两种牙科材料对人胚胎干细胞来源成纤维细胞的细胞毒性研究

目的:观察口腔常用材料氢氧化钙(calcium hydroxide,CH)和复合树脂对人胚胎干细胞来源成纤维细胞(embryo body fibroblasts-H9,EBf-H9)、原代培养人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)及小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性,探讨使用EBf-H9评价牙科材料生物安全性的可行性。方法:诱导人胚胎干细胞(H9)分化为EBf-H9,原代培养hDPCs,并经免疫细胞化学染色鉴定。用细胞计试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测比较梯度浓度CH和复合树脂浸提液对EBf-H9、hDPCs和L929细胞的细胞毒性。结果:CH或复合树脂分别作用24 h和48 h(或72 h)之后,L929细胞的存活率显著低于EBf-H9和hDPCs(P<0.05),但EBf-H9和hDPCs的细胞存活率没有统计学差异(P>0.05)。结论:对于CH和复合树脂的毒性反应,L929细胞与hDPCs有较大差异,EBf-H9比L929细胞更接近hDPCs的反应,提示在牙科材料生物安全性评价中,人胚胎干细胞来源成纤维细胞具有替代现有细胞检测模型的潜力。

人胚胎干细胞来源的成纤维细胞支持无动物源污染条件下的人精原干细胞生长

精原干细胞在人出生后可以连续分裂以支持精子形成，将遗传信息传递给下一代。在本文中，我们成功地从睾丸组织中分离并鉴别人精原干细胞的一种新方法，并在人胚胎干细胞来源的成纤维细胞上扩增人精原干细胞。在这种人胚胎干细胞来源的成纤维细胞上可维持大量的人精原干细胞并且在组合生长因子，特别是胶质细胞来源的神经生长因子存在的条件下扩增至少2个月。细胞表面标志分析显示这些精原干细胞具有高水平的碱性磷酸酶的表达并保持了高水平的胚胎特异阶段抗原SSEA-1，OCT4和CD49f的表达。用逆转录PCR反应检测出OCT4，SOX3，STRA8基因的表达。这些数据清晰地表明运用人胚胎干细胞来源的成纤维细胞来支持人精原干细胞的一个新的策略，并排除了异源物种的污染。这个系统提供了新的机会去了解干细胞巢对于控制精原干细胞自我更新的调节机制，并将对于精原干细胞潜在的临床应用提供有用的精原干细胞。

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用

背景：有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达。目的：在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用。方法：购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3~5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104个/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24h之后使用。复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上。在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组：对照组（标准培养基＋血管内皮生长因子＋干细胞因子组）、实验组（标准培养基＋血管内皮生长因子＋干细胞因子＋碱性成纤维细胞生长因子组）。各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1＋细胞表达情况,并用IMAGE-PROPLUS图像分析系统统计阳性细胞数及平均吸光度值。结果与结论：与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量（P〈0.01）,Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加（P〈0.01）。证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖。

5-氮胞苷联合碱性成纤维生长因子诱导人胚胎干细胞定向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)联合碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)定向分化为心肌样细胞的可行性。方法采用小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层细胞体外培养h ESCs,经悬浮培养形成拟胚体(embryoid bodies,EB),贴壁后分为无诱导剂组(对照组)、5-aza诱导组、b FGF诱导组、5-aza+b FGF联合诱导组4组诱导培养。诱导时间为2周。倒置相差显微镜下连续动态观察细胞形态学变化,并计算各组出现自发搏动的EB,以定量聚合酶链反应检测心肌细胞特异性基因NKX2.5、GATA4、α-actin,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T(cardiac troponin T,c Tn T)。结果 EB克隆贴壁诱导3~4 d后部分细胞出现自发性节律性搏动,以5-aza+b FGF联合诱导组为著。14 d后定量聚合酶链反应检测示5-aza+b FGF联合诱导组NKX2.5、GATA4、α-actin表达显著高于其他3组(P<0.05)。免疫荧光法示5-aza+b FGF联合诱导组c Tn T的表达最为明显(P<0.05)。结论 h ESCs在体外经5-aza+b FGF联合诱导后可定向心肌细胞分化,该诱导方案为心肌再生与组织工程领域的研究奠定了基础。

