补肾益气和血法中药改善体外授精-胚胎移植妊娠结局及其作用机制研究

目的:观察补肾益气和血法中药介入体外授精-胚胎移植(IVF-ET)的作用效果,并从血清和卵泡液相关生殖激素、细胞因子等指标探索补肾和血法中药改善IVF-ET妊娠结局的作用机制。方法:选取2016年1月至2019年6月湖北省妇幼保健院收治的符合研究标准的患者171例作为研究对象,随机分为观察组(n=85)与对照组(n=86),2组均采用短效长方案,观察组在取卵前3个月加用中药。观察2组患者不同时期的血清和卵泡液生殖内分泌激素、相关因子水平、子宫动脉血流和临床妊娠率。结果:观察组着床率、临床妊娠率分别为54.43%、68.23%,对照组分别为36.69%、53.48%,观察组优于对照组(均P<0.05)。与对照组比较,血清中观察组人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射日、雌激素(E_(2))、孕激素(P)和睾酮(T)水平降低;取卵日E_(2)、P水平降低;移植日E_(2)水平降低;移植7日E_(2)水平升高(均P<0.05)。取卵日和移植日血清胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))和血管内皮生长因子(VEGF)水平升高,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平降低(均P<0.05)。移植7日血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF和VEGF水平升高,TNF-α水平降低(均P<0.05)。卵泡液中E_(2)水平升高,P水平降低(均P<0.05);卵泡液中IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β_(1)和VEGF水平升高,TNF-α水平降低(均P<0.05)。与对照组比较,观察组明显改善子宫动脉血流情况(P<0.05)。结论:补肾益气和血法中药可显著改善IVF-ET妊娠结局,其机制可能与补肾益气和血法中药可以调节血清和卵泡液相关生殖激素、细胞因子和子宫动脉血流有关。

基于体外受精-胚胎移植技术探讨郑惠芳补肾健脾法提高卵细胞质量经验

不孕症的发病率逐年提高,体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术为有效治疗措施,但成功率仍有待提高。究其原因,卵母细胞质量差是体外受精(IVF)仍不能成功怀孕的原因之一。郑惠芳教授认为,脾肾虚损是疾病发生发展的根源,在此基础上可化痰、生瘀而成标病。郑老辨治不孕症,非常重视五脏功能的调理,强调温补肾脾的同时要注重调肝养肝,提出“基于阴阳互根、治肾当用温补;健脾补行并举、旁涉心肾两脏;调肝疏养并施、柔顺缓急为要”等观点,处方用药具有温补特色。总结郑老的理论观点与遣方用药思路,以期为临床改善不孕症患者卵细胞质量提供理论基础和治疗思路。

补肾促卵颗粒对体外受精-胚胎移植技术周期颗粒细胞家族特异性受体α-1和细胞周期调节蛋白B1表达的影响

制约妊娠率的研究之一就是卵母细胞质量的提高。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）家族特异性受体α-1（GFRα-1）表达于在小鼠、猪等哺乳动物卵母细胞和颗粒细胞[1]。Aravin-dakshan等[2]认为卵母细胞通过间隙连接的建立通过受体GFR-1调控着GDNF在颗粒细胞上的表达。

20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用

目的:研究20(S)-原人参二醇(PPD)对人胚肾293细胞(HEK-293细胞)生长抑制作用。方法:采用台盼蓝染色和噻唑蓝(MTT)法观察PPD对HEK-293细胞增殖的抑制作用,同时通过Hoechst33258染色和DNA Ladder方法测定PPD对HEK-293细胞凋亡影响。结果:PPD可明显降低HEK-293细胞存活率和细胞活性,半数抑制浓度(IC50)为21.8μmol/L。PPD处理后HEK-293细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,琼脂糖电泳呈现明显的DNALadder条带。结论:PPD对HEK-293细胞生长有明显的抑制作用并有剂量依赖关系。

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。方法:将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Coγ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。

