利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。

3D培养诱导胚胎成纤维细胞为神经前体样细胞

目的探讨3D培养微环境和小分子组合(ATPV)对胚胎成纤维细胞诱导为神经前体样细胞的影响。方法在0.5%琼脂糖低粘附3D培养微环境和ATPV处理下,将小鼠胚胎成纤维细胞形成3D球体,分别通过RT-PCR、免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色的方法检测神经前体细胞标记基因的表达水平。结果在3D环境下培养,随着成球培养时间的增长,小鼠胚胎成纤维细胞NPC特异性标记基因的表达明显上升,表现出神经前体样细胞的特征,并且3D ATPV培养微环境明显提高了小鼠胚胎成纤维细胞向神经前体样细胞的转化效率。结论小鼠胚胎成纤维细胞在3D和3D ATPV微环境下,聚集成球培养后逐渐获得了干细胞特征并诱导为神经前体样细胞,暗示着成球培养和小分子微环境可以给小鼠胚胎成纤维细胞创造一种良性的细胞聚集微环境,诱导神经前体样细胞的产生,这将为神经退行性病变的细胞替代疗法带来新的细胞来源。

小分子组合诱导大鼠胚胎成纤维细胞重编程为功能性神经元

目的:建立通过小分子化合物将大鼠胚胎成纤维细胞(REF)重编程为化学诱导神经元(ciNC)的方法体系,为细胞移植治疗神经退行性疾病提供安全有效的供体细胞。方法:以裴钢研究团队建立的人成纤维细胞直接重编程为神经元的方法为基础,通过更换包被液、缓解氧化应激损伤、添加神经源性保护因子、调整毛喉素浓度和小分子去除实验对诱导培养基和成熟培养基进行优化,并通过免疫荧光法和蛋白质印迹法验证不同诱导阶段细胞的相关蛋白质。结果:以原方案进行诱导时,细胞存活率仅(34.24±2.77)%。包被液更换为基质胶后,细胞存活率上升到(45.41±4.27)%;添加褪黑素后细胞存活率提高至(67.95±5.61)%,(23.43±1.42)%的细胞转变为神经样细胞;添加小分子P7C3-A20后细胞存活率进一步提升至(76.27±1.41)%,(39.72±4.75)%的细胞转变为神经样细胞;毛喉素浓度提升至30μmol/L时,神经样细胞比例达到(55.79±1.90)%;去除SP600125后,(86.96±2.15)%细胞存活,神经样细胞生成率提高至(63.43±1.60)%。以优化后的方案诱导,可经过神经前体细胞将REF诱导为ciNC。其中,神经前体细胞能够高表达神经前体细胞标志物SRY-box转录因子2、配对盒6以及神经元特异性标志物Ⅲ类β-微管蛋白,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达量减少。神经前体细胞在成熟培养基中诱导两周后,可见大部分细胞呈神经样细胞形态,诱导后的ciNC高表达Ⅲ类β-微管蛋白和微管相关蛋白2,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达减少。结论:优化后的小分子组合在常氧条件下能将REF重编程为ciNC。

灰毡毛忍冬乙醇提取物减缓D–半乳糖致小鼠胚胎成纤维细胞氧化应激的效果

为探讨灰毡毛忍冬乙醇提取物对D–半乳糖诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)氧化应激的保护作用及其潜在机制,通过广泛靶标代谢组测序和高效液相色谱法检测灰毡毛忍冬乙醇提取物中活性物质,采用20 mg/mL的D–半乳糖处理MEF细胞,建立细胞衰老模型,试验设置对照组(0 mg/mL的D–半乳糖)、模型组(20 mg/mL的D–半乳糖)、灰毡毛忍冬乙醇提取物组(100、500、1000μg/mL的灰毡毛忍冬乙醇提取物添加20 mg/mL的D–半乳糖)、阳性对照组(50μg/mL的三七总皂苷添加20 mg/mL的D–半乳糖),按照试验分组,将细胞在37℃、5%的CO_(2)培养箱中培养48 h,检测细胞抑制率、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量、线粒体膜电位(MMP)和线粒体活性氧(mtROS)水平,以及p53、p16、线粒体复合体基因、Bcl–2、Caspase–3的表达水平。结果表明:灰毡毛忍冬乙醇提取物中含有酚酸、黄酮、有机酸、萜类等大量活性物质;与对照组相比,模型组细胞抑制率显著增加,细胞数量显著减少,MMP下降,mtROS水平增加,SOD含量降低,MDA含量增加,线粒体复合体蛋白NDUFV1和抑凋亡蛋白Bcl–2明显下降,Caspase–3明显上升;与模型组相比较,灰毡毛忍冬乙醇提取物组和阳性对照组有效降低了细胞抑制率,显著提高了细胞数量和SOD活性,降低了MDA含量,提高MMP水平,降低mtROS含量,有效降低p53、p16、Caspase–3的蛋白水平,升高Bcl–2、NDUFV1的蛋白水平。说明在MEF细胞中,灰毡毛忍冬乙醇提取物可通过增加线粒体复合体I蛋白富集和减缓细胞凋亡来减弱D–半乳糖所诱导的氧化应激效应。