人胚胎成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的作用

目的 :比较人和小鼠胚胎成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的作用 ,为胚胎干细胞定向诱导各系统细胞应用于临床 ,消除异种蛋白污染打下基础。方法 :分别采用人胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层细胞 ,支持人受精卵的培养 ,观察其增殖和分化情况。结果 :人和小鼠胚胎成纤维细胞分别加入白血病抑制因子 (hLIF)均能很好支持人胚胎干细胞生长增殖 ,并保持未分化状态。结论 :完全可以使用人胚胎成纤维细胞支持人胚胎干细胞增殖 ,消除异种蛋白污染的可能性 ,为胚胎干细胞定向诱导分化发育应用于临床打下坚实基础。

小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态

目的:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题,观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态。方法:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。①对象:包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12.5～14.5d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0h后,按1×108L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后,按1:0,3:1,1:1,1:3,0:1比例混合,然后以1×108L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层。③实验评估:观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态。并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况。结果:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1:1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1:3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例。③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300bp和300～400bp处可见OCT-4和端粒酶 mRNA表达的特异性条带。④体外分化实验:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1:1时效果较好。

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎大鼠神经干细胞增殖分化的影响

目的 探讨分离、培养及鉴定胚胎大鼠神经干细胞 (NSCs)方法 ,观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NSCs增殖、分化的影响。方法 从大鼠胚胎脑组织中分离出NSCs,用bFGF和胎牛血清诱导其增殖和分化 ,予BrdU以标记分裂细胞 ,采用免疫细胞化学鉴定NSCs和分化神经细胞。结果 大鼠胚胎脑NSCs在无细胞因子和胎牛血清的培养基中无新生细胞形成 ,但能在bFGF和血清诱导下形成克隆 ,并产生nestin和Br dU阳性细胞 ,贴壁后分化为神经元和星形胶质细胞。结论 该方法从大鼠胚胎大脑分离出的细胞具有NSCs特性 ,即自我更新和多向分化潜能 ;

胰岛素样细胞生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子α对人表皮干细胞增殖的影响

目的表皮干细胞是组织工程化皮肤的"种子细胞"。文中研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,bFGF)、胰岛素样细胞生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和转化生长因子α(transforming growth factorα,TGFα)对人表皮干细胞增殖的影响。方法采用两步酶消化法和Ⅳ型胶原差速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞,将表皮干细胞分为A组(K-SFM)、B组(K-SFM+bFGF)、C组(K-SFM+IGF-1)及D组(K-SFM+TGFα)进行培养。比较不同组之间表皮干细胞的克隆形成率、生长增殖、生长曲线和细胞周期等指标。结果 B组、C组及D组培养的表皮干细胞在细胞增殖、细胞克隆率方面检测结果均明显高于A组(P<0.05);流式细胞仪检测B组、C组与A组及D组处于G0/G1细胞比例比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IGF-1、bFGF及TGF-α均对表皮干细胞的增殖有促进作用,IGF-1及bFGF对表皮干细胞表型的维持有较好的作用。

血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞

背景:骨髓间充质干细胞植入机体不同类型组织后可以分化为相应组织的靶细胞,提示机体内局部微环境可诱导和决定干细胞的发育取向,但其诱导分化条件和具体作用机制尚不清楚。目的:检测血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞的可行性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-03/2007-01在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:健康骨髓来源于南昌大学第一附属医院内科同期收治的临床骨髓穿刺检查正常的5例住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史。血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Cytolab公司产品。方法:无菌条件下取健康人骨髓,采用Ficoll密度梯度离心+贴壁法分离纯化培养骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞,诱导组加入含10μg/L血管内皮细胞生长因子、5μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10%胎牛血清的DMEM培养液,对照组仅加入含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度恒温培养箱培养14d。主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态学变化,免疫细胞化学染色检测CD34、Ⅷ因子的表达,透射电镜观察细胞超微结构。结果:诱导组细胞由长梭形变为短梭形和扁平形,呈内皮样细胞形态特征,CD34、Ⅷ因子均呈阳性表达,细胞胞浆内可见W-P小体。对照组细胞CD34、Ⅷ因子呈阴性。结论:血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子可成功诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞。