肾气虚型体外受精-胚胎移植患者卵巢颗粒细胞基因表达研究

目的:利用基因组学技术观察肾气虚证不孕患者与正常女性卵巢颗粒细胞的差异基因,进一步筛选差异基因并行基因功能分析,以期找到中医理论在不孕方面的科学依据。方法:选取肾气虚证的行体外受精-胚胎移植(IVFET)的不孕患者33例作为肾气虚组,选取33例因男方因素行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI-ET)的正常女性作为正常对照组。所有患者均在取卵日提取成熟卵泡颗粒细胞RNA,运用高通量测序技术分析,研究肾气虚组与正常对照组的基因表达的差异。结果:1肾气虚组和正常对照组间的卵巢颗粒细胞存在差异表达基因。2差异表达因共395条,其中,肾气虚组比正常对照组表达水平上调的有304条,表达水平下调的有91条。涉及细胞凋亡、信号转导、炎症反应,生物合成,免疫调节应答等39个生物学途径,其中涉及细胞凋亡的基因BCL2L12,BCL2L12P1,BCL2L13,BAX,P53AIP1有明显变化。结论:1基因高通量测序技术是研究肾气虚证不孕相关基因的一种理想的技术方法。2开展肾气虚证不孕患者与正常女性基因表达谱的比较研究,可以为中医学经典理论提供现代基因分子水平层次的科学依据。

人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

目的探讨人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控。方法通过Polysome profiling结合Western blot实验检测并验证HEK293细胞中mRNA的翻译活性;通过针对RPL10A和RPS17两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀、建库测序(RIP-seq)及生物信息学分析,获得参与HEK293细胞蛋白质合成调控的相关分子。结果在两种核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀实验富集的分子中共有129种基因,其中93.8%为蛋白质编码基因;且功能与RNA剪接、分解代谢、MAPK信号通路、染色体定位、RNA转运等相关。结论通过针对核糖体蛋白的RNA免疫共沉淀可以获得HEK293细胞中活跃翻译的mRNA。

补肾调经方对输卵管性不孕症患者体外受精—胚胎移植超排卵周期GDF-9的影响

目的研究补肾调经方对提高体外受精—胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer,IVF-ET)超排卵周期所获卵和胚胎质量的作用及其机制。方法将58例因输卵管性不孕行IVF-ET患者随机分为中药+控制性超排卵组(治疗组,30例)和单纯控制性超排卵组(对照组,28例)。应用Western blot法测定取卵日成熟卵泡卵泡液中生长分化因子-9(growth differentiation factor-9,GDF-9)的含量;用RT-PCR法检测颗粒细胞中GDF-9的表达;并比较两组的促性腺激素(gonadotropin,Gn)用药量、获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率及妊娠率等。结果治疗组卵泡液中GDF-9水平及颗粒细胞中GDF-9的表达均显著高于对照组(P<0.05);治疗组的获卵数、受精率、优质胚胎率及妊娠率均显著高于对照组(P<0.05);Gn用量及卵裂率两组比较差异无统计学意义。结论补肾调经方可以提高IVF-ET妊娠率,其作用机制可能与调控卵泡液和颗粒细胞GDF-9水平有关。

基因治疗原发性高血压的新途径:内皮型一氧化氮合成酶CDNA腺病毒载体在人胎肾293细胞的表达

研究内皮型一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase,eNOS)CDNA 腺病毒载体 PadRSVeNOSCDNA 导入在人胎肾 293细胞 ( )中的表达。方法:大量制备及纯化质粒 eNOSCDNA ,将纯化eNOSCDNA 载体通过脂质体转染 293细胞48h 后,应用化学比色法测定293细胞提取物NOS 活性。结果:被转染 293细胞 NOS活性显著提高于未转染293细胞 NOS 活性犤( 0.62±0.03),(0.093±0.01)kU /L,P <0.001犦。结论:PA dRSVeNOSCDNA 导入人胎肾 293细胞是一种能使 NOS 活性显著升高的方法,为基因治疗原发性高血压及肾脏血管性疾病研究提供一条新的途径。

