生长凋亡及致瘤性的作用。方法 通过Westernblot检测WT1基因在肾胚瘤中的表达、采用碘化丙锭 (PI)染色法检测G4 0 1细胞的凋亡情况、并且对G4 0 1的致瘤性进行分析 ,探讨WT1基因在肾胚瘤发生及治疗中的作用。结果 WT1cDNA可诱导G4 0 1细胞凋亡 ,并且使其致瘤性有所降低。结论 该结果为确定WT1在肾胚瘤病因方面的作用。

再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化

目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。

葡萄籽原花青素对顺铂诱导人胚肾细胞凋亡的拮抗作用

目的:探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin,GSPE)对顺铂(cisdiamminedichloroplatinum,CDDP)诱导人胚肾细胞HEK293凋亡及相关凋亡基因的影响,并探讨可能的机制。方法:体外培养正常HEK293细胞,噻唑蓝法测定GSPE、CDD P分别对HEK293细胞生长的影响以及GSPE对CDDP诱导HEK293细胞毒性的保护作用,流式细胞仪测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡率的变化,Western blotting测定GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:GSPE对CDDP所致HEK293细胞毒性具有拮抗作用,可减轻CDDP所致HEK293细胞凋亡,减弱Bax表达、增强Bcl-2表达。结论:GSPE对CDDP所致HEK293细胞凋亡具有拮抗作用,其机制可能与GSPE降低促凋亡基因Bax,升高抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。

镉通过作用于细胞线粒体诱导人胚肾细胞（HEK）293发生Caspase依赖和非依赖的细胞凋亡

镉（Cd）无论是在体内还是在体外实验都证明对肾脏有毒性，同时其肾脏毒性与其诱导细胞发生凋亡有关，但其内在机制仍不清楚。本研究评价了镉对HEK-293细胞的效果及探讨镉所诱导发生细胞凋亡的相关内在机制。MTT结果、细胞形态学的改变以及DNA片断化的分析表明了30-60μM的镉确实诱导了细胞发生凋亡，而120μM的镉则主要引起了细胞的坏死。

HEK-293细胞复苏培养及冻存

目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究,为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法复苏培养人胚肾293细胞,倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线,冻存保留细胞。结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好,6h后大部分细胞已经贴壁,8h细胞已完全贴壁。结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的,为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。

适应于牛胚肾细胞系增殖的新城疫病毒La Sota株的特性

新城疫病毒（ＮＤＶ）弱毒Ｌａ Ｓｏｔａ株适应于牛胚肾ＢＳ／ＢＥＫ细胞系中增殖，并产生与鸡胚中相似的感染滴度。连续在细胞系中传代后，在ＣＰＥ和蚀斑的大小、形态等生物学特性方面没有变化。相比之下，Ｌａ Ｓｏｔａ株对１日龄鸡脑内致病力指数细胞毒则低于鸡胚毒。但细胞培养适应毒的免疫原性在血清学反应和抵抗强度ＮＤＶ攻击方面并未显示出有何变化。换言之，在细胞系中增殖的Ｌａ

菌多糖对Balb/c 3T_3、Hela、HEK-293细胞增殖的影响

用苯酚法提取JM109大肠杆菌、O157大肠杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌及多头绒泡菌的菌多糖,用MTT法检测菌多糖在体外对Balb/c 3T_3(鼠成纤维细胞)、Hela(人上皮细胞)和HEK-293(人胚肾细胞)增殖的影响.结果表明,菌多糖在低质量浓度(低于40mg/L)时抑制Hela细胞和HEK-293细胞的增殖,但促进Balb/c 3T_3细胞的增殖;菌多糖超过一定质量浓度(80mg/L)时,对Balb/c 3T_3细胞的增殖作用和对Hela、HEK-293细胞增殖的抑制作用趋于饱和.

低聚葡萄籽原花青素对顺铂所致人胚肾细胞线粒体损伤的保护作用

目的:探究低聚葡萄籽原花青素(oligomeric grape seed proanthocyanidins,O-GSP)对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)导致的人胚肾细胞HEK293中线粒体损伤的保护作用及其作用机制。方法:通过试剂盒检测O-GSP、CDDP及O-GSP+CDDP处理后细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(reaction oxygen species,ROS)含量、细胞质内糖代谢酶(己糖激酶和乳酸脱氢酶)活力和线粒体糖代谢酶(苹果酸脱氢酶)活力变化情况,并采用流式细胞术对各组细胞ATP含量、线粒体膜电位变化以及细胞凋亡率进行检测。结果:O-GSP预处理极显著改善了CDDP引起的细胞内MDA含量升高,还原型GSH、ROS、ATP含量及线粒体膜电位降低和糖代谢异常(P<0.01),从而减轻了CDDP诱发的线粒体损伤,对HEK293细胞凋亡有极显著的缓解作用(P<0.01)。结论:O-GSP对CDDP所致HEK293细胞线粒体损伤具有拮抗作用,并且该作用与O-GSP的抗氧化活性有关。

构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖

背景:研究发现SMARCAL1在人类发育和成熟肾脏的多种细胞类型中选择性表达,表明其在肾脏发育过程中发挥着重要的功能作用。目的:探讨SMARCAL1过表达对于胚肾细胞增殖功能的影响。方法:取293T细胞和HEK293细胞的第3代细胞用于实验。选用pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒。实验分为3组:空白组为无处理的HEK293细胞;阴性对照组为转染空载病毒的HEK293细胞;SMARCAL1过表达组为转染SMARCAL1过表达病毒的HEK293细胞。对SMARCAL1过表达慢病毒转染后用嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。通过观察转染率来检测病毒滴度;荧光定量PCR和Western印迹法验证稳转细胞株;CCK-8和EdU染色法检测细胞增殖情况;进一步通过荧光定量PCR探讨对Wnt通路的影响。结果与结论:①SMARCAL1过表达质粒基因序列与目的基因一致,经慢病毒包装后测得SMARCAL1过表达慢病毒滴度为1×108 TU/mL,空载慢病毒滴度为3×108 TU/mL;②与空白组和阴性对照组比较,SMARCAL1过表达慢病毒转染后细胞中SMARCAL1 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05),细胞增殖活力明显下降(P<0.05),Wnt通路中CTNNB1和WNT4基因表达水平降低(P<0.05);③实验结果表明,SMARCAL1过表达慢病毒载体构建成功并能够在细胞中顺利表达;SMARCAL1基因可能通过Wnt通信号通路参与调节胚肾细胞增殖,进而影响肾脏发育。

溶质转运体26A家族在HEK-293细胞中的表达和功能

目的构建能在HEK-293细胞膜上表达的溶质转运体26A家族(SLC26A)的蛋白质粒,并对其生理功能进行检测。方法构建多种人类SLC26A转运体-绿色荧光蛋白的融合质粒,并使用瞬时转染技术将其表达在人胚肾293细胞(HEK-293)中。用全细胞膜片钳技术记录表达有SLC26A蛋白的HEK-293细胞的膜电容。结果每个SLC26A转运体均能在HEK-293细胞的细胞膜上表达,并表现出和离子相互作用的生理功能。SLC26A转运体与离子结合的数目与其在细胞膜上的表达程度正相关并具有一定的离子选择性。结论 SLC26A转运体家族能够在HEK-293细胞上表达并具有与转运离子结合的生理功能。在HEK-293细胞系中表达SLC26A转运体家族的研究方法,为进一步研究此家族成员转运功能及其转运机制提供了可能。