碱性成纤维细胞生长因子体外诱导犬骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨不同剂量的碱性成纤维细胞生长因子体外定向诱导犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的可行性。方法采用密度梯度离心法分离犬BMSCs并进行传代培养。四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术检测第3代BMSCs的增殖及DNA周期;取第3代BMSCs设置对照组,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10、100μg·L^(-1)组进行体外诱导培养,镜下观察其形态变化,细胞生长曲线法检测细胞增殖情况;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I(TnI)、肌球蛋白重链(MHC)和波形蛋白(Vimentin)的表达。结果密度梯度离心法得到的BMSCs呈长梭形、聚集性生长,第3代BMSCs MTT法检测结果显示细胞生长阶段为潜伏期、对数生长期及平台期。DNA周期检测结果:G_0/G_1期为(91.90±1.68)%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态。经诱导分化3周后,3组细胞经生长曲线法检测结果显示:1~3 d,bFGF10、100μg·L^(-1)组细胞数较对照组增殖明显,差异有统计学意义(P<0.05);4~5 d,对照组细胞呈对数生长趋势,bFGF 10、100μg·L^(-1)组细胞数量减少;6~7 d,bFGF诱导组较对照组细胞数明显减少(P<0.05),而bFGF 10μg·L^(-1)组与bFGF100μg·L^(-1)组比较细胞数量明显偏少(P<0.05)。免疫荧光法检测结果显示:经诱导分化4周后,bFGF 10μg·L^(-1)组和bFGF100μg·L^(-1)组的细胞均表达TnI和MHC,不表达Vimentin;对照组均不表达TnI、MHC和Vimentin。结论 10μg·L^(-1)bFGF能够有效促进BMSCs的体外增殖,并具有向心肌样细胞分化能力。

人成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的支持作用

目的观察人成纤维细胞对人胚胎干细胞(hESC)生长的支持作用,建立完全非动物源性培养系统。方法采用人包皮成纤维细胞为饲养层,以血清替代品取代动物血清,支持人胚胎干细胞生长,观察其增殖和分化情况。结果包皮成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞生长增殖,并保持87%左右未分化表型:碱性磷酸酶(AKP)染色强阳性,阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3),肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60)表达强阳性,可见转录因子OCT-4 mRNA表达。核型正常,体外能形成拟胚体。结论人成纤维细胞完全可以支持人胚胎干细胞增殖,可望为胚胎干细胞定向诱导分化应用于临床打下基础。

人骨髓胚胎样干细胞向多核肌纤维诱导分化的研究

目的:比较骨髓来源的胚胎样干细胞(ELSCs)与间充质干细胞(MSCs)的体外成肌分化能力。方法:采用胚胎干细胞扩增用的无血清Knockout-DMEM培养基在明胶包被过的培养瓶中培养人骨髓单个核细胞以分离ELSCs,传统方法从相同骨髓中分离MSCs,倒置相差显微镜下观察细胞形态特征,采用免疫荧光染色鉴定多潜能抗原标志的表达。成肌分化液分别培养ELSCs和MSCs,采用免疫染色法检测肌纤维特异性抗原标志肌球蛋白重链(MHC)、成肌素(myogenin)和MyoD蛋白的表达,RT-PCR检测MHC、myogenin和MyoD mRNA的表达,计算MHC阳性肌纤维的比例以比较ELSCs与MSCs的体外成肌分化能力。结果:无血清培养基可从骨髓中分离到弱表达多潜能抗原标志Oct-4、Nanog-3和Sox-2的ELSCs,体积较小,形态纤细均一,在形态方面不同于相同骨髓来源的MSCs,后者不表达多潜能抗原标志。在成肌分化液中培养,ELSCs和MSCs均可被诱导为在蛋白和mRNA水平表达MHC和myogenin的多核肌纤维,但诱导培养10 d时,ELSCs的MHC蛋白阳性肌纤维的比例为(25.7±4.1)%,MSCs为(15.8±7.6)%,ELSCs的成肌分化能力明显高于MSCs(P<0.05)。结论:骨髓ELSCs能被诱导为多核肌纤维,并具有比来自相同骨髓的MSCs更强的成肌分化能力,ELSCs是肌病治疗更理想的种子细胞。