小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞体外编程为神经前体细胞

目的通过小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞(HEFs)重编程为化学诱导神经前体细胞(ciNPCs)。方法HEFs重编程为ciNPCs涉及两个阶段,第1阶段是小分子组合诱导阶段,常氧条件下,将HEFs在含有小分子化合物组合VCR(VPA,CHIR99021,Repsox)的KSR培养基中培养15 d,HEFs形态发生变化,形成致密细胞集落。第2阶段是特异性诱导ciNPCs,将形成的细胞集落胰酶消化后,低粘附板中悬浮培养,可以形成ciNPCs神经球。采用CM-DiI染料标记P3代ciNPCs,并将其移植于6-OHDA法制作的帕金森大鼠模型右脑内侧前脑束(MFB)区,检测ciNPCs在PD大鼠脑内微环境中的存活、迁移以及分化状况。结果VCR组合诱导10 d细胞开始出现明显的聚集趋势,15 d时,形成致密的细胞集落。单层培养1×10^(5)/孔中大约形成40个克隆,且AP染色呈阳性。将细胞集落消化后,低粘附板中悬浮培养培养2 d,可见大量神经球形成,即为第1代ciNPCs(P1代)。ciNPC高表达神经前体细胞(NPCs)特异性标记物(Nestin、Pax6和Sox2),经体外神经特异性诱导分化,ciNPCs表达神经元特异性标记物Tuj1和星形胶质细胞特异性标记物GFAP。而且,P3代ciNPCs移植PD大鼠脑内4周后,可以分化为Tuj1+、GFAP+、TH+和GABA+细胞。结论VCR可以将HEFs重编程为ciNPCs,而无需引入外源性基因,为神经科学研究和神经退行性疾病的治疗提供有利的供体材料。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)分离和培养的一些因素 ,以建立稳定的 MEF培养体系。方法 取 BAL B/ c小鼠胚胎分离成纤维细胞 ,利用体外培养体系 ,对 MEF的生长形态、生长曲线及细胞周期进行观察 ,并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对 MEF分离及培养的影响进行研究。结果 13.5 d胎龄鼠胚的 MEF分离效果优于 10 .5 d、18.5 d胎龄鼠胚 ;MEF在体外为贴壁生长型细胞 ,第三代细胞增殖旺盛 ;在室温条件下 ,0 .2 5 %胰酶消化 MEF时间以 3～ 5 min为宜。结论 MEF在第 3代增殖旺盛 。

北京油鸡胚胎成纤维细胞系建立与生物学特性研究

采取组织块直接培养法,对北京油鸡胚胎组织进行原代和继代培养,成功地建立了成纤维细胞系.并对培养细胞进行了形态学、细胞生长动力学观察,以及核型和乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的同工酶分析.结果表明,该细胞系的群体倍增时间(PDT)为24 h;细胞染色体中二倍体占主体,为76%～88%;乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶同工酶电泳图谱与本室其它细胞系有明显差别;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性.该细胞系的建立,使北京油鸡这一国家重要种质资源在细胞水平上保存下来,也为基因组文库和体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料.