构建hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌细胞增殖影响的实验研究

目的通过体外实验研究观察稳定转染hTNF-α/293基因细胞对人结肠癌(LOVO)细胞生长增殖影响。方法采用RT-PCR和ELISA检测稳定转染hTNF-α/293基因细胞和Hek-293细胞mRNA和蛋白表达水平。观察体外培养中,hTNF-α/293基因细胞与LOVO细胞共同培养,于不同的时间点,采用噻唑蓝MTT法检测LOVO肿瘤细胞增殖的活性。结果重组质粒转染Hek-293细胞后,Western blot检测到了hTNFα蛋白体外表达,检测表明hTNFα/293细胞组和hTNFα阳性组对共培养的LOVO细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示稳定转染hTNF-α/293对LOVO细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。由于TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外。

AGM区基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化的实验研究

目的探讨主动脉-性腺-中肾(AGM)区来源的基质细胞诱导胚胎干细胞(ESC)向成血-血管干细胞分化的促进作用。方法从孕11 d的小鼠胚胎AGM区分离、培养基质细胞,鉴定后用作支持细胞,与小鼠胚胎干细胞共同培养,通过原始细胞集落(BL-CFC)的形成情况及流式细胞仪检测CD34+/Flt-1+细胞比例,评价AGM区基质细胞对小鼠ESC-D3细胞系向成血-血管干细胞的定向诱导作用。结果在AGM区基质细胞的支持下,由ESC来源的CD34+细胞由(12.71±1.76)%增加到(39.71±3.76)%,并且CD34+/Flt-1+细胞比例明显提高,达到(26.59±1.77)%;同时由ESC来源的代表成血-血管干细胞的BL-CFC集落增加了3倍。结论AGM区基质细胞可促进胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化,探明其机制对研究造血及血管发育机制有积极意义。

成纤维细胞生长因子-2在肾脏疾病中的作用

成纤维细胞生长因子 2 (fibroblastgrowthfactor 2 ,FGF 2 )参与多种脏器的胚胎发育 ,具有致有丝分裂作用、促增殖和分化作用。近年来 ,关于FGF 2在各种肾脏疾病发病机制方面的研究逐步深入与明了。研究证明 ,FGF 2参与足细胞损伤、启动球囊黏连、导致肾小球硬化 ;参与肾小管上皮细胞损伤 ,介导肾小管上皮间质转分化 。

补肾中药对肾虚不孕患者卵巢颗粒细胞基因表达干预的研究

目的:运用基因高通量测序技术,研究补肾中药二至天癸颗粒治疗肾虚不孕患者,与安慰剂组比较用药后患者卵巢颗粒细胞基因表达的差异,研究补肾中药二至天癸颗粒对肾虚不孕患者卵巢颗粒细胞基因表达的影响,在基因水平上探讨二至天癸颗粒对肾虚不孕患者产生疗效的作用机制。方法:1选取临床上接受IVF-ET治疗的肾虚不孕患者66例,按照随机数字表法分成治疗组33例,对照组33例。2两组均在IVF治疗前两个周期及治疗当周期服用药物,治疗组服用二至天癸颗粒,对照组服用安慰剂颗粒;两组均采用目前IVF治疗中常规应用的控制性超排卵方案长方案,在取卵日收集废弃的卵巢颗粒细胞并提取RNA。运用基因高通量测序技术Hiseq 2000分析,比较治疗组与对照组的基因表达的差异。3结合bowtie2软件分析,并使用检索互联网生物学公共数据库提供的检索程序对差异表达基因进行分析,最后对差异表达基因进行GO注释,并利用KEGG作pathway析。结果:1治疗组与对照组患者的卵巢颗粒细胞存在表达差异基因,获得表达差异基因共422条(P<0.05)。其中,治疗组较对照组表达水平上调(FC>2)的有103条,表达水平下(FC<0.5)的有319条。2将差异表达基因按功能分析进行大体分类,涉及细胞凋亡、生物合成等方面。结论:1基因高通量测序技术是研究中药对人体作用的一种理想的技术方法。2补肾中药可以影响肾虚不孕患者的基因表达,这为补肾中药改善生殖功能作用的机制提供基因水平上的理论依据。

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法:将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL和EB/AGM+FL+BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论:①EB/AGM+FL组和EB/AGM+FL+BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞明显升高(P<0.05)。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P<0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM+FL和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。

按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究

为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞(HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+FL组,③AGM+FL+BM组,④照射对照组,⑤正常对照组。观察各组生存率、造血重建和植入状况。结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)%;NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成;AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8%、66.7%,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因。结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血。

脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞

目的建立一种研究离子通道的有效模型。方法采用Lipofacta mine2000脂质体将人的超极化激活的环核苷酸门控(HCN)基因转染人胚胎肾(HEK)293细胞,利用全细胞膜片钳技术检测克隆人HCN2基因的表达。结果pcDNA3-hHCN2真核表达载体转染HEK293细胞3d后,全细胞膜片钳技术记录到克隆人HCN2基因编码的通道电流。结论全细胞膜片钳技术稳定、可靠,可为开展克隆离子通道结构和功能关系研究提供基础。

含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用

为探讨人主动脉一性腺一中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎干细胞(em bryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Transw ell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM+FL诱导和AGM+BM诱导共6组。分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-K it+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析。结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+c-K it+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.01);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组最佳(p<0.01)。结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用。

人AGM区及胎肝基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向造血干细胞分化和体内造血重建

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)经人主动脉-性腺-中肾(AGM)区及胎肝(FL)基质细胞程序诱导后,向造血干细胞(HSCs)分化的效率及其造血功能。方法:将E14 ESCs诱导为拟胚体(EB),并在人AGM区及FL基质细胞饲养层上进一步诱导分化,培养6 d后收集细胞检测Sca-1+c-Kit+细胞含量、分析造血细胞集落形成能力及致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植经致死量[60Co]γ射线辐照的BALB/c雌鼠,观察生存率、植入状况和造血重建。结果:(1)EB来源细胞经人AGM区及FL基质细胞程序诱导后Sca-1+c-Kit+细胞含量为(21.96±2.54)%,造血集落总数为(520±52)/105cells,明显优于诱导前及人AGM区基质细胞初步诱导者(P<0.05)。(2)NOD-SCID小鼠接种经人AGM区及FL基质细胞诱导的ESCs未见畸胎瘤。(3)BALB/c雌鼠移植经人AGM区及FL基质细胞诱导的EB来源细胞后生存率77.8%,14 d外周血细胞计数明显改善,存活受鼠均检测到供体来源sry基因,而移植人AGM区基质细胞诱导的EB细胞者15 d内全部死亡。结论:人AGM区及FL基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs,有效重建体内造血功能。

体外培养APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响

背景:积极探索结肠癌相关基因及抑癌基因已成为新的研究热点,人肿瘤坏死因子α是一个重要的促炎因子和免疫调节因子,对肿瘤的免疫治疗具有一定的疗效。目的:观察体外培养海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响。方法:采用前期建立的制备方法,用APA微囊分别包裹人肿瘤坏死因子α/293细胞,APA微囊化0/293细胞。取对数生长期结肠癌(Lovo)细胞,配制成所需浓度的细胞悬液,接种24孔板培养,分别加入低、中、高剂量稳定转染的APA微囊化肿瘤坏死因子α/293,即分为5个实验组,APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞低剂量组、中剂量组、高剂量组、阴性组为APA微囊化0/293细胞组,阳性组加入肿瘤坏死因子α,MTT法检测490nm吸光度;通过对人肿瘤细胞增殖抑制实验,观察对结肠癌细胞(Lovo)增殖的抑制作用。结果与结论:体外培养中,加入APA微囊化0/293细胞组对结肠癌细胞增殖无抑制作用;而APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞中、高剂量组和阳性组,在24,48,72h的A值低于APA微囊化0/293细胞组(P<0.05),提示APA微囊化人肿瘤坏死因子α/293细胞所分泌肿瘤坏死因子α对结肠癌细胞有增殖抑制效应,均呈现出良好的数量依赖关系。