碱性成纤维细胞生长因子等体外诱导成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 成人骨髓间充质干细胞 (h MSCs)体外定向诱导分化为神经元样细胞。方法 采用 Percoll分离液离心分离 h MSCs,体外扩增 ,分别采用含碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)和 2 -巯基乙醇 (2 - ME)等无血清DMEM诱导 h MSCs分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 h MSCs在体外扩增传至 5代后 ,流式细胞仪显示 99.5 % ,97.8% ,98.8% h MSCs表面抗原 CD2 9、CD4 4、CD90 表达阳性。接种到 12孔板 ,3d后加入 b FGF和 2 - ME联合或 2 - ME单种诱导剂诱导后 ,h MSCs胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞 NSE、 NF表达阳性 ,GFAP阴性。

碱性成纤维细胞生长因子诱导人间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化中的作用,及其对MSCs增殖的影响。方法用含5-氮杂胞苷(5-aza)的培养基(A组)、含bFGF的培养基(B组)、含5-aza+bFGF的培养基(C组)以及普通培养基(对照组)培养人骨髓MSCs。观察细胞形态的改变;免疫细胞化学法检测α-actin、cTnT和connexin-43的表达;RT-PCR法检测Nkx2·5、GATA-4和cTnT的mRNA水平;MTT法检测MSCs的增殖。结果A组和C组的部分细胞呈肌细胞样改变,表达蛋白α-actin,cTnT和connexin43;A组和C组的cTnT、Nkx2·5和GATA-4的mRNA水平明显高于对照组,B组的Nkx2·5和GATA-4的mRNA水平明显高于对照组;B组细胞增殖明显高于对照组,A组和C组细胞增殖明显低于对照组,但C组明显高于A组。结论bFGF能明显促进MSCs增殖,与5-aza合用能更好地诱导人MSCs向心肌样细胞分化。

碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子影响骨髓间充质干细胞增殖及胶原合成

背景:在皮肤修复及瘢痕形成过程中如何控制胶原蛋白的有序形成是值得关注的热点。目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子与胰岛素样生长因子1对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖及胶原合成的影响。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行成脂及成骨分化鉴定,在第3代细胞培养液中分别添加碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1以及两者联合干预,以加入正常培养基为对照组。培养12,24,48,72,96 h时采用MTT检测细胞增殖情况,培养10 d时采用RT-PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原m RNA表达,Western Blot检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达。结果与结论:1与对照组比较,单独应用碱性成纤维细胞生长因子可显著促进骨髓间充质干细胞增殖,抑制Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达。2单独应用胰岛素样生长因子1可显著促进骨髓间充质干细胞增殖,促进Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达。3两种生长因子联用相比单独应用,促进增殖效果更为显著,同时使Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达趋于正常水平。4结果表明碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1联合应用在促进骨髓间充质干细胞增殖的同时能够对Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达有所限制,可能有助于控制瘢痕形成及促进创伤愈合。

成纤维生长因子-2联合骨形态发生蛋白-2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的:观察纤维生长因子-2(FGF-2)与骨形态发生蛋白-2(BMP-2)单一及联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向心肌样细胞分化的效果。方法:从SD大鼠骨髓中分离提取BMMSCs,细胞传至第2代时加入诱导物质,分组(FGF-2诱导组、BMP-2诱导组、联合诱导组及空白对照组)培养。应用免疫细胞化学法对培养至第28天时4组细胞中cTnT、desmin、α-actin、p38mapk蛋白表达情况进行检测;应用RT-PCR法对4组细胞中GATA-4、Nkx2.5及α-MHC mRNA的表达量进行测定。结果:常规养至第28天时,联合诱导组细胞中cTnT、desmin、α-actin和p38mapk蛋白表达的阳性率依次为(30.14±8.66)%、(45.30±6.96)%、(60.95±7.73)%和(43.50±7.32)%,且FGF-2诱导组、BMP-2诱导组各指标的阳性率均低于联合诱导组(P<0.05)。FGF-2诱导组、BMP-2诱导组细胞中Nkx2.5及GATA-4 mRNA的表达量在第7、14、28天均呈现"高-低-高"的变化趋势;而联合诱导组中以上两种基因的表达量呈现"低-高-高"的表达趋势;且第28天时联合诱导组中以上两种基因的表达量明显高于单一诱导组(P<0.05);各组细胞均未见α-MHC mRNA表达。结论:BMMSCs可在FGF-2与BMP-2单一及联合诱导下发育为心肌样细胞,且两者联合诱导效果更佳。