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳分离培养及丝裂霉素C(MMC)处理的方法,用于培养胚胎干细胞。方法:取不同胎龄的胎鼠分离原代成纤维细胞,观察不同胎龄和培养、分离条件对细胞增殖的影响;观察不同浓度和不同作用时间下MMC对细胞增殖的抑制作用。用MTT法测定细胞增殖的数量。取妊娠3.5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果:制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄是12.5～14.5d;室温条件下,0.25%胰蛋白酶消化时间最好在3～5min之内;原代细胞培养2～4d后即可传代,MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是20μg/ml,2～4h,成纤维细胞饲养层可以维持10d。囊胚在饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。结论:从12.5～14.5d胎龄小鼠胚胎分离培养的胚胎成纤维细胞质量最佳,经20μg/mlMMC处理2～4h后,可以作为饲养层用于胚胎干细胞的分离克隆。

碳、氧化锌和碳载氧化锌复合纳米颗粒对小鼠胚胎成纤维细胞活性抑制及DNA损伤的研究

目的探讨不同化学组成纳米颗粒对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的毒性效应及机制。方法选择纳米碳、纳米氧化锌、碳载氧化锌复合纳米颗粒制备细胞染毒悬液,三种纳米颗粒分别设立5个剂量组(5、10、20、50和100μg/ml)对BALB/c小鼠胚胎成纤维细胞进行24h、48h、72h染毒培养;利用细胞形态学观察和噻唑蓝实验(MTT比色法)检测上述三种纳米颗粒对细胞活性的影响;通过单细胞凝胶电泳(彗星试验)检测低剂量纳米颗粒对细胞DNA的损伤作用。结果三种纳米颗粒能够明显影响MEF细胞的生长形态,对细胞活性的抑制作用具有明显的时间-效应和剂量-效应关系;纳米碳、纳米氧化锌及复合纳米颗粒的半数致死浓度分别为21.85、21.94和23.02μg/ml;随染毒剂量升高,纳米氧化锌颗粒对细胞活性的抑制作用显著增强;低剂量水平上,复合纳米颗粒造成的DNA损伤最为明显。结论化学组成不同的纳米颗粒能够对MEF细胞造成毒性损伤;当暴露剂量达到一定水平时,纳米颗粒的金属成分含量可能是其毒性作用的主导因素。

4种典型纳米材料对小鼠胚胎成纤维细胞毒性的初步研究

为探讨不同种类纳米材料对原代培养小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblasts,MEF)的毒性效应及作用机制,选择4种典型的纳米材料(纳米碳、单壁碳纳米管、纳米氧化锌、纳米二氧化硅)制备颗粒悬液,设立5个剂量组(5、10、20、50、100μg·mL-1)对BALB/c小鼠MEF细胞进行24、48、72h染毒培养,利用细胞形态学观察和噻唑蓝实验(MTT比色法)检测上述4种纳米材料对MEF细胞活性的影响,同时,测定染毒24h后细胞培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性以探讨纳米颗粒对细胞膜完整性的影响.结果显示:1)4种纳米材料均能明显影响MEF细胞的生长形态.染毒24h后,MEF细胞发生不同程度的回缩变形,细胞间隙增大,排列稀疏,胞内颗粒物增多,细胞透明度下降.2)纳米碳、纳米氧化锌、纳米二氧化硅对MEF细胞增殖的抑制作用和对细胞膜完整性的损伤作用均随染毒剂量的升高而增强,具有明显的剂量-效应关系,其半数致死浓度(24h-IC50)分别为21.85、21.94、461.10μg·mL-1;碳纳米管组的剂量-效应之间不呈对数线性关系,未能得出其24h-IC50.3)在不同染毒剂量水平上,4种纳米材料的毒性对比差异显著:低剂量水平上纳米碳与碳纳米管的毒性强于纳米氧化锌和纳米二氧化硅,随着剂量的升高纳米氧化锌的细胞毒性升高最为显著.结果提示,纳米材料能够对MEF细胞造成毒性损伤,破坏细胞膜的完整性可能只是作用途径之一;纳米材料的毒性可能受粒径、形状、化学组成等许多因素的影响.

