不同功能状态滋养层对人胚胎生殖嵴干细胞生长作用的实验研究

目的筛选并建立高效胚胎干细胞滋养层体外培养的最佳条件,利于人胚胎生殖嵴原始生殖细胞(PGC)的增殖。方法分离培养孕14.5 d(E14.5 d)和新生0 d(P0)昆明小鼠原代胚胎成纤维细胞(MEF)并传代制备滋养层,以60Coγ射线照射后继续培养并接种人PGC。采用活细胞拒染法、免疫细胞化学染色,对比观察滋养层的生长活性和照射后分泌功能;采用碱性磷酸酶(AKP)染色技术鉴定人PGCs的生长状态。结果 (1)E14.5 d和P0来源的第3～5代MEF生长旺盛。P0来源第6代与E14.5 d来源同代MEF相比深染变形细胞增达32%,经60Coγ照射后衰老细胞明显增多(P<0.05)。(2)E14.5 d来源第3～6代和P0来源第3～4代MEF经60Coγ照射后培养5 d时,Ⅰ型胶原蛋白免疫阳性细胞数目较多,染色较深;但P0来源第5代其阳性细胞数目明显减少,染色变浅。(3)人PGCs接种于E14.5 d第3代制备的滋养层3～4 d后见典型的ESC小克隆团,细胞呈圆形;AKP染色呈深蓝色团;而接种于P0来源第6代MEF制备的滋养层5～6 d,可见ESC克隆松散、变大,周围边界不清,细胞紊乱。结论以60Coγ射线照射小鼠E14.5 d来源第3～6代MEF是制备滋养层的最佳来源,可维持人PGCs增殖。

鸡胚心肌内移植入人干细胞的动物模型的建立

目的 建立人干细胞移植到鸡胚心肌中的动物模型。方法 通过显微注射的方法 ,将Hoechsst 332 5 8标记的人胚胎生殖嵴细胞 (humanprimordialgermcells ,hPGC)注射到孵化 3～ 4d的鸡胚心脏中 ,先运用人特异性的DNA探针对活鸡胚心脏切片进行原位杂交 ,以检测心肌中移植细胞的存在 ,再运用人心肌特异性抗体肌钙蛋白T(cTnT)对相邻的心肌切片进行免疫组织化学染色 ,以观察有无人心肌细胞分化 ,并统计移植成功率。结果 原位杂交显示 ,在术后 10d鸡胚的心肌中观察到有人的细胞 ,呈心肌纤维样并与鸡胚心肌细胞发生嵌合。免疫组织化学观察到鸡胚心肌中有人心肌特异性的标记物cTnT表达。移植成功率为 15 .3%± 2 .4 %。结论 在鸡胚的心肌内建立一个人干细胞移植的模型是可行的。