电针刺激对脊髓损伤大鼠植入脐血干细胞后生长相关蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子表达的影响

目的探讨不同电针刺激方案对大鼠脊髓损伤植入脐血干细胞后生长相关蛋白(GAP-43)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)表达的影响。方法将192只清洁级SD大鼠用NYU打击器制成T10-11段脊髓损伤模型,造模成功后随机分为:A组为运动区头皮表面投影区电刺激组(A1组电刺激+脐血干细胞移植,A2组只进行电刺激);B组为损伤局部电刺激组(B1组电刺激+脐血干细胞移植,B2组只进行电刺激);C组为运动区头皮表面投影区电刺激+局部电刺激组(C1组电刺激+脐血干细胞移植,C2组只进行电刺激);D组为损伤模型组(D1组移植脐血干细胞不进行电刺激,D2组不移植不进行电刺激)。各组分别于1周、2周、3周、4周、8周、12周取材,采用免疫组织化学荧光染色检测生长相关蛋白(GAP-43)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)的阳性表达。结果在各时间点上,电刺激均能提高生长活性物质GAP-43、bFGF、IGF水平;头针加体针的影响大于单纯头针或体针;干细胞移植后水平更高。结论电刺激与干细胞移植对脊髓损伤后微环境均有有利影响,并有协同作用;头针加体针优于单纯头针或体针。

成纤维细胞生长因子2和丹参酮ⅡA在大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的探讨成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化中的作用。方法体外分离、培养BMSCs,利用流式细胞术进行鉴定。实验分组:对照组(不加任何诱导剂)、FGF-2组、丹参酮ⅡA组及两者联合诱导组。MTT检测诱导后的活性及增殖情况;Real-time PCR检测早期心肌转录因子GATA-4、Nkx2.5的表达;免疫细胞化学染色法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)以及心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的表达;免疫荧光化学染色法检测结蛋白(desmin)、原肌球蛋白(Tm)的表达;Western blotting检测结蛋白、Tm的表达。结果各诱导组较对照组增殖明显。与对照组相比,诱导组GATA-4和Nkx2.5基因的表达增强,联合组表达量最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。联合诱导组各标记物Cx43、cTnI、结蛋白、Tm的阳性表达率高于FGF-2及丹参酮ⅡA单独诱导组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blotting结果显示,联合诱导组结蛋白、Tm的表达量明显高于其他实验组,差异具有统计学意义(P<0.05)。透射电子显微镜结果显示,诱导后细胞的细胞核居中,细胞质中可见肌丝、粗面内质网、线粒体和核糖体。结论FGF-2和丹参酮ⅡA均能促进BMSCs增殖,诱导BMSCs分化为心肌样细胞,两者联合诱导的效果较其他组更佳。

体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层克隆兔角膜缘干细胞

目的研究兔胚胎成纤维细胞体外克隆兔角膜缘干细胞。方法兔胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C(MMC)处理成饲细胞,用消化法培养兔角膜缘基底层细胞并接种于含有经MMC处理饲细胞的12孔培养板,进行原代培养。观察其光镜特征、电镜结构,用间接免疫细胞化学染色等对克隆的细胞进行综合鉴别。结果克隆的细胞呈典型的上皮细胞形态,电镜下可见微绒毛、桥粒、张力丝等典型上皮细胞结构,单克隆抗体AE1、PCNA染色后细胞大多数阳性,单克隆抗体AE5染色后细胞染色偶见阳性。结论体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层成功地克隆出兔角膜缘干细胞。

应用胚胎干细胞试验模型对碱性成纤维细胞生长因子发育毒性的初步评价

目的利用小鼠胚胎干细胞试验(EST)模型,初步评价bFGF的发育毒性。方法体外培养小鼠胚胎干细胞(ESC),通过形态学观察、碱性磷酸酶染色和RT-PCR方法进行ESC未分化鉴定;MTT法检测不同浓度bFGF对ESC和3T3细胞的毒性,RT-PCR半定量分析法检测bFGF对未分化基因Sox-2表达的影响。结果 bFGF对ESC和3T3的半数抑制浓度和ESC的半数抑制分化浓度分别为IC50ESC=15.2 mg.L-1,IC50 3T3=24.2 mg.L-1,ID50 ESC=1.7 mg.L-1。结论 bFGF发育毒性的判定为弱胚胎毒性。