人胚胎成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的作用

目的 :比较人和小鼠胚胎成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的作用 ,为胚胎干细胞定向诱导各系统细胞应用于临床 ,消除异种蛋白污染打下基础。方法 :分别采用人胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层细胞 ,支持人受精卵的培养 ,观察其增殖和分化情况。结果 :人和小鼠胚胎成纤维细胞分别加入白血病抑制因子 (hLIF)均能很好支持人胚胎干细胞生长增殖 ,并保持未分化状态。结论 :完全可以使用人胚胎成纤维细胞支持人胚胎干细胞增殖 ,消除异种蛋白污染的可能性 ,为胚胎干细胞定向诱导分化发育应用于临床打下坚实基础。

两种牙科材料对人胚胎干细胞来源成纤维细胞的细胞毒性研究

目的:观察口腔常用材料氢氧化钙(calcium hydroxide,CH)和复合树脂对人胚胎干细胞来源成纤维细胞(embryo body fibroblasts-H9,EBf-H9)、原代培养人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)及小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性,探讨使用EBf-H9评价牙科材料生物安全性的可行性。方法:诱导人胚胎干细胞(H9)分化为EBf-H9,原代培养hDPCs,并经免疫细胞化学染色鉴定。用细胞计试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测比较梯度浓度CH和复合树脂浸提液对EBf-H9、hDPCs和L929细胞的细胞毒性。结果:CH或复合树脂分别作用24 h和48 h(或72 h)之后,L929细胞的存活率显著低于EBf-H9和hDPCs(P<0.05),但EBf-H9和hDPCs的细胞存活率没有统计学差异(P>0.05)。结论:对于CH和复合树脂的毒性反应,L929细胞与hDPCs有较大差异,EBf-H9比L929细胞更接近hDPCs的反应,提示在牙科材料生物安全性评价中,人胚胎干细胞来源成纤维细胞具有替代现有细胞检测模型的潜力。

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境。目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞。方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的最佳条件。结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞最佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15min,丝裂酶素最佳作用质量浓度和时间为10mg/L作用2.5h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12d。0.05%胰蛋白酶消化15～20min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景:建立一种既可以大量制备,又易于保存并保持较高活性的饲养层细胞是人胚胎干细胞培养研究的重要环节。目的:建立昆明小鼠胚胎成纤维细胞的最佳分离培养方法,评价其用于人胚胎干细胞饲养层研究的可行性。方法:用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养昆明小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性,制备胚胎成纤维细胞饲养层,检测人胚胎干细胞在饲养层上培养的生长状态。结果与结论:制备昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.5 d。不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的胚胎成纤维细胞生长状态好,获得的成纤维细胞纯度高,增殖活跃。冻存2周,1,3,6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。小鼠胚胎成纤维细胞在第2-4代增殖旺盛,第5代以后细胞增殖活力明显下降。人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞长期传代后呈典型的未分化形态,碱性磷酸酶和过碘酸-雪夫染色均为阳性。结果表明建立的昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养法可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和饲养层细胞的制备

通过实验确定分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄，探讨小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的效果及其寿命。结果表明，从１０ 、１１ ｄ 小鼠胚胎所获的胚胎成纤维细胞中混有大量神经母细胞和红细胞；用１４ 、１５ ｄ 的胚胎则基本不能获得胚胎成纤维细胞；消化３ ～４ 个１２ ～１３ ｄ 胚胎所获细胞悬液可接种８～９ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。从一只孕鼠的所有胚胎所获的成纤维细胞可接种约２０ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。所获细胞悬液的活细胞百分率可达９０％ ，接种成活率达８５ ％ 。胚胎成纤维细胞贴壁时间为５～６ ｈ ，１２ ｈ 后进入增殖期，４８ ｈ 形成细胞单层。ＥＳ细胞克隆在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上形态典型、增殖迅速、不分化。饲养层寿命可维持２ ～３ 周。

人胚胎成纤维细胞对人胚胎生殖细胞生长的作用

目的:研究人胚胎成纤维细胞对人胚胎生殖细胞(EG细胞)生长的作用。方法:采用组织块体外培养法体外培养人EG细胞,不添加任何细胞因子,利用源于胚胎组织自身的成纤维细胞作为饲养层,收集培养3 d和9 d的上清液,用抗体夹心ABC- ELISA法定量检测其白血病抑制因子(LIF)、干细胞生长因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量。培养的细胞用免疫细胞化学法进行SSEA-3、OCT-4的检测。结果:培养9 d的上清液中3种因子均含量为LIF 55．25 pg／ml、SCF90．39 pg／ml、 bFGF 26．06 pg／ml,均高于培养3 d相应的平均含量。培养的细胞SSEA-3、OCT-4呈强阳性表达。结论:上清液中LIF、SCF和bF- GF的含量与胚胎成纤维细胞的生长呈正比,胚胎成纤维细胞能分泌这些细胞因子,以维持EG细胞体外增殖并抑制其分化。

人胚胎成纤维细胞与小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性比较

探讨人胚胎成纤维细胞用于人胚胎干细胞体外长期培养的可行性 ,以含 10 %胎牛血清的 DMEM(低糖 )溶液为培养基 ,对人胚胎成纤维细胞的生长形态、对胰酶的敏感性、生长曲线及细胞周期进行研究 ,并与小鼠胚胎成纤维细胞作比较。结果显示 ,人胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞在体外均为贴壁生长型细胞 ,与小鼠胚胎成纤维细胞相比 ,人胚胎成纤维细胞生长更旺盛 ,且细胞寿命更长 ;在室温条件下 ,对 0 .2 5 %胰酶更敏感 ,消化时间不宜超过 3min。提示人胚胎成纤维细胞不仅在生长状况上与小鼠胚胎成纤维细胞类似 ,而且作为人胚胎干细胞体外长期培养的饲养层 ,在使用期限上优于后者 。

人胚胎成纤维细胞的分离、培养和鉴定及人胚胎生殖细胞体外生长所需细胞因子的表达

目的：从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中分离、培养及鉴定人胚胎成纤维细胞（hEFs）,检测hEFs表达人胚胎生殖细胞（hEG）体外生长所需的重要细胞因子。方法：利用酶消化法从孕5-9周龄人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜中分离培养hEFs,检测其生物学特性（细胞形态、细胞生长特点、细胞周期）。采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测hEFs表达成纤维细胞特异性标志（脯氨酰4-羟化酶β亚单位）和上皮细胞特异性标志（细胞角蛋白4）的情况,对该细胞进行鉴定。应用RT-PCR检测hEG生长所需的重要细胞因子的表达,即碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和白血病抑制因子（LIF）。结果：从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中成功地分离培养出hEFs,该细胞可传25代以上,且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变;hEFs表达脯氨酰4-羟化酶β亚单位,不表达细胞角蛋白4,确定其为成纤维细胞;该成纤维细胞表达bFGF和LIF。结论：成功地分离和培养了人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维细胞,证明其表达对于hEG体外生长起重要作用的细胞因子。

HSF1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化

目的:建立HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为HSF1的功能研究提供实验模型。方法:用脂质体介导的基因转染法将pSV 3 neo质粒导入HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞,经G 4 1 8筛选,抗性克隆扩大培养,建立永生化细胞系;用PCR检测两种细胞株中目的基因的整合,用RT-PCR法鉴定SV 4 0T基因在转染细胞中的表达;用W estern b lot检测所建细胞株的诱导型热休克蛋白7 0的表达情况。结果:有3个细胞克隆已扩大培养稳定传代达6个月,经鉴定SV 4 0 T抗原已整合到两种细胞中且稳定表达,HSF1-/-胚胎成纤维细胞热休克蛋白7 0的诱导表达消失。结论:成功建立永生化HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞。

东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的对影响东方田鼠胚胎成纤维细胞(MfEF)分离和培养的因素进行探索,并观察其生物学特性。方法取室内繁殖饲养不同胎龄的东方田鼠胚胎分离成纤维细胞,通过原代和继代培养,分析比较不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度等因素对MfEF分离及培养的影响,观察MfEF的生长形态及其生物学特性。结果 MfEF为贴壁型生长,细胞形态多样,呈梭形、不规则多边形;采用0.125%的胰蛋白酶室温消化12～13 d胚胎组织5 min,以DMEM培养基添加15%小牛血清分离培养MfEF的效果最佳;MfEF2～7代增殖最旺盛。结论获得了实验室分离、培养MfEF的有效方法 ,为进一步深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定